杜仲葉水提液除雜工藝的優(yōu)化

王柏強， 劉 福*， 何效平， 曾芝蘭， 江承平（.川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院藥劑科，四川南充637000；2.川北醫(yī)學院藥學院，四川南充637000）

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杜仲葉水提液除雜工藝的優(yōu)化

王柏強1，2， 劉 福1，2*， 何效平1， 曾芝蘭1， 江承平1，2
（1.川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院藥劑科，四川南充637000；2.川北醫(yī)學院藥學院，四川南充637000）

目的 優(yōu)選杜仲葉水提液的除雜工藝。方法 采用高速離心法、醇沉法、殼聚糖絮凝沉淀法、ZTC絮凝沉淀法、殼聚糖絮凝澄清-高速離心法、ZTC絮凝澄清-高速離心法對杜仲葉水提液進行澄清處理，篩選出適宜的澄清方法。以綠原酸保留率、鞣質(zhì)和蛋白質(zhì)去除率以及藥液澄明度為評價指標，在單因素試驗基礎上，應用正交試驗設計優(yōu)化澄清工藝。結(jié)果 最佳澄清方法是殼聚糖絮凝澄清-高速離心法，該方法處理后提取液有效成分保留率為89.5%，蛋白質(zhì)和鞣質(zhì)去除率為分別為54.4%和57.5%，澄明度和穩(wěn)定性良好。結(jié)論 殼聚糖絮凝澄清-高速離心法可作為杜仲葉水提取液的最佳澄清工藝，其穩(wěn)定可行，而且有效成分損失少。

杜仲；葉；水提液；除雜；單因素試驗；正交試驗

杜仲平壓片收載于原衛(wèi)生部頒藥品標準 《中藥成方制劑》（第11冊），為杜仲Eucommia folium葉經(jīng)提取純化后加工制成的片劑［1］，用于治療高血壓、頭暈目眩、腰膝酸痛、筋骨痿軟等癥。原生產(chǎn)工藝中采用水提醇沉法除雜［2］，雖能去除部分蛋白質(zhì)，但對鞣質(zhì)效果較差，而且需要耗費大量乙醇，成本較高，周期長。為了降低生產(chǎn)成本，提高產(chǎn)品質(zhì)量，本實驗以杜仲葉水提液為研究對象，以綠原酸保留率、鞣質(zhì)和蛋白質(zhì)去除率以及藥液澄明度為評價指標，在單因素試驗基礎上，應用正交試驗設計優(yōu)選最佳除雜工藝。

1　儀器與試藥

1.1儀器 10A高效液相色譜儀、SPD-10A紫外檢測器（日本島津公司）；Hypersic C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；TG16-WS高速離心機 （湘儀離心機有限公司）；HI303磁力攪拌器 （匯爾儀器設備有限公司）；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 （上海亞榮生化儀器廠）。

1.2試藥 杜仲葉由重慶醫(yī)藥公司提供，經(jīng)川北醫(yī)學院藥學院李生茂講師鑒定為杜仲科植物杜仲Eucommia uimoides O1iv.的干燥葉。綠原酸對照品 （中國食品藥品檢定研究院，批號0753-200413）；殼聚糖 （上海華凱科技貿(mào)易公司）；ZTC1+1（天津振天成科技有限公司）。乙腈為色譜純；其他試劑均為分析純。

2　方法與結(jié)果

2.1澄清工藝考察 以綠原酸保留率、鞣質(zhì)和蛋白質(zhì)去除率以及藥液澄明度為評價指標，采用高速離心法、醇沉法、殼聚糖絮凝沉淀法、ZTC絮凝沉淀法、殼聚糖絮凝澄清-高速離心、ZTC絮凝澄清-高速離心法對杜仲葉水提液進行澄清工藝研究。首先對各方法進行單因素考察，然后在各法最優(yōu)條件下進行澄清處理，以篩選出最佳除雜方法。

2.1.1提取液制備 按處方稱取6個處方量杜仲葉，加水煎煮3次，第1次加10倍量水煎煮1 h，剩下2次加8倍量水煎煮45 min，濾過，合并濾液，減壓濃縮，均分成6份，備用。

2.1.2高速離心法 取 “2.1.1”項下提取液一份，置于10 000 r/min離心機中離心20 min，取上層清液，加水定容。

2.1.3醇沉法 取 “2.1.1”項下提取液一份，加5倍量乙醇攪拌，靜置過夜，濾過，濾液濃縮至無醇味，加水定容。

2.1.4殼聚糖絮凝沉淀法［3-5］稱取殼聚糖粉末1 g，加入1%醋酸溶液100 mL，攪拌后靜置24 h，即得1%殼聚糖溶液。取 “2.1.1”項下提取液一份，調(diào)節(jié)pH值至5，加熱恒溫至60℃，按0.3 g/L用量加入1%殼聚糖溶液，于100 r/min轉(zhuǎn)速下攪拌5min，靜置，濾過，定容。

