自體肌腱加富血小板血漿重建比格犬前交叉韌帶的實(shí)驗(yàn)研究

馬震勝，張磊，鄂鋼，馬駿馳，孫欣，馬超，劉志奎，劉子洪

(開灤總醫(yī)院骨科，河北 唐山　063000)

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實(shí)驗(yàn)研究

自體肌腱加富血小板血漿重建比格犬前交叉韌帶的實(shí)驗(yàn)研究

馬震勝，張磊，鄂鋼，馬駿馳，孫欣，馬超，劉志奎，劉子洪

(開灤總醫(yī)院骨科，河北 唐山063000)

目的研究應(yīng)用自體肌腱添加富血小板血漿重建比格犬前交叉韌帶的早期組織學(xué)轉(zhuǎn)歸及生物力學(xué)變化。方法選用健康成熟的雄性比格犬36只，隨機(jī)分為兩組(模型組和實(shí)驗(yàn)組)，將每組比格犬36個(gè)膝關(guān)節(jié)分別取同側(cè)趾長屈肌腱進(jìn)行單束雙股重建，實(shí)驗(yàn)組添加自體富血小板血漿。術(shù)后第4、8、12周每組隨機(jī)抽取6只比格犬處死，分別取12個(gè)膝關(guān)節(jié)(包括股骨端與前交叉韌帶)，每組隨機(jī)取8個(gè)膝關(guān)節(jié)做生物力學(xué)拉脫試驗(yàn)，另4個(gè)膝關(guān)節(jié)標(biāo)本進(jìn)行組織學(xué)檢查，并對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果組織學(xué)觀察模型組術(shù)后4周時(shí)，腱骨界面有纖維血管形成，實(shí)驗(yàn)組腱骨界面纖維血管更加密集，排列較有序并有少量Ⅱ型膠原纖維。術(shù)后8周模型組有肌腱周圍的新骨形成，骨隧道壁增厚。但在此期間，膠原纖維機(jī)化不充分，腱骨的連續(xù)性偶爾可見；實(shí)驗(yàn)組膠原纖維生長成熟，可見腱骨的連續(xù)性，并在腱骨界面中心出現(xiàn)少量垂直排列的Sharpey樣纖維。術(shù)后12周模型組可見少量垂直排列的Sharpey樣纖維；實(shí)驗(yàn)組腱骨界面可見大量的垂直排列的Sharpey樣纖維，此時(shí)腱骨愈合已逐步趨于穩(wěn)定。生物力學(xué)測試顯示術(shù)后第4、8周，兩組肌腱都能從骨隧道里拉脫出來。在第12周時(shí)，模型組仍可以從骨髓道里被拉脫；實(shí)驗(yàn)組肌腱均不能從隧道中被拉出，而是在肌腱中間斷裂。結(jié)論應(yīng)用自體肌腱可以重建比格犬前交叉韌帶并達(dá)到腱骨愈合，添加富血小板血漿可以加快腱骨愈合的速度。

前交叉韌帶；富含血小板血漿；韌帶重建；生物力學(xué)

應(yīng)用自體肌腱重建前交叉韌帶已成為重建前交叉韌帶(anterior cruciate ligament，ACL)的主要方法之一，但是每年都有大量患者進(jìn)行前交叉韌帶重建術(shù)后的翻修手術(shù)，經(jīng)分析重建失敗的主要原因?yàn)殡旃堑难舆t愈合[1]。韌帶重建術(shù)后，醫(yī)生最關(guān)心重建韌帶的腱骨愈合情況，所以促進(jìn)腱骨愈合的研究已成為熱點(diǎn)。富含血小板血漿來自血液，制備方便，富含血小板血漿在許多動(dòng)物損傷修復(fù)的基礎(chǔ)研究中已經(jīng)證明可以促進(jìn)傷口的愈合和組織的修復(fù)，在腱骨愈合中也可以促進(jìn)纖維軟骨和Ⅰ型膠原的生長[2-5]。目前國內(nèi)外研究自體肌腱添加富血小板血漿重建比格犬前交叉韌帶的實(shí)驗(yàn)鮮有報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用自體肌腱添加富含血小板血漿重建比格犬前交叉韌帶取得了良好的組織學(xué)及生物力學(xué)結(jié)果，現(xiàn)報(bào)告如下。

