阿米洛利預(yù)處理對浸水束縛大鼠血清NO及胃黏膜MPO的影響*

蔣　群，屠偉峰，徐少群，趙高峰（.廣東省中醫(yī)院麻醉科，廣州5000；2.廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院臨床麻醉中心，廣東廣州5000）

阿米洛利預(yù)處理對浸水束縛大鼠血清NO及胃黏膜MPO的影響*

蔣群1，屠偉峰2△，徐少群1，趙高峰1（1.廣東省中醫(yī)院麻醉科，廣州510010；2.廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院臨床麻醉中心，廣東廣州510010）

目的觀察酸敏感離子通道阻斷劑——阿米洛利（Amiloride）預(yù)處理對急性胃黏膜病變（AMGL）大鼠的影響，并探討AMGL發(fā)病機制與酸敏感離子通道（ASICs）的關(guān)系。方法選取Wistar大鼠30只，分為正?？瞻讓φ战M（NC組）、應(yīng)激模型組（WS組）、阻斷劑組（AM組，給予Amiloride預(yù)處理），每組10只。采用浸水束縛應(yīng)激（WIRS）方法復(fù)制AMGL模型，于應(yīng)激6 h后觀察胃黏膜大體及光鏡下胃黏膜損傷程度、組織學(xué)改變及潰瘍指數(shù)（UI）、血清一氧化碳（NO）活性和胃黏膜組織髓過氧化物酶（MPO）水平。結(jié)果WS組大鼠胃黏膜呈暗紅色，有大量點狀出血、線狀出血或片狀糜爛，黏膜下血管和皮區(qū)血管充血，光鏡下見上皮細胞黏液層變薄、缺失，細胞間隙變大，不同程度壞死；AM組大鼠WIRS 6 h后大鼠胃黏膜出血或糜爛程度明顯輕于WS組，光鏡下雖可見大量毛細血管充血、擴張，上皮細胞黏膜層有少許缺損，但基本完整。與NC組比較，WS組大鼠WIRS 6 h后胃黏膜UI顯著增高，血清NO活性增強，胃組織MPO水平明顯增高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；與WS組比較，AM組大鼠胃黏膜UI、血清NO活性及胃組織MPO水平顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)論Amiloride可有效減輕炎癥介導(dǎo)的WIRS大鼠急性胃黏膜損傷或病變，提示ASICs可能參與了WIRS大鼠AMGL的發(fā)生。

阿米洛利；胃疾病；急性??；一氧化氮；胃黏膜；過氧化物酶；離子通道；大鼠

急性胃黏膜病變（AMGL）又稱為應(yīng)激性胃潰瘍，指在各種應(yīng)激狀態(tài)下，胃、十二指腸發(fā)生的急性、多發(fā)性黏膜淺表糜爛和潰瘍。大量研究表明，胃腸道pH值下降是許多病理生理過程的標(biāo)志。休克、膿毒癥等各種病理條件下內(nèi)臟血流灌注不足可導(dǎo)致胃腸道酸中毒，而適當(dāng)?shù)乃崦舾芯哂芯S持胃腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的作用，不適當(dāng)?shù)乃崦舾锌赡芗铀傺装Y和黏膜潰瘍的發(fā)生［1］。酸敏感離子通道（ASICs）作為化學(xué)感受器、傷害感受器、機械感受器在胃腸道信息處理過程中起重要作用。作者前期研究發(fā)現(xiàn)，酸敏感離子通道蛋白3（ASIC3）在胸段背根神經(jīng)節(jié)（DRG）神經(jīng)元上廣泛表達，且ASIC3 mRNA在AMGL大鼠胃投射DRG的表達量明顯增高［2］，推測ASICs可能在應(yīng)激性AGML的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用。本研究采用前期工作中應(yīng)用的浸水束縛應(yīng)激（WIRS）方法復(fù)制AMGL模型［2］，探討ASICs非特異性阻斷劑——阿米洛利（Amiloride）預(yù)處理對WIRS大鼠胃黏膜損傷的影響，進一步了解ASICs在AMGL發(fā)生中的作用。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物采用成年雄性無特定病原體級（SPF級）Wistar大鼠30只，體質(zhì)量（200±30）g，由南方醫(yī)科大學(xué)動物中心提供。

