新型超順磁性氧化鐵標記SD大鼠脂肪干細胞的有效性及安全性研究

馬偉瓊， 謝琦， 張鼎旋， 湯間儀， 雷正賢， 楊逸銘

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·實驗研究·

新型超順磁性氧化鐵標記SD大鼠脂肪干細胞的有效性及安全性研究

馬偉瓊， 謝琦， 張鼎旋， 湯間儀， 雷正賢， 楊逸銘

目的：采用新型超順磁性氧化鐵對SD大鼠來源的脂肪干細胞(ADSCs)進行標記，并與既往商用SPIO標記效果進行對比，探討這種新型超順磁性氧化鐵標記的有效性及安全性。方法：分離、純化、鑒定SD大鼠來源的ADSCs，然后分不同濃度組(0、6、12、25、50和100 μg/mL)和時間組(6、12、24和48 h)進行標記，通過普魯士藍染色測定鐵標記率；在不影響細胞形態(tài)的前提下，對達到95%以上鐵染色率的孵育濃度、時間進行標記安全性檢測，包括活力、增殖力、細胞表面抗原表達；采用透射電子顯微鏡觀察標記細胞的超微結(jié)構，采用ICP-AES對標記細胞內(nèi)的鐵含量進行測定，并與商用SPIO標記效果進行對比。結(jié)果：在無細胞毒性的前提下，新型SPIO達到95%以上鐵染色率的孵育濃度是12和25 μg/mL，孵育時間是12 h；ICP-AES檢測顯示具有表面正電荷的聚乙二醇(PEG)/聚乙烯亞胺(PEI)修飾的SPIO標記后細胞內(nèi)的鐵含量達到35.4 pg/cell(25 μg/mL中孵育12h后)和20.16 pg/cell(12 μg/mL中孵育12h后)，并隨著孵育濃度的增加，細胞內(nèi)的鐵含量增加；而具有表面零電荷的PEG/聚乙烯吡咯烷酮(PVP)修飾的SPIO標記后的鐵含量僅為6.96 pg/cell(25 μg/mL中孵育12h后)；透射電子顯微鏡顯示標記后細胞器結(jié)構完整，內(nèi)吸收的SPIO主要位于細胞質(zhì)內(nèi)的囊泡和溶酶體中。結(jié)論：新型SPIO在適當孵育濃度和時間下可以安全、快速標記ADSCs； PEG/PEI修飾的SPIO標記效果要遠遠比既往商用的SPIO快速有效，可作為一種優(yōu)勢的新型磁性標記物用于干細胞標記；而PEG/PVP修飾的SPIO比起既往商用的SPIO并無明顯優(yōu)勢，說明表面電荷在細胞標記中占有極其重要的角色。

新型超順磁性氧化鐵； 脂肪干細胞； 染色與標記； 鐵含量； 表面電荷

由于磁性氧化鐵納米材料具有良好的磁導向性、生物相容性以及生物降解性等特點，因而被廣泛用于干細胞標記領域[1-2]。目前干細胞示蹤成像的磁性氧化鐵納米材料主要采用商用的Resovist、Feridex等，但它們都是由化學共沉淀方法制備的，普遍存在粒徑不均勻、容易團聚的缺點，性能有提升的空間[3]。此外，由于細胞膜和商用的超順磁性氧化鐵納米粒子(superparamagnetic iron oxide，SPIO)均為負電荷,必須與帶有正電荷的商用轉(zhuǎn)染劑(eg、脂質(zhì)體、多聚賴氨酸、硫酸魚精蛋白等)結(jié)合起來才能有效標記干細胞，這種結(jié)合存在復雜的相互反應[4，5]，會導致表面性能的不精確和大小的不完全一致，這勢必會引起標記效果的差異性。