1　資料與方法

1.1一般資料選取成年健康雄性比格(Beagle)犬36 只，體重約(12.45±1.56) kg，單獨(dú)置于100 cm×100 cm×75 cm籠子飼養(yǎng)，限制在鐵籠內(nèi)活動(dòng)，隨機(jī)將36只比格犬分為2組(模型組和實(shí)驗(yàn)組)，每組18只。

1.2實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷慕⒃谌‰[靜脈注射戊巴比妥(30 mg/kg)，麻醉生效后將雙膝關(guān)節(jié)和踝關(guān)節(jié)處備皮，采取仰臥位將比格犬固定在手術(shù)臺上，常規(guī)消毒鋪無菌巾單。切取比格犬的趾長屈肌腱作為重建前交叉韌帶的自體肌腱材料。切取趾長屈肌腱后，用器械將肌腱近端殘留的肌肉組織剝離干凈(見圖1)。將處理好的肌腱對折后用3-0不可吸收線在肌腱兩端編織縫合，縫合完畢后斷端對折，肌腱對折處穿入聚乙烯線(強(qiáng)生)。用自制肌腱測量器測量肌腱的直徑后放入生理鹽水濕紗布中備用(見圖2)。膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)平髕韌帶作切口長6 cm左右，經(jīng)髕骨內(nèi)側(cè)入路進(jìn)入膝關(guān)節(jié)，暴露前交叉韌帶后將其完整切除。依據(jù)測量的肌腱直徑選用合適鉆頭建立脛骨隧道，與脛骨軸線成角45°，與脛骨矢狀面成角30°，隧道內(nèi)口位于脛骨前交叉韌帶的止點(diǎn)。然后屈曲膝關(guān)節(jié)，根據(jù)測量股骨側(cè)移植肌腱的直徑，應(yīng)用合適的空心鉆頭建立股骨隧道。股骨隧道從髁間窩前交叉韌帶起點(diǎn)處鉆向外側(cè)，方向與股骨干縱軸成45°角左右。隧道鉆取完畢后將編織好的自體肌腱從脛骨隧道進(jìn)入關(guān)節(jié)腔然后從股骨隧道拉出，保證肌腱移植物在骨隧道內(nèi)約1.5 cm，關(guān)節(jié)內(nèi)約1.0 cm，然后將股骨端、脛骨端縫線固定在隧道外的骨橋上。術(shù)后沖洗后逐層關(guān)閉切口，到此模型組重建成功(見圖3)。實(shí)驗(yàn)組在重建ACL重建后用注射器向骨髓道里注入新鮮提取的添加凝血酶的富血小板血漿。

圖1切取比格犬的趾長屈肌腱圖2處理好的備用移植肌腱圖3重建后的前交叉韌帶(箭頭示)

1.3富含血小板血漿的制備比格犬麻醉后從股動(dòng)脈抽血，取出全血10 mL，立即放入含有1 mL低分子肝素鈉的15 mL離心管，在室溫下離心10 min，轉(zhuǎn)速設(shè)置為2 000 r/min。因?yàn)檠褐谐煞值拿芏炔煌?，離心后上層為血清，中層為富含血小板血漿，下層為紅細(xì)胞。用移液管把上層和中層移入無抗凝劑的離心管后繼續(xù)離心10 min，轉(zhuǎn)速為2 000 r/min。離心后移除上層血清留下約1 mL的富含血小板血漿，備用。

1.4標(biāo)本的獲取及其檢查模型組和實(shí)驗(yàn)組分別于術(shù)后4周、8周、12周在麻醉下處死動(dòng)物6只。大體觀察關(guān)節(jié)內(nèi)以及腱骨愈合的情況。取4只股骨端的腱骨標(biāo)本，沿腱骨界面縱軸用線鋸小心切開，在10%中性福爾馬林中固定3 d，然后在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的乙二胺二酸15中脫鈣3周，脫鈣完畢后進(jìn)行石蠟包埋。包埋后沿腱骨界面縱軸面進(jìn)行切片，厚度設(shè)定為4 μm，行HE染色組織學(xué)檢查。其他8只切取膝關(guān)節(jié)，仔細(xì)分離膝關(guān)節(jié)周圍肌肉保留股骨遠(yuǎn)端、重建的ACL和脛骨近端，置于-80℃深低溫冰箱保存，后集中行生物力學(xué)測試。將取下的標(biāo)本在常溫下解凍后，股骨與脛骨分別固定于萬能材料實(shí)驗(yàn)機(jī)(德國)。測試前將固定重建肌腱的線結(jié)切除。將腱-骨界面組織設(shè)為唯一測試的力，行最大負(fù)荷實(shí)驗(yàn)，按10 mm/min速度加載負(fù)荷，最大加載負(fù)荷為600 N，測試腱骨界面的的抗拉脫強(qiáng)度，觀察重建ACL的最大負(fù)荷強(qiáng)度，記錄斷裂或拉脫負(fù)荷，對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2　結(jié)　　果