2.1.5ZTC絮凝沉淀法 配制澄清劑溶液［6］。方法為稱取ZTC澄清劑A組份1.0 g，加少量純化水攪成糊狀，再加純化水至100 mL，溶脹24 h，攪拌后脫脂棉過濾，即得1%黏膠液。按相同方法，將B組份用1%醋酸溶液配制成1%黏膠液。

取 “2.1.1”項下提取液一份，加熱恒溫至60℃，按1.0 g/L用量加入B組份，攪勻，再按0.5 g/L用量加入A組份，在100 r/min轉(zhuǎn)速下攪拌5 min，靜置，濾過，定容。

2.1.6 殼聚糖絮凝澄清-高速離心法 取“2.1.1”項下提取液一份，調(diào)節(jié)pH值至5，加熱恒溫至60℃，按0.3 g/L用量加入1%殼聚糖溶液，于100 r/min轉(zhuǎn)速下攪拌5 min，靜置，然后于10 000 r/min離心機中離心20 min，取上清液，加水定容。

2.1.7ZTC絮凝澄清-高速離心法 取“2.1.1”項下提取液一份，加熱恒溫至60℃，按1.0 g/L用量加入ZTC1+1絮凝劑B組份，攪勻，再按0.5 g/L用量加入ZTC1+1絮凝劑A組份，在100 r/min轉(zhuǎn)速下攪拌5 min，靜置，然后于10 000 r/min離心機中離心20 min，取上清液，加水定容。

2.2綠原酸含有量的測定［7］

2.2.1色譜條件 Hypersic C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相為乙腈-0.4%磷酸水溶液 （13∶87）；體積流量1.0 mL/min；檢測波長327 nm；柱溫25℃。

2.2.2對照品溶液的制備 精密稱取干燥至恒重的綠原酸對照品10 mg，50%甲醇溶解并定容至50 mL棕色量瓶中，即得0.2mg/mL對照品溶液。

2.2.3供試品溶液的制備 精密量取原藥液和6種方法制得的樣品各0.5 m L，置于10 mL量瓶中，50%甲醇定容，搖勻，0.45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4線性關系考察 精密量取綠原酸對照品溶液0.1、1、5、8、10 mL，置于10 mL量瓶中，50%甲醇稀釋并定容至刻度，搖勻，0.45μm微孔濾膜濾過，在 “2.2.1”項色譜條件下進樣測定。以峰面積為縱坐標 （y），溶液質(zhì)量濃度為橫坐標 （c）進行線性回歸，得回歸方程y= 31 820c+10 791（r=0.999 9），表明綠原酸在 2. 0～200μg/mL范圍內(nèi)線性關系良好。

2.2.5樣品含有量測定 精密吸取對照品與供試品溶液各20μL，注入液相色譜儀，記錄峰面積，計算綠原酸的含有量。綠原酸保留率=（除雜后藥液中綠原酸含有量/提取液中綠原酸含有量）×100%。

2.3鞣質(zhì)含有量的測定［8-10］采用以磷鉬鎢酸為顯色劑，干酪素為鞣質(zhì)吸附劑，沒食子酸為對照品的磷鉬鎢酸比色法。在堿性條件下加入磷鉬鎢酸，采用紫外分光光度法于760 nm波長處分別測定樣品溶液中總多酚和不被吸附多酚的含有量，計算樣品中鞣質(zhì)的含有量。鞣質(zhì)去除率=［（1-除雜后藥液中鞣質(zhì)含有量 /提取液中鞣質(zhì)含有量）］×100%。

2.4蛋白質(zhì)含有量的測定［11-12］采用靈敏度高的Bradford法，以考馬斯亮蘭G-250染料在酸性溶液中與蛋白質(zhì)結(jié)合后，于595 nm波長處測定樣品的吸光度值，計算樣品中蛋白質(zhì)的含有量。蛋白質(zhì)去除率=（1-除雜后藥液中蛋白質(zhì)含有量/提取液中蛋白質(zhì)含有量）×100%。

2.5篩選結(jié)果 采用綜合評分法［13-14］，選擇綠原酸保留率、鞣質(zhì)和蛋白質(zhì)去除率以及藥液澄明度作為評價指標，權重系數(shù)分別為0.5、0.2、0.2、0.1。澄清度評分標準為混濁1分，較澄清2分，澄清3分，綜合評分=綠原酸保留率×50+鞣質(zhì)去除率×20+蛋白質(zhì)去除率×20+（澄清度得分/最澄清得分） ×10。結(jié)果見表1。由表可知，澄清效果依次為殼聚糖絮凝澄清-高速離心法＞ZTC絮凝澄清-高速離心法＞殼聚糖絮凝沉淀法＞ZTC絮凝沉淀法＞醇沉法＞高速離心法。因此，本實驗選擇殼聚糖絮凝澄清-高速離心法作為杜仲葉水提液的澄清除雜工藝。