1.1.2試劑與儀器Amiloride粉劑（美國Sigma公司，批號不詳），髓過氧化物酶（MPO）試劑盒和一氧化氮（NO）試劑盒由南京建成生物醫(yī)學(xué)工程研究所提供。紫外分光光度計Optizen 2120UV購自韓國美卡希斯公司，酶標(biāo)儀購自美國Bio-Rad公司，DK-S22型電熱恒溫水浴鍋購自上海精宏公司。

1.2方法

1.2.1動物分組及模型復(fù)制將30只大鼠分為正?？瞻讓φ战M（NC組）、應(yīng)激模型組（WS組）和阻斷劑組（AM組），每組10只。NC組不給予任何處理，WS組采用WIRS法復(fù)制模型，AM組給予Amiloride預(yù)處理，即腹腔注射5μg/kgAmiloride 5min后浸水束縛。模型復(fù)制過程參照以往制作方法［2］：乙醚麻醉后，將大鼠四肢固定在自制的鐵絲網(wǎng)上，待大鼠清醒后垂直放入（20±1）℃水中，水面至胸骨劍突，6h后取出。

1.2.2標(biāo)本采集與觀察WIRS 6 h后，在水合氯醛深度麻醉狀態(tài)下取胃，沿胃大彎剪開平鋪，用冷生理鹽水沖洗，在10倍解剖顯微鏡下觀察胃黏膜情況。

1.2.3胃黏膜潰瘍指數(shù)（UI）的判定按Guth等［3］標(biāo)準(zhǔn)評估胃黏膜UI：點狀出血為1分，糜爛小于1 cm為2分，糜爛1～2 cm為3分，糜爛大于2～3 cm為4分，糜爛大于3 cm為5分；寬度大于2 mm者分值×2。所有得分相加即為UI。

1.2.4胃黏膜組織學(xué)檢查在胃黏膜損傷明顯處用組織剪剪取0.5 cm×1.0 cm大小組織塊，置于10%甲醛溶液中固定24～48 h，石蠟包埋后行4 μm切片，再用蘇木精-伊紅（HE）染色后于40倍光鏡下觀察胃黏膜組織學(xué)變化。

1.2.5血清NO活性測定腹主動脈取血2 mL，分離血漿，取上清液保存于-70℃冰箱中備用，采用硝酸還原酶法比色測定。具體步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進行。

1.2.6胃黏膜MPO測定取胃組織液氮保存?zhèn)溆?。用液氮研磨組織，與生理鹽水按體積質(zhì)量比19∶1制作5%組織勻漿。采用比色法測定，具體方法與步驟參照試劑盒說明書進行。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，實驗數(shù)據(jù)以±s表示，組間樣本均數(shù)比較采用oneway ANOVA檢驗，組間兩兩比較采用q檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)　果

2.1Amiloride對AMGL大鼠胃黏膜大體形態(tài)的影響

經(jīng)大體標(biāo)本觀察，NC組大鼠胃腔有淡黃色透明液體，胃黏膜呈淡紅色，光滑完整，無充血；WS組大鼠WIRS 6 h后胃腔內(nèi)見大量血性積液，黏膜表面大量暗紅色血痂，充血嚴(yán)重，呈點狀、線狀、片狀糜爛壞死；AM組大鼠胃腔液體呈黃色，胃黏膜仍存在充血、水腫、岀血、壞死，但程度較輕，顏色較淡（圖1）。

2.2Amiloride對AMGL大鼠胃黏膜組織形態(tài)的影響光鏡下觀察NC組大鼠胃黏膜上皮光滑完整，腺體排列整齊；WS組大鼠胃黏膜上皮黏膜壞死、脫落，細胞間隙變大，毛細血管嚴(yán)重充血、擴張，間質(zhì)炎癥細胞浸潤，腺體破壞嚴(yán)重；AM組大鼠胃黏膜上皮部分壞死，腺體破壞輕，毛細血管輕度充血、擴張，損傷明顯輕于WS組（圖2）。