2.1組織學(xué)觀察肌腱植入4周后模型組肌腱與骨隧道的間隙中出現(xiàn)新生的纖維血管，周圍散在血管內(nèi)皮、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞。。實(shí)驗(yàn)組腱骨界面有大量細(xì)胞重構(gòu)和血管形成，伴有在骨隧道壁上少量成骨細(xì)胞、軟骨樣細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的增生(見圖4)。

注：T-肌腱；B-骨　　　　　　　　　　　　注：T-肌腱；B-骨

術(shù)后8周模型組肌腱周圍有軟骨樣細(xì)胞形成，骨隧道壁增厚，但在此期間，膠原纖維機(jī)化不充分，排列較混亂；實(shí)驗(yàn)組膠原纖維生長成熟，可見腱骨的連續(xù)性，并在腱骨界面中心出現(xiàn)少量垂直排列的Sharpey樣纖維(見圖5)。

注：T-肌腱；B-骨；FC-纖維軟骨　　　　　注：T-肌腱；B-骨；FC-纖維軟骨

術(shù)后12周模型組腱-骨界面之間有疏松排列的Sharpey纖維的膠原纖維出現(xiàn)，排列無序，并且可見重建ACL邊緣存在新生的成骨樣細(xì)胞，移植肌腱和骨隧道接觸部位可見到不太成熟的纖維軟骨連接，未見明顯的鈣化；實(shí)驗(yàn)組在腱骨界面之間有密集排列有序的Sharpey纖維出現(xiàn)，在移植肌腱和骨隧道頂端可見到大量排列有序的纖維以及纖維軟骨形成，見類似正常腱骨界面的四層結(jié)構(gòu)，骨髓道周邊新生骨明顯成熟，類似正常的ACL止點(diǎn)，此時(shí)腱骨愈合已趨于穩(wěn)定(見圖6)。

2.2生物力學(xué)檢測生物力學(xué)測試顯示術(shù)后第4、8周，兩組肌腱都能從骨隧道里拉脫出來；在第12周時(shí)，模型組仍被拉脫，實(shí)驗(yàn)組肌腱均不能再從隧道中被拉出，而是在肌腱中間斷裂。兩組肌腱最大抗拉脫強(qiáng)度在術(shù)后4周、8周、12周

注：T-肌腱；B-骨；FC-纖維軟骨　　　　　注：T-肌腱；B-骨；FC-纖維軟骨

各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均呈上升趨勢，且兩組不同時(shí)間點(diǎn)上數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=2.283，P<0.05)。兩組同期最大抗拉脫強(qiáng)度之間比較，實(shí)驗(yàn)組強(qiáng)度較大但無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t=2.581、1.895、1.415，P>0.05)。