本研究擬采用的聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)/聚乙烯亞胺(polyethylenimine，PEI)修飾SPIO是以高溫多元醇法合成的，在合成過程中就通過表面涂層修飾對納米粒子的表面性能進行了精細控制，具有結(jié)晶度高、尺寸分布均勻、磁性強、生物相容性好的特點，并且具有固定的表面正電荷[6]。筆者猜測這種具有固有表面正電荷的新型SPIO也許能更有效地應用于干細胞標記領域，本研究將其對SD大鼠來源的脂肪干細胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)進行標記，并與既往商用SPIO標記效果進行對比，探討這種新型超順磁性氧化鐵標記的有效性及安全性。本研究實驗組還引入用相同方法合成的帶表面固定零電荷的PEG/聚乙烯吡咯烷酮(polyvinyl pyrrolidone，PVP)修飾的SPIO進行對照標記，以探索表面電荷在標記有效性中的作用。

實驗方法

1.SD大鼠ADSCs的提取、純化、鑒定

取4周齡以內(nèi)的SD大鼠(購自廣東省醫(yī)學實驗動物中心)，無菌條件下取腹股溝處的脂肪組織，反復沖洗，剪碎成大約1 mm3的細小組織塊；加入I型膠原酶(Sigma公司)進行恒溫振蕩消化，中止消化后進行離心，種植在含10%胎牛血清(Gibco公司)的DMEM/F12(Hyclone公司)培養(yǎng)瓶中，標記為原代細胞(P0)，以1：2的比例傳代，純化提取出ADSCs，傳代到P3代備用。

取P3代的培養(yǎng)細胞，用FACScan 流式細胞儀(美國 BD FASCantoTM)進行表面抗原CD29、CD45、CD44 、CD106(Biolegend公司)的檢測。

2.新型SPIO標記后ADSCs形態(tài)的觀察和有效孵育時間、濃度的初步選定

SPIO由桂林理工大學張寶林教授團隊以PEG作為溶劑，以乙酰丙酮合鐵為鐵源，加入PEI、PVP作為表面涂層修飾劑制成氧化鐵納米粒子水溶液[6]。

取6孔板，細胞鋪板，設置不同濃度(0、6、12、25、50和100 μg/mL)和不同時間(6、12、24和48 h)組孵育，然后進行普魯士藍染色，倒置顯微鏡下觀察標記細胞的形態(tài)，隨機選擇視野計數(shù)100個細胞，其中含藍色顆粒的細胞為標記陽性細胞，計算標記陽性率，分別計數(shù)3次取平均值，初步選定達到95%以上的標記率且細胞形態(tài)無明顯改變的孵育濃度和時間。

3.標記細胞的安全性檢測

細胞活力：將未標記組和標記組的單細胞懸液與0.4%臺盼藍溶液以1:1比例混勻，3 min內(nèi)用計數(shù)板計數(shù)后計算活細胞率(%)。

細胞增殖力：將未標記組和標記組的細胞分別在1、3、5 d進行MTT試驗。實驗時，每孔吸去20 μL培養(yǎng)液，加入MTT 20 μL，同上條件繼續(xù)孵育4 h后棄上清，加入DMSO 150 μL/孔，室溫下于圓周震蕩器震蕩10 min，酶標儀選用雙波長(570、630 nm)測量各孔的光密度(optical density，OD)值，每孔重復測3次，減去空白孔后取均值，繪制出生長曲線。

細胞表面抗原表達：將未標記組和標記組的細胞加入熒光標記的大鼠來源CD29、CD45、CD44 、CD106抗體，進行細胞表面抗原表達的檢測。

4.透射電子顯微鏡(transmission electron microscopy，TEM )觀察

將標記后的細胞用2.5%戊二醛(預冷)4 ℃固定6 h，然后用1%鋨酸固定2.5 h，梯度乙醇脫水，滲透、包埋、聚合，常規(guī)超薄切片(70 nm)，用鉛鈾染色2 h，使用透射電子顯微鏡(日本 JEM1230)觀察細胞超微結(jié)構，包括SPIO所在部位以及線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體等細胞器的完整性。

5.電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法(inductively coupled plasma-atomic emission spectrometry，ICP-AES)檢測標記細胞內(nèi)的鐵含量

將標記后一定數(shù)量(106)的細胞放置在15 mL玻璃管內(nèi)，在每個樣品中加入65%～68%的濃硝酸，保持121℃高溫高壓反應，使樣本充分溶解呈溶液。設立標準樣品分別為:空白、0.1、1、10、50、100(PPm)，進行ICP-AES定量檢測。根據(jù)其定量結(jié)果得出標準曲線，計算出單細胞鐵含量。

