黃連解毒湯等對乳腺癌荷瘤小鼠腫瘤酸性微環(huán)境p H值的影響*

張翔云 周華妙郭 勇

（浙江中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院·杭州 310053）

黃連解毒湯等對乳腺癌荷瘤小鼠腫瘤酸性微環(huán)境p H值的影響*

張翔云 周華妙??郭 勇

（浙江中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院·杭州 310053）

目的：研究中醫(yī)藥對乳腺癌荷瘤小鼠腫瘤微環(huán)境pH值的影響。方法：測量并比較乳腺癌荷瘤小鼠單純荷瘤組與中藥干預組的腫瘤上清液pH值，分析結果并探討中醫(yī)藥對于乳腺癌荷瘤小鼠腫瘤酸性微環(huán)境pH值的影響。結果：黃連解毒湯組乳腺癌腫瘤組織pH值（7.0400±0.8732）與單純荷瘤組乳腺癌腫瘤組織pH值（6.8625±0.5620）相比上升，統(tǒng)計學差異顯著（p＜0.05）；四君子湯組乳腺癌腫瘤組織pH值（6.9525±0.2217）與單純荷瘤組乳腺癌腫瘤組織pH值（6.8625±0.5620）相比上升，統(tǒng)計學差異顯著（p＜0.05）；其中黃連解毒湯組與單純荷瘤組之間統(tǒng)計學差異非常顯著（p＜0.01）。結論：黃連解毒湯、四君子湯加減可以明顯增高乳腺癌荷瘤小鼠腫瘤組織的pH值，而這種調(diào)節(jié)作用的產(chǎn)生機制及對于腫瘤侵襲轉移能力的具體影響仍需要對后續(xù)試驗結果進行分析以補充。

乳腺癌 中醫(yī)藥 小鼠 腫瘤酸性微環(huán)境 pH值

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，近年來發(fā)病率呈現(xiàn)上升趨勢，已成為女性惡性腫瘤發(fā)病率之首，究其最常見的死亡原因，并非原發(fā)腫瘤，而是轉移性疾病。已有大量研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌腫瘤微環(huán)境和腫瘤血管生成與乳腺癌的侵襲和轉移關系密切。

轉移被認為是腫瘤與細胞基質相互作用的多階段過程，這些過程使得腫瘤具有新生血管的能力，使腫瘤細胞更容易遷移和侵襲到轉移部位。一旦腫瘤新生物表現(xiàn)出侵襲性，就能夠通過淋巴管和(或)血管播散，包括借助于腫瘤刺激淋巴管生成和血管生產(chǎn)，或者改變局部的微環(huán)境而播散[1]。

腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment)的思想最早可見于100多年前Paget提出的“種子-土壤”學說。狹義的腫瘤微環(huán)境的定義是腫瘤組織中的各種細胞和結構構成腫瘤微環(huán)境。但廣義來說，腫瘤細胞所處的外部環(huán)境，或腫瘤組織所處的外部環(huán)境也可理解為腫瘤微環(huán)境[2]。具體是指腫瘤在生長過程中，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉移密不可分的局部穩(wěn)態(tài)環(huán)境[3]。

研究證實，惡性腫瘤組織周圍的pH值在6.8～6.0之間，更有低至5.8。而正常組織周圍的pH值一般保持在7.35～7.45之間［4-6］。腫瘤微環(huán)境酸性的形成，一方面是由于其高效率的糖酵解生成的乳酸所致[7-12]，即主要是無氧代謝決定了腫瘤的酸度。另一方面，胞內(nèi)產(chǎn)生的CO2通過彌散作用排到胞外，由于腫瘤組織細胞缺氧，激活缺氧誘導因子1(hypoxiainducible factor1，HIF-1)誘導腫瘤細胞高表達CA-Ⅸ，催化CO2和H2O反應生成碳酸[13]。這就提示，乳酸和碳酸是腫瘤細胞外酸性微環(huán)境的主要來源，以及腫瘤酸性微環(huán)境的形成原因主要與腫瘤細胞的糖酵解代謝和缺氧有關[14]。腫瘤酸性微環(huán)境對腫瘤細胞生長轉移的影響主要是：①改變腫瘤細胞的生物學活性[15]，從腫瘤發(fā)病機制到治療各個環(huán)節(jié)的研究領域都與腫瘤酸性微環(huán)境有關；②通過上調(diào)VEGF等基因表達，促進腫瘤新生血管生成[16]?？梢?，腫瘤細胞的生長轉移與腫瘤酸性微環(huán)境密切相關。