圖2　Amiloride對AMGL大鼠胃黏膜組織病理學(xué)的影響（HE染色，40×）

2.3Amiloride對AMGL大鼠胃黏膜UI、血清NO活性和胃組織MPO水平的影響與NC組比較，WIRS 6 h后，WS組大鼠胃黏膜UI顯著增高，血清NO活性增強，胃組織MPO水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；與WS組比較，AM組大鼠胃黏膜UI、血清NO活性及胃組織MPO水平顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），見表1。胃黏膜UI與MPO水平呈顯著正相關(guān)（r=0.904，P＜0.01）。

表1　各組大鼠胃黏膜UI、血清NO活性和胃組織MPO水平比較（±s）

表1　各組大鼠胃黏膜UI、血清NO活性和胃組織MPO水平比較（±s）

注：-表示無此項。

組別N C 組W S 組A M 組n　U I（分）　N O （μ m o l / L）　M P O （U / g濕重）1 0 1 0 1 0 F P --0 . 0 0 ± 0 . 0 0 4 8 . 7 2 ± 3 . 1 2 2 1 . 7 0 ± 5 . 7 3 2 3 5 . 3 7 ＜0 . 0 1 1 3 . 4 5 ± 2 . 4 6 2 8 . 9 5 ± 2 . 7 5 1 8 . 0 3 ± 3 . 0 6 2 5 . 4 7 ＜0 . 0 1 1 3 . 3 9 ± 4 . 1 2 3 1 . 9 1 ± 2 . 3 5 1 6 . 2 4 ± 2 . 7 3 2 8 . 2 3 ＜0 . 0 1

3　討　論

機體在遭受各種創(chuàng)傷、重病及其他應(yīng)激情況時，這些非特異性的強烈刺激可使機體各系統(tǒng)本能地出現(xiàn)功能和結(jié)構(gòu)上的劇烈反應(yīng)。胃是應(yīng)激狀態(tài)下最為敏感的器官之一，此時胃黏膜所表現(xiàn)的急性病變也稱為應(yīng)激性胃潰瘍，其發(fā)生機制尚未明確，目前認(rèn)為是維持胃黏膜完整性的平衡因子失調(diào)和破壞，其病因主要集中在胃黏膜微循環(huán)障礙、胃酸反彌散、氧自由基損害、細胞凋亡等方面。本研究采用WIRS復(fù)制應(yīng)激性胃潰瘍模型。

ASICs屬于對Amiloride敏感的上皮鈉通道/退化蛋白（ENaC/DEG）通道家族［4］，由6個不同的亞基組成，ASICs作為化學(xué)感受器、傷害感受器和機械感受器，在胃腸道信息處理過程中具有重要作用［5］。有研究表明，ASIC3和瞬時受體電位離子通道（TRPV1，俗稱辣椒素受體）共同表達于脊髓DRG神經(jīng)元［6］，在胃腸道高炎性反應(yīng)中，對感受組織酸化起到傷害性感受器的重要作用。同時，已有大量研究表明，胃酸刺激能活化DRG神經(jīng)元軸突上的TRPV1受體，TRPV1受體活化導(dǎo)致降鈣素基因相關(guān)肽（GCRP）、神經(jīng)肽A（NKA）等肽類物質(zhì)大量釋放，通過GCRP/NO/前列腺素（PGS）途徑誘導(dǎo)充血反應(yīng)［7］，增加胃黏膜血流量（GMBF），對胃黏膜起到保護作用。作者在前期工作中也發(fā)現(xiàn)，在WIRS大鼠胸段胃投射DRG中TRPV1水平升高，胃黏膜中GCRP水平增加，提示胃黏膜的傳出樣作用［8］。也有研究明確顯示，在胃黏膜感受器傳入系統(tǒng)與NO胃黏膜保護機制中扮演了重要角色［9］。而在ASIC3去基因小鼠中［10］，由氯化氫誘導(dǎo)的胃黏膜損傷程度更大一些，由此推測，ASIC3與胃黏膜保護相關(guān)，其保護機制與TRPV1相似。本研究通過使用ASICs阻斷劑——Amiloride預(yù)處理，觀察ASICs在WIRS大鼠胃黏膜損傷發(fā)生中的作用。