6.統(tǒng)計學分析

采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學分析，標記組和未標記組的臺盼藍拒染率、MTT吸光度差異的比較采用單因素方差分析，數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布的相關性分析采用Pearson相關檢驗，數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布的相關性分析采用Spearman相關檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

表1　不同濃度PEG/PEI修飾的SPIO孵育不同時間點ADSCs的形態(tài)變化和鐵標記率測定

結(jié)　果

1.SD大鼠來源ADSCs的提取、純化和鑒定

ADSCs呈多角形、紡錘形、梭形貼壁生長，HE染色顯示細胞核位于細胞中間，細胞梭形突起相互連接，呈融合生長(圖1)。

流式細胞儀檢測顯示P3代ADSCs對CD29的表達為強陽性，達到95%以上；對CD44的表達為陽性，為30%～40%；對CD106、CD45表達為陰性，表達小于5%(圖2)。

2.ADSCs的有效孵育時間、濃度的觀察和初步選定

細胞內(nèi)鐵標記率隨著濃度和孵育時間的增加而增加，同時，細胞的形態(tài)學也隨著孵育濃度與時間的增加而改變，細胞逐漸出現(xiàn)變形、皺縮、胞膜溶解的現(xiàn)象(表1、2、圖3)。

PEG/PEI修飾SPIO標記組在12 μg/mL、25 μg/mL濃度下孵育12 h后即可得到95%以上的標記率，細胞形態(tài)無明顯改變(表1、圖3a、b)。而PEG/PVP修飾SPIO標記組在25 μg/mL、50 μg/mL濃度下孵育12 h后即可得到95%以上的標記率，細胞形態(tài)無明顯改變(表2、圖3)，并且發(fā)現(xiàn)PEG/PVP修飾SPIO標記組隨著標記濃度的增加，細胞內(nèi)鐵顆粒增加并不明顯，只積聚在細胞質(zhì)邊緣靠近胞膜的區(qū)域。

3.標記安全性檢測 (有效標記濃度和時間，細胞形態(tài)無改變的前提下)

臺盼藍染色：臺盼藍染色結(jié)果顯示，25 μg/mL標記組2孵育48 h，50 μg/mL標記組2孵育12、24和48 h后，ADSCs的活力較未標記細胞組下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，其余各組與未標記組比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05，表3)。

增殖力檢測：增殖力曲線趨勢圖顯示，12 μg/mL、25 μg/mL PEG/PEI修飾的SPIO標記組孵育12 h后，25 μg/mL PEG/PVP修飾的SPIO孵育12 h后，增殖力曲線與未標記組生長趨勢無明顯差異，其余標記組增殖力曲線下降(圖4)。

經(jīng)過標記率、細胞活力和增殖力的檢測，選擇PEG/PEI修飾的SPIO孵育濃度為12 μg/mL、25 μg/mL，PEG/PVP修飾的SPIO孵育濃度為25 μg/mL，孵育時間均為12 h；細胞表面抗原表達檢測、電鏡觀察均選擇該孵育濃度和時間。

細胞表面抗原表達鑒定：流式細胞儀檢測顯示標記后的ADSCs對CD29的表達為強陽性，達到95%以上；對CD44的表達為陽性，為30%～40%；對CD106、CD45表達為陰性，表達均<5%，與未標記組之間差異無統(tǒng)計學意義(圖2b)。

注：標記組1是PEG/PEI修飾的SPIO標記組；標記組2是PEG/PVP標記組。P值為各標記組與未標記組的比較結(jié)果。

4.TEM觀察

SPIO標記后，內(nèi)吸收的氧化鐵納米顆粒均位于細胞質(zhì)區(qū)域內(nèi)，主要位于溶酶體內(nèi)，呈囊泡樣聚集改變，細胞核內(nèi)未見納米顆粒。PEG/PEI修飾的SPIO標記細胞組內(nèi)沉積的囊泡數(shù)量要比PEG/PVP修飾的SPIO多，幾乎蔓延了整個細胞質(zhì)區(qū)域，而后者主要聚集于靠近細胞膜的區(qū)域(圖5)；從電鏡圖片來看，胞核不規(guī)則，染色質(zhì)較均勻，細胞器結(jié)構基本完整，內(nèi)吸收的納米顆粒對細胞形態(tài)、結(jié)構無明顯影響。