表1　澄清方法的篩選結(jié)果 （±s）

表1　澄清方法的篩選結(jié)果 （±s）

澄明度得分　　綜合評分高速離心法方法　　綠原酸保留率/%　　鞣質(zhì)去除率/%　　蛋白質(zhì)去除率/% 87.4±0.26　45.2±0.44　48.6±0.42　3　72.5 92.7±0.47　15.3±0.29　14.8±0.17　2　59.0醇沉法　82.6±0.40　24.9±0.45　43.1±0.51　2　61.6殼聚糖絮凝沉淀法　90.4±0.48　43.9±0.32　48.4±0.37　2　70.3 ZTC絮凝沉淀法　88.5±0.39　42.5±0.29　44.7±0.54　2　68.4殼聚糖絮凝澄清-高速離心法　89.2±0.36　47.9±0.31　51.4±0.46　3　74.5 ZTC絮凝澄清-高速離心法

2.6殼聚糖絮凝澄清-高速離心工藝的優(yōu)化 在單因素考察的基礎上，選擇殼聚糖用量、藥液比、藥液溫度、攪拌時間、攪拌速度、藥液pH值及離心轉(zhuǎn)速7個因素，以綠原酸保留率、鞣質(zhì)和蛋白質(zhì)去除率以及藥液澄明度為評價指標，采用L18（37）正交表設計方案。因素水平和結(jié)果見表2～3，方差分析見表4。

表3顯示，各因素影響程度依次為A＞B＞F＞E＞G＞C＞D。由表4可知，因素 A、B、E、F具有顯著性差異（P＜0.05），而C、D、G差異無統(tǒng)計學意義 （P＞0.05）。最終確定，最佳工藝條件為A3B2C2D3E2F2G3，即殼聚糖用量0.4 g/L，藥液比1∶2，藥液溫度60℃，攪拌時間6 min，攪拌速度100 r/m in，藥液 pH 5.0，離心轉(zhuǎn)速10 000 r/min。

2.7驗證實驗 按最佳澄清工藝條件進行6次驗證實驗，結(jié)果見表5。由表可知，測得值與優(yōu)化實驗結(jié)果相近，說明殼聚糖絮凝澄清-高速離心法合理可行，穩(wěn)定可靠。

表2　因素水平

表3　正交試驗結(jié)果

表4　方差分析

表5　驗證實驗結(jié)果（n=6）

3　討論

中藥成分復雜，提取液中往往含有大量樹脂狀膠體物、鞣質(zhì)、纖維素、淀粉、蛋白質(zhì)等無活性的雜質(zhì)成分。藥材制成膠囊、片劑、顆粒劑等制劑時，因提取浸膏固形物多，劑量大，故服用不便。杜仲平壓片以綠原酸含有量為其質(zhì)量評價標準，因此在對杜仲葉水提取液進一步純化時，選擇綠原酸保留率、鞣質(zhì)去除率、蛋白質(zhì)去除率、澄明度等作為評價指標，并進行綜合評分，可用于評價澄清除雜工藝的優(yōu)劣。

在篩選純化方法時發(fā)現(xiàn)，醇沉法除雜后，浸膏得率較低，但有效成分損失較大，藥液中雜質(zhì)沉淀速度慢，費時，澄清液乳光嚴重，鞣質(zhì)去除率低；高速離心法有效成分保留率相對較高，浸膏得率最大，但除雜效果不理想，澄清液長時間放置易產(chǎn)生沉淀；殼聚糖絮凝澄清-高速離心法與ZTC絮凝澄清-高速離心法處理后的樣品在浸膏得率上無顯著性差異，但前者較大程度上保留了藥液中的有效成分，對鞣質(zhì)及蛋白質(zhì)的去除效果明顯，藥液澄明度好，澄清劑用量小，達到了精制中藥提取液的要求，而且成本低，操作簡便。因此，本實驗選擇該方法進行杜仲葉水提液的除雜工藝研究。

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1001-1528（2016）06-1418-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2016.06.048

2015-05-13

王柏強 （1979—），男，碩士，主管藥師，研究方向為藥物制劑。Te1：（0817）2262244，E-mai1：31618187@qq.com

劉 福 （1965—），男，主任藥師，碩士生導師，研究方向為醫(yī)院藥學。Te1：（0817）2262246，E-mai1：nc1f91@163.com