本研究結(jié)果顯示，正常大鼠胃黏膜呈淡紅色，光滑完整，無充血；WIRS 6 h后大鼠胃腔內(nèi)見大量血性積液，胃黏膜明顯充血、水腫，損傷嚴(yán)重，呈點線狀甚至片狀糜爛、壞死，UI高達（48.72±3.12）分，而Amiloride預(yù)處理大鼠WIRS 6 h后，大鼠胃黏膜出血或糜爛程度明顯輕于WS組，UI降低［（21.70±5.73）分］。光鏡下觀察WIRS 6 h后大鼠胃黏膜、上皮黏膜壞死、脫落，細胞間隙變大，毛細血管嚴(yán)重充血、擴張，間質(zhì)炎性細胞浸潤，腺體破壞嚴(yán)重；Amiloride預(yù)處理大鼠WIRS 6 h后胃黏膜損傷程度明顯減輕，僅有部分毛細血管充血、擴張。表明在Amiloride阻斷ASICs的情況下，WIRS模型大鼠胃黏膜損傷明顯減輕，即Amiloride預(yù)處理對大鼠AMGL具有明顯保護作用。由此推測，ASICs可能參與了AMGL的發(fā)生。

本研究結(jié)果表明，WS組在胃潰瘍發(fā)生時伴隨著UI的增加和NO活性升高，與NC組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），提示在應(yīng)激狀態(tài)下機體能產(chǎn)生適量的NO增加GMBF，保護局部胃黏膜，而在Amiloride阻斷ASIC3的作用下，WIRS 6 h后NO活性無明顯增強，說明ASIC3同樣可以感受胃酸刺激，誘發(fā)胃黏膜適應(yīng)性保護作用［11］。另外，本研究結(jié)果顯示，WS組大鼠UI，胃黏膜組織MPO水平較NC組顯著增高，且UI與MPO水平呈顯著正相關(guān)，與前期研究結(jié)果一致［12］；而Amiloride阻斷后MPO水平降低，提示阻斷ASIC3可以通過抑制中性粒細胞活化而產(chǎn)生胃黏膜保護作用。

本研究提示，ASICs在胃腸道病變中具有“雙刃劍”的作用，小劑量的酸敏感可以誘發(fā)胃黏膜的適應(yīng)性保護作用；同時，ASIC3在胃腸道高炎性反應(yīng)中感受組織酸化，起到傷害性感受器作用。推測ASICs參與AMGL的具體機制可能是由于WIRS誘導(dǎo)產(chǎn)生的胃潰瘍加重了ASIC3對酸誘發(fā)痛的感知，并通過炎癥介導(dǎo)加重了應(yīng)激對胃黏膜的損傷，阻斷或去除這種酸感受器可改善胃腸道的酸傷害性感受，減輕炎性反應(yīng)，從而發(fā)揮胃黏膜的保護作用。

綜上所述，ASICs在維持胃腸道內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定中具有重要作用，激活A(yù)SICs可以通過增加GMBF發(fā)揮適應(yīng)性保護作用，同時，還可通過活化中性粒細胞加重胃黏膜損傷，但其具體機制尚需進一步研究。

［1］Holzer P.Taste receptors in the gastrointestinal tract.V.Acid sensing in thegastrointestinal tract［J］.Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol，2007，292（3）：G699-705.

［2］蔣群，屠偉峰.舒芬太尼預(yù)處理對大鼠急性胃粘膜病變的保護作用及與酸敏感離子通道的關(guān)系［J］.南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2010，30（5）：1099-1102.

［3］ Guth PH，Aures D，Panlsen G，et al.Topical aspirin plus HCl gastric lesions in the rat.Cytoprotective effect of prostaglandin，cimetidine，and probanthin［J］.Gastroenterology，1979，76（1）：88-93.

［4］Gautam M，Benson CJ.Acid-sensing ion channels（ASICs）in mouse skeletal muscle afferents are heteromers composed of ASIC1a，ASIC2，and ASIC3 subunits［J］.FASEB J，2013，27（2）：793-802.

［5］Page AJ，Brierley SM，Martin CM，et al.Different contributions of ASIC channels 1a，2，and 3 in gastrointestinal mechanosensory function［J］. Gut，2005，54（10）：1408-1415.

［6］Vetter I，Wyse BD，Monteith GR，et al.The mu opioid agonist morphine modulates potentiation of capsaicin-evoked TRPV1 responsesthrough a cyclic AMP-dependent protein kinase A pathway［J］.Mol Pain，2006，2：22.