5.SPIO的性能特性

將既往商用SPIO的材料性能特性與本研究中的新型SPIO進行對比，結(jié)果見表4。

表4　多醇法合成的SPIO和既往商用的SPIO性能特性對比

討　論

1.多醇法合成的SPIO的性能評價

PEG由于其較高的水溶性，并且無抗原性和免疫原性而可作為高溫多元醇法中的溶劑使用，在合成的SPIO表面進行PEG涂層修飾，不僅能提高SPIO在水中的溶解性，而且能讓納米粒子在溶液中穩(wěn)定分散[7]。PEI是一種含有大量氨基的陽離子聚合物，它一方面能夠有效地中和膠體液中過量的負電荷，尤其是在酸性或者中性環(huán)境下；另一方面其包含的多量氨基能夠與不同的物質(zhì)相結(jié)合，從而使得合成的SPIO結(jié)構更加穩(wěn)定，生物相容性和弛豫率亦有所提高[8]。PVP是一種兩親性聚合物，Lu等[9]的研究中發(fā)現(xiàn)這種以PVP為涂層的氧化鐵納米粒子溶解性和穩(wěn)定性更高，在不同的有機溶劑和不同PH值的水溶液中(包括PBS液)中穩(wěn)定分散。

而本研究中的新型SPIO是以PEG作為溶劑，以乙酰丙酮合鐵(Fe(acac)3)為鐵源，加入PEI、PVP作為表面涂層修飾劑制成[6]，具有以下優(yōu)點：①可以分散于水溶液中，一步合成水溶性的SPION；②結(jié)晶性好，磁性強；③粒徑分布均勻，分散性好，基本沒有出現(xiàn)團聚的現(xiàn)象。

2.高溫多元醇法合成的SPIO與既往商用SPIO在標記有效性上的對比評價

本研究發(fā)現(xiàn)這種新型SPIO在12～25 μg/mL孵育濃度，12 h的孵育時間下即可達到95%以上鐵標記率而無細胞毒性，而既往商用SPIO與轉(zhuǎn)染劑結(jié)合后要達到有效標記率的孵育濃度為25～50 μg/mL，孵育時間為18～24 h[10]，說明這種新型SPIO能更快速有效地標記干細胞；考慮是由于納米粒子水動力學粒徑小于100 nm，大小分布均一，有利于細胞對其吸收[4]，并且表面修飾涂層的空間位阻以及粒子間的靜電斥力阻止了粒子間的團聚，使得納米粒子結(jié)構更加穩(wěn)定，進一步促進了納米粒子的吸收和內(nèi)化[11]。

隨后的ICP-AES檢測對標記細胞內(nèi)的鐵含量進行測定進一步證實了這種新型SPIO在細胞標記領域的有效性。既往研究表明，F(xiàn)eridex在沒有轉(zhuǎn)染劑結(jié)合的情況下，25 μg/mL中孵育24 h后，細胞內(nèi)的鐵含量為0.6～1.5 pg/cell[12,13]，加入了一定濃度的多聚賴氨酸(polylysine,PLL)結(jié)合后，細胞內(nèi)的鐵含量可達到10 pg/cell[10,12]。由于Resovist的水動力學粒徑要小于Feridex，能更有效地促進粒子的吸收和內(nèi)化[12]，因此在相同的孵育濃度和時間條件下，細胞內(nèi)的鐵含量可達到0.92～4.00 pg/cell[12,14]，與PLL結(jié)合后，細胞內(nèi)的鐵含量上升為17.9 pg/cell[5]。與此對比，PEG/PEI修飾的SPIO在25 μg/ml中孵育12 h后，測定細胞內(nèi)的鐵含量達到35.4 pg/cell；即使在12 μg/mL中孵育12 h，細胞內(nèi)的鐵含量也可達到20.16 pg/cell。因此，無論是從標記的濃度和時間，還是細胞內(nèi)標記的鐵含量來衡量，都提示本研究中的PEG/PEI修飾的SPIO比商用的SPIO能更加快速有效地標記細胞。

