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    林可霉素發(fā)酵工藝優(yōu)化降低B組分

    2016-09-05 12:35:37王建國謝書琴
    山東化工 2016年8期
    關(guān)鍵詞:林可霉素甜菜堿膽堿

    李 華,張 立,王 鑫 ,王建國 , 謝書琴

    (天方藥業(yè)有限公司,河南 駐馬店 463000)

    林可霉素發(fā)酵工藝優(yōu)化降低B組分

    李 華,張 立,王 鑫 ,王建國 , 謝書琴

    (天方藥業(yè)有限公司,河南 駐馬店 463000)

    本研究通過在發(fā)酵過程中加入甲基化試劑(如甲硫氨酸、葉酸、甜菜堿或氯化膽堿等)后,能夠顯著地降低林可霉素B(以下簡稱林B)組分且同時發(fā)酵效價可提高5%左右,從而提高林可霉素A的產(chǎn)量,為林可霉素成本的降低和生產(chǎn)規(guī)模的擴(kuò)大奠定了基礎(chǔ)。

    林可霉素;林B;甲基化

    林可霉素是林可鏈霉菌(Streptomyces lincolnenisis)產(chǎn)生的一種林可酰胺類抗生素,主要用于冶療革蘭氏陽性菌引起的感染性疾病。林可霉素由4-丙基脯氨酸(PPL)和ɑ-甲硫基林可酰胺(MTL)通過縮合反應(yīng)生成去甲基林可霉素,進(jìn)一步甲基化而生成。

    林可霉素及其半合成衍生物克林霉素是臨床上廣泛應(yīng)用于抑制革蘭氏陽性菌的兩種林可酰胺類抗生素。我國林可霉素生產(chǎn)菌株發(fā)酵生產(chǎn)上卻一直面臨著有效組分林可霉素A產(chǎn)量不高和副產(chǎn)物林B含量偏高的問題。國外研究發(fā)現(xiàn),發(fā)酵過程中直接添加作為前提的丙基脯氨酸可以提高林可霉素A的產(chǎn)量而相應(yīng)減少林B的產(chǎn)量,但添加加甲基化試劑是否會降低林B的產(chǎn)量則尚未有相關(guān)報(bào)道。

    1 材料與方法

    1.1 菌種

    林可鏈霉菌:Js0214-01F1 01-2#由天方藥業(yè)有限公司提供。

    1.2 培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法

    1.2.1 斜面培養(yǎng)基(%)

    黃豆餅粉1.0,硫酸鎂0.05,磷酸二氫鉀0.005,硫酸亞鐵0.005,瓊脂粉等,pH值6.5~7.5;121℃保壓30min。

    1.2.2 種子培養(yǎng)基(%)

    黃豆餅粉2.0,葡萄糖 2.5,硫酸銨0.2,玉米漿3.5,碳酸鈣0.6等,pH值6.5~7.5;121℃保壓30min。

    1.2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基(%)

    硫酸銨1.5,磷酸二氫鉀0.03,黃豆餅粉3,玉米漿2.0,碳酸鈣1.0,葡萄糖8.0,pH值7.0。

    2 方法與結(jié)果

    2.1 分析方法

    發(fā)酵效價測定:HPLC法。色譜條件:色譜柱C18柱(4.6mm×250mm,5μm);流動相0.05mol/L硼砂溶液(用85%磷酸溶液調(diào)至pH值6.1)-甲醇(50:50);流速0.8mL/min;柱溫35℃;檢測波長214nm;進(jìn)樣量10μL。

    游離氨基氮檢測:甲醛氧化測定法;

    總糖、還原糖檢測:斐林試劑法;

    溶磷檢測:鉬酸銨分光光度法;

    菌絲形態(tài)檢查:美蘭染色,光學(xué)顯微鏡觀察。

    2.2 培養(yǎng)條件

    斜面和種子搖瓶培養(yǎng)溫度均為30℃,培養(yǎng)周期分別為7~10d和2d,500mL搖瓶培養(yǎng)基裝量為50mL,轉(zhuǎn)速220r/min。發(fā)酵搖瓶按10%的接種量接入50mL的培養(yǎng)基中,搖床轉(zhuǎn)速220r/min,30℃培養(yǎng)7d放瓶。

    2.3 實(shí)驗(yàn)方案與結(jié)果

    經(jīng)過大量的實(shí)驗(yàn)最終設(shè)計(jì)幾種不同的實(shí)施方案,每一種實(shí)施方案均在相同條件下進(jìn)行:

    實(shí)施例1 在不同周期加入0.05%的甲硫氨酸與對照相比結(jié)果如表1。

    表1

    由上表得出在中后期加入甲硫氨酸有利于抑制林B含量的減少,但在100h后添加又有明顯的上升趨勢。最后得出在發(fā)酵培養(yǎng)進(jìn)行100h時添加甲硫氨酸,7天后放瓶效價3900μ/mL,林B組分含量1.4%。,與對照相比明顯降低。