已有許多實驗證明酸性微環(huán)境對腫瘤的生長和轉移有很大影響[17-20]，本次研究意在從中醫(yī)藥調(diào)整乳腺癌荷瘤小鼠腫瘤微環(huán)境pH值的角度出發(fā)，觀察黃連解毒湯、四君子湯加減等中醫(yī)方藥對乳腺癌荷瘤小鼠腫瘤微環(huán)境pH值的調(diào)整作用，進而為中醫(yī)藥對腫瘤轉移侵襲能力等影響做好研究準備。

1 材料與方法

1.1 材料

Hanks緩沖液（吉諾），精細眼科剪、精細組織鑷（美國瑞德）、delta320ph計（梅特勒-托利多儀器有限公司）等。

1.2 活體腫瘤制備腫瘤上清液

6～8周齡Balb/c小鼠按區(qū)組隨機分為空白對照組、單純荷瘤組、黃連解毒湯組、四君子湯組四組，并于單純荷瘤組、黃連解毒湯組、四君子湯組小鼠乳腺脂肪墊接種乳腺癌4T1高轉移細胞，接種后24h給藥：單純荷瘤組：以飲用水灌胃，每日0.4ml/只；黃連解毒湯組：以黃連解毒湯灌胃，每日0.4ml/只；四君子湯組：以四君子湯加味灌胃，每組0.4ml/只。35天后處死取出瘤體。

每組處死4只小鼠，空白對照組取乳腺脂肪墊組織，單純荷瘤組、黃連解毒湯組、四君子湯組取出瘤體，以眼科剪充分剪碎，分別放入Hanks緩沖液中（300mg/ml）,混勻后以300G室溫離心10min。吸取上清液，過濾后得到腫瘤組織上清。

1.3 檢測腫瘤組織上清pH值

檢測方法：

以旋轉的方式把PH電極從保存液中拔出，使用蒸餾水清洗并拭干-校正-清洗并拭干，后分別浸入空白對照組、單純荷瘤組、黃連解毒湯組、四君子湯組四組樣本中進行測量、讀數(shù)（每次測量后需重新校正清洗）。

每支樣本重復測量三次，取三次結果的平均值。

1.4 統(tǒng)計方法

結果采用SPSS17.0軟件包統(tǒng)計。計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（）表示。采用方差分析，以P＜0.05為差異顯著、P＜0.01為差異非常顯著的檢驗標準。

2 結果

pH值 均值標準差1#2#3#4#空白對照組7.347.377.367.417.37000.2944單純荷瘤組6.916.916.806.836.86250.5620黃連解毒湯組6.987.106.927.097.04000.8732四君子湯組6.966.966.976.926.95250.2217

各組間組織pH值比較結果如下：（Hanks緩沖液pH值測出為7.246）

如圖，空白對照組乳腺脂肪墊組織pH值為7.3700±0.2944，與相關文獻所載正常組織周圍pH值（7.35～7.45）基本相符。黃連解毒湯組乳腺癌腫瘤組織pH值（7.0400±0.8732）與單純荷瘤組乳腺癌腫瘤組織pH值（6.8625±0.5620）相比上升，統(tǒng)計學差異顯著（p＜0.05）；四君子湯組乳腺癌腫瘤組織pH值（6.9525±0.2217）與單純荷瘤組乳腺癌腫瘤組織pH值（6.8625±0.5620）相比上升，統(tǒng)計學差異顯著（p＜0.05）；其中黃連解毒湯組與單純荷瘤組之間統(tǒng)計學差異非常顯著（p＜0.01）。

3 小結

腫瘤酸性微環(huán)境是腫瘤細胞進行缺氧和有氧糖酵解代謝產(chǎn)生的乳酸和缺氧所致的HIF-1激活相關酶催化CO2變成碳酸在胞內(nèi)聚集，迫使腫瘤細胞上調(diào)膜離子交換體以調(diào)節(jié)形成適應腫瘤生長轉移的胞內(nèi)呈堿性和胞外呈酸性的微環(huán)境,抗腫瘤細胞生長轉移的關鍵則在于調(diào)節(jié)膜離子交換體、調(diào)整酸性微環(huán)境和調(diào)控營養(yǎng)物質[21]。通過分析本次研究結果，我們發(fā)現(xiàn)黃連解毒湯、四君子湯可以明顯升高乳腺癌荷瘤小鼠腫瘤組織的pH值，而這種調(diào)節(jié)作用的發(fā)生機制及對于腫瘤侵襲轉移能力的具體影響仍需要對后續(xù)試驗結果進行分析以補充。

[1] 譚晶晶，劉文，祖旭宇.腫瘤微環(huán)境與乳腺腫瘤發(fā)生發(fā)展關系的研究進展腫瘤防治研究瘤防治.2014年第41卷第3期:274-279.

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（2016-08-10 收稿）

* 課題：基于TAMS與酸性微環(huán)境觀察梳肝健脾法治療小鼠乳腺癌腫瘤轉移的實驗研究

** 通訊作者