除此之外，本研究還發(fā)現(xiàn)PEG/PEI修飾的SPIO標記效果要比PEG/PVP修飾的SPIO明顯，前者在不影響細胞生物活性的前提下，隨著孵育濃度和時間增加，細胞標記率提高，細胞內(nèi)鐵染色量和鐵含量亦增加；而PEG/PVP修飾的SPIO雖然在25 μg/ml的濃度下孵育12 h后達到95%以上的標記率，但隨著標記濃度的增加，普魯士藍染色顯示細胞內(nèi)鐵顆粒增加并不明顯，只積聚在細胞質(zhì)邊緣靠近胞膜的區(qū)域，隨后的ICP-AES測定細胞內(nèi)鐵含量僅達到6.96 pg/cell，標記效果與既往商用的SPIO對比并無優(yōu)勢；考慮是因為細胞標記不僅僅與納米粒子的直徑大小有關，還依賴粒子化學特性和表面電荷情況。有研究表明在外源性的納米材料向細胞內(nèi)輸送過程中，增加表面電荷能夠促使納米粒子的吸收和內(nèi)化[11]。本研究中PEG/PEI修飾的氧化鐵納米粒子表面為正電荷，而PEG/PVP修飾的納米粒子表面卻是零電荷[4]，并不利于納米粒子向細胞內(nèi)的輸送，說明表面電荷在細胞標記中占有極其重要的角色。

3.標記的安全性評價

納米顆粒表面涂層結(jié)構修飾除了影響細胞的標記率，還會影響細胞毒性作用。Thorek等[11]的研究中發(fā)現(xiàn)，在10～50 μg/ml濃度下的SPIO孵育后，只有少量的可以忽略不計的細胞出現(xiàn)死亡，但在SPIO進行了胺化的涂層后，即使是在10 μg/ml的濃度下，都表現(xiàn)出了一定程度的細胞毒性，這種細胞毒性隨著孵育濃度的增加而加劇。因此本研究將達到有效標記率的孵育濃度和時間進行了細胞毒性的測定，發(fā)現(xiàn)新型SPIO在適宜濃度和時間的條件下孵育后，不僅細胞活力、增殖力無明顯改變，而且相應的ADSCs表面抗原表達能力與未標記組差異亦無統(tǒng)計學意義，因此考慮該孵育濃度和時間孵育后對干細胞的生物學活性無明顯抑制作用。

一般來說，標記的安全性不僅需要評定標記對宿主細胞生物學活性的抑制作用，還得考慮內(nèi)吸收的納米鐵顆粒進入細胞內(nèi)如何代謝降解。目前普遍認為具有明顯生物相容性的SPIO應該是可以通過物理鐵代謝和利用的途徑進行降解的[15]?，F(xiàn)有的研究表明，進入細胞內(nèi)的氧化鐵納米粒子是作為元素鐵被代謝的，部分通過水解酶代謝，但主要還是在溶酶體的酸性條件下被代謝的[14]。因此納米粒子通過內(nèi)吞作用進入細胞質(zhì)后，先位于細胞質(zhì)中的溶酶體倉，然后再分發(fā)到細胞核周圍的囊泡以及終極溶酶體中，通過生物體的組織中的分子蛋白，溶酶體中的元素鐵可被儲存或者進一步合成血紅蛋白而降解，從而始終維持生物體內(nèi)的鐵平衡，本研究用透射電子顯微鏡對SPIO標記細胞的超微結(jié)構進行了觀察，結(jié)果顯示內(nèi)吸收的SPIO主要位于細胞質(zhì)區(qū)域的囊泡和溶酶體內(nèi)，并且標記后的細胞結(jié)構基本完整，細胞器未見明顯破壞，進一步說明了SPIO的標記是安全有效的。