    實(shí)施例2 在不同周期加入0.03%的葉酸與對照相比結(jié)果如表2。

    表2

    上表結(jié)果得在酵培養(yǎng)進(jìn)行120h時添加葉酸,7天后放瓶效價4000μ/mL,林B組分含量1.3%,該結(jié)果與對照相比在效有所提高,林B組分含量也有明顯下降。

    實(shí)施例3 在不同周期加入0.1%的氯化膽堿與對照相比結(jié)果如表3。

    表3

    上表得出在發(fā)酵培養(yǎng)進(jìn)行80h時添加氯化膽堿,7天后放瓶效價4200μ/mL,與對照相比效價有所提高且林B組分含量1.4%與對照5.0%相比大幅下降,說明在合適的時間添加氯化膽堿有利于降低林B組分含量。

    實(shí)施例4 在不同周期加入0.1%甜菜堿。

    表4

    上表得出在發(fā)酵培養(yǎng)進(jìn)行160h時添加甜菜堿,7天后放瓶效價為4050μ/mL,林B組分含量1.5%,林可霉素的發(fā)酵周期一般在160~180h,這說明在后期加入甜菜更利于林B的降低。

    以上4個實(shí)驗(yàn)均為單因素實(shí)驗(yàn),每個單因素添加實(shí)驗(yàn)都在不同程度上提高發(fā)酵效價5%左右,同時降低林B組分含量,這說明添加甲基化物質(zhì)有利于發(fā)酵效價的增長,同時可降低B組分。

    結(jié)合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果,設(shè)計(jì)復(fù)合添加實(shí)施方案:

    實(shí)施例1 發(fā)酵培養(yǎng)進(jìn)行100h時添加甜菜堿(添加量為培養(yǎng)基的0.03%),培養(yǎng)120h時添加葉酸(添加量為培養(yǎng)基的0.02%),7天后放瓶效價4250μ/mL,林B組分含量1.3%。相同條件下不添加甜菜堿與葉酸時的對照效價為3830μ/mL,林B組分含量4.9%。

    實(shí)施例2 發(fā)酵培養(yǎng)進(jìn)行80h時添加氯化膽堿(添加量為培養(yǎng)基的0.01%),培養(yǎng)100h時添加葉酸(添加量為培養(yǎng)基的0.02%),培養(yǎng)120h時添加甜菜堿(添加量為培養(yǎng)基的0.03%),7天后放瓶效價4080μ/mL,林B組分含量1.5%。不添加氯化膽堿、葉酸和甜菜堿時對照效價為3827μ/mL,林B組分含量5.0%。

    3 討論

    通過以上幾個實(shí)驗(yàn)得出,不同周期在培養(yǎng)基中添加甲硫氨酸、葉酸、氯化膽堿和甜菜堿等甲基化物質(zhì),發(fā)現(xiàn)單因素添加上面幾種物質(zhì)可提高發(fā)酵單位5%左右,同時還可大幅降低林B組分含量的比例。

    [1] 范秀容,沈 萍.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)[M].北京:高等教育出版社,1980:98-101.

    [2] 北京大學(xué)生物系生物化學(xué)教研室.生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M].北京:高等教育出版社,1979:203-205.

    [3] 華東理工大學(xué),葉蕊芳,王倩,等. 一種提高林可霉素產(chǎn)量的方法: CN ,101265492A[P].2008-09-17.

    (本文文獻(xiàn)格式:李 華,張 立,王 鑫.林可霉素發(fā)酵工藝優(yōu)化降低B組分[J].山東化工,2016,45(08):63-64.)

    Lincomycin Fermentation Process Optimization to Reduce Part B

    Li Hua , Zhang Li , Wang Xin , Wang Jianguo, Xie Shuqin

    (Topfond Pharmaceutical Co., Ltd.,Zhumadian 463000,China)

    In this study through add methylation reagent in the fermentation process (e.g., methionine, folic acid, betaine, or choline chloride, etc.), can significantly reduce lincomycin B (hereinafter referred to as Lin B) components and fermentation potency improves about 5% at the same time, to improve the output of lincomycin A, for lincomycin cost reduced and the expansion of production scale laid a foundation.

    clindamycin; Lin B; methylation

    2016-03-11

    李 華(1977—),女,河南省駐以店市人,天方藥業(yè)有限公司生物技術(shù)研究所研究員,主要從事林可霉素、螺旋霉素堿、乙酰氨基葡萄糖發(fā)酵工藝優(yōu)化。

    R945

    B

    1008-021X(2016)08-0063-02

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