［7］Harada N，Okajima K，Uchiba M，et al.Contribution of capsaicin-sensitive sensory neurons to stress-induced increases in gastric tissue levels of prostaglandins in rats［J］.Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol，2003，285 （6）：G1214-1224.

［8］蔣群，屠偉峰，徐少群，等.TRPV1與μ-阿片受體在胃投射脊髓背根神經(jīng)節(jié)中的共存表達及其臨床意義［J］.實用醫(yī)學(xué)雜志，2014，30（18）：2876-2879.

［9］Groneberg D，Lies B，K?nig P，et al.Cell-specific deletion of nitric oxidesensitive guanylyl cyclase reveals a dual pathway for nitrergic neuromuscular transmission in the murinefundus［J］.Gastroenterology，2013，145（1）：188-196.

［10］Wultsch T，Painsipp E，Shahbazian A，et al.Deletion of the acid-sensing ion channel ASIC3 prevents gastritis-induced acid hyperresponsiveness of the stomach-brainstem axis［J］.Pain，2008，134（3）：245-253.

［11］Holzer P.Efferent-like roles of afferent neurons in the gut：blood flow regulation andtissue protection［J］.Auton Neurosci，2006，125（1/2）：70-75.

［12］Li WF，Hao DJ，F(xiàn)an T，et al.Protective effect of chelerythrine against ethanolinduced gastric ulcer in mice［J］.Chem Biol Interact，2014，208：18-27.

Effect of amiloride pretreatment on serum NO and gastric mucosal MPO in water immersion restraint rats*

Jiang Qun1，Tu Weifeng2△，Xu Shaoqun1，Zhao Gaofeng1（1.Department of Anesthesiology，Guangdong Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine，Guangzhou，Guangdong 510010，China；2.Clinical Anesthesia Center，Guangzhou General Hospital of Guangzhou Military Region，Guangzhou，Guangdong 510010，China）

ObjectiveTo investigate the effect of acid sensing ion channels（ASICs）blocker amiloride precondition on acute gastricmucosallesion（AGML）ratandto studythe relationbetweenAGMLpathogenesiswith ASICs.MethodsThirty Wistar rats were selected and randomly divided to 3 groups（10 cases per group），including the normal blank control group（NC），stress model group（WS）and blocker group（amiloride precondition group，AM）.The AGML model was induced by water immersion restraint stress（WIRS）.The gastric tissues in general，gastric mucosal lesion degree，histological change under microscope and ulcer index were observed，the levels of serum NO and MPO in gastric mucosal tissue were observed at 6 h after stress.ResultsThe gastric mucosa in the WS group showed dark red with a large of punctate hemorrhage，linear hemorrhage or flake erosion，the submucosal blood vessel and dermatomal blood vessel were congested，the epithelial cell mucous layer was thin and deleted，the intracellular space was increased with different degrees of necrosis；but the gastric mucosal hemorrhage or erosion degree after 6 h of WIRS in the AM group was obviously improved compared with that in the WS group；a large number of blood capillary congestion and expansion were seen under microscope，the epithelial cell mucosal layer had a little defects，but was basically intact.Compared with the group NC，the gastric mucosal UI after 6 h of WIRS in the WS group was significantly increased，serum NO enhanced and gastric tissue MPO level was significantly elevated，the differences were statistically significant（P＜0.01）；compared with the WS group，gastric mucosal UI，serum NO level and gastric tissue MPO level were significantly decreased，the differences were statistically significant（P＜0.01）.ConclusionAmiloride can effectively alleviate the WIRS rat acute gastric mucosal lesion mediated by inflammation，which prompting that ASICs may participate in the occurrence of AGML in WIRS rat.

Amiloride；Stomach diseases；Acute disease；Nitric oxide；Gastric mucosa；Peroxidase；Ion channels；Rats

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.13.003

A

1009-5519（2016）13-1961-03

國家自然科學(xué)基金資助項目（81272141）；廣東省自然科學(xué)基金資助項目（S2011010003373）；江蘇省教育廳開放研究課題（KJS09002）。

蔣群（1984-），碩士研究生，主要從事胃保護與傷害性感受器關(guān)系的研究。

△，E-mail：wftuyx02@163.com。

（2016-03-18）