本研究結(jié)果顯示這種由高溫多元醇法合成的新型SPIO在適當孵育濃度和時間下可以安全、快速地標記ADSCs。這種具有固定表面正電荷的PEG/PEI修飾的新型SPIO標記效果要遠遠比既往商用的SPIO快速有效，并隨著孵育濃度的增加，細胞內(nèi)的鐵含量增加，可作為一種新型的磁性標記物用于干細胞標記；而具有固定表面零電荷的PEG/PVP修飾的SPIO比起既往商用的SPIO并無明顯優(yōu)勢，說明表面電荷在細胞標記中占有極其重要的角色。

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The research of effectiveness and safety on SD rat adipose-derived stem cells labeled with a new type of superparamagnetic iron oxide nanoparticles

MA Wei-qiong,XIE Qi,ZHANG Ding-xuan，et al.

Department of Medical Imaging,Guangzhou First People′s Hospital/Nansha Central Hospital，Guangzhou Medical University，Guangzhou 510180，China

Objective：The aim of the present study was to explore the efficacy and safety of a new type of superparamagnetic nanoparticles (SPION) by labeling the SD rat adipose-derived stem cells (ADSCs) with SPION and comparing with our previous research results on commercial superparamagnetic iron oxide (SPIO).Methods:First,the SD rat ADSCs were incubated and labeled by different concentration groups (0,6,12,25,50,100μg/mL,respectively) and by different time groups (6,12,24,48h,respectively) after isolation,purification and identification.The labeling rate of iron oxide nanoparticles were detected by prussian blue staining.Second,the safety of high labeling efficacy (>95%) in ADSCs were evaluated,under the condition of not affecting the cell morphology,with viability,proliferation,surface makers identification and neuronal induction.Third,the ultrastructure of labeled ADSCs were oberved by transmission electron microscopy (TEM).Fourth,the iron content of labeled ADSCs were measured with ICP-AES and compared with our previous research results on commercial SPIO.Results:Under the premise of with no cytotoxicity,the incubation concentration for high labeling efficiency (>95%) of the new SPIO were 12 and 25μg/mL at the incubation time of 12h.The ICP-AES measurements showed that the iron content in ADSCs was 35.4pg/cell or 20.16pg/cell at the incubation of PEG/PEI SPIO which carried permanent positive surface charge, whereas only 6.96pg/cell at the incubation of PEG/PVP SPIO (25μg/mL,12h).TEM imaging showed that the cellular ultrastructure was intact,and the nanoparticles uptake was dominantly located in the vesicles and lysosomes.Conclusion：At the incubation of appropriate concentration and time,ADSCs can be safely and quickly labeled with new type of paramagnetic nanoparticles.Compared with the commercial SPIO，the new type of PEG/PEI SPIO trends to be a more advantaged magnetic tracer to label stem cells.In contrast,the advantage of PEG/PVP SPIO is not apparent,which indicates that surface charge have played an extremely important role in stem cell magnetic labeling.

New type of superparamagnetic nanoparticles; Adipose derived stem cells; Staining and labeling; Iron content; Surface charge

510180廣州，廣州醫(yī)科大學附屬廣州市第一人民醫(yī)院/廣州市南沙中心醫(yī)院醫(yī)學影像部(馬偉瓊、謝琦、張鼎旋、湯間儀、雷正賢、楊逸銘)；516001廣東，惠州市中心人民醫(yī)院放射科(馬偉瓊)

馬偉瓊(1986-)，女，廣東梅州人，碩士研究生，醫(yī)師，主要從事神經(jīng)影像診斷與分子影像學研究工作。

2014廣州市南沙區(qū)經(jīng)貿(mào)科技與信息化局民生科技項目基金(2014MS01)；2014廣州市醫(yī)藥衛(wèi)生科技一般引導項目(20141A010015)；2015廣州市科技計劃項目科學專項(一般項目)基金(1563000424)及2015廣東省科技計劃項目技術開發(fā)類基金(2014A020212034)

R814.3

A

1000-0313(2016)05-0386-07

10.13609/j.cnki.1000-0313.2016.05.001

2015-10-29

2016-01-11)