表1　最大抗拉脫強(qiáng)度

3　討　　論

腱-骨愈合的組織學(xué)及生物力學(xué)的影響因素有很多，大量實(shí)驗(yàn)研究都表明一些生長因子例如骨形態(tài)發(fā)生蛋白，轉(zhuǎn)化因子和成纖維生長因子等對新骨形成及腱骨愈合都有促進(jìn)作用[6-8]，生長因子(transforming growth factor-β，TGF-β1)、粒細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte colony stimulating factor，G-CSF)等都可加快腱骨愈合的進(jìn)程。有學(xué)者在重建羊的ACL時(shí)在關(guān)節(jié)內(nèi)加入生長因子后4周時(shí)組織學(xué)檢查就可見Sharpey樣纖維，比不加入生長因子組早出現(xiàn)1周[9-11]。富含血小板血漿來自自體血液，制備方便并且富含血小板血漿的血小板含量是正常血液血小板含量的3～5倍，其中每微升中含有超過1百萬數(shù)量的血小板[12-14]，這些血小板在體內(nèi)激活后可以大量分泌血小板衍生生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子、血小板源性內(nèi)皮細(xì)胞生長因子和胰島素生長因子等[15-16]。這些生長因子存在于血小板的α顆粒中，被激活后可以刺激肌腱細(xì)胞擴(kuò)增，加快膠原的合成及血管再生。富血小板血漿是通過快速離心的方法從犬的全血中提取出來的富含血小板的血漿聚合物，包含有非常高濃度的血小板、纖維蛋白和白細(xì)胞。白細(xì)胞和血小板在儀器中離心時(shí)沉降的速度非常相近，所以離心后聚集在同一層面，所以富血小板血漿在富含血小板的同時(shí)還含有大量的自體白細(xì)胞。自體白細(xì)胞可以增強(qiáng)機(jī)體局部抗感染的能力，也可以清除變性的炎性組織從而有利于加快重建韌帶的腱骨愈合。富血小板血漿還含有大量的纖維連接蛋白、血小板反應(yīng)蛋白、骨連接蛋白、玻璃體連接蛋白等物質(zhì)，這些物質(zhì)已被證實(shí)在促進(jìn)腱骨愈合及刺激新生血管內(nèi)膜形成等方面有著重要的功能?？傊?，大量實(shí)驗(yàn)證實(shí)富血小板血漿通過刺激血小板中α顆粒釋放細(xì)胞因子，各種細(xì)胞因子相互作用后可以促進(jìn)肌腱細(xì)胞增殖、膠原合成及血管再生。富血小板血漿激活后可以形成大量纖維蛋白支架，可大量負(fù)載纖維母細(xì)胞和成骨細(xì)胞，生長因子結(jié)合于這些靶細(xì)胞外膜跨膜受體后，可誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)源性蛋白信號激活從而刺激纖維母細(xì)胞和成骨細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞增殖、膠原合成、基質(zhì)形成等肌腱骨愈合所需要的蛋白質(zhì)，最終加快腱骨愈合[17-19]。自體肌腱可以重建前交叉韌帶已被臨床和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)所證實(shí)，模型組的結(jié)果也證實(shí)了自體肌腱重建前交叉韌帶可以獲得較好的組織學(xué)及生物力學(xué)轉(zhuǎn)歸。但是為了加快腱骨愈合的速度，防止其早期在骨隧道中拉脫，我們在韌帶重建后加入富含血小板血漿，結(jié)果證實(shí)其能促進(jìn)腱骨的愈合，究其原因?yàn)椋篴)富血小板血漿源自自身全血無外源性物質(zhì)的排斥反應(yīng)；b)富血小板血漿不但含有各種高濃度的生長因子而且各種生長因子具有合適的配比能夠協(xié)調(diào)發(fā)揮作用；c)富血小板血漿可以使用凝血酶凝固，添加在骨隧道中不宜流失保證局部生長因子的濃度。

在本實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)組在添加富含血小板血漿后在術(shù)后4周時(shí)，腱骨界面纖維血管密集，排列有序并有Ⅱ型膠原沉積的軟骨樣細(xì)胞從骨向肌腱生長。術(shù)后8周膠原纖維生長成熟，可見腱骨的連續(xù)性，并在腱骨界面中心出現(xiàn)少量垂直排列的Sharpey樣纖維。術(shù)后12周時(shí)腱骨腱骨界面中心出現(xiàn)大量排列有序的Sharpey樣纖維和纖維軟骨樣連接，腱骨愈合已逐步趨于穩(wěn)定。生物力學(xué)測試顯示術(shù)后第4、8周兩組肌腱都能從骨隧道里拉脫出來，在第12周時(shí)，模型組仍能被拉脫，實(shí)驗(yàn)組肌腱均不能再隧道中被拉出，而是在肌腱中間斷裂，實(shí)驗(yàn)組獲得了更高的負(fù)荷強(qiáng)度且與模型組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)組在組織學(xué)和生物力學(xué)方面取得了比模型組更快的腱骨愈合速度，說明富含血小板血漿可以促進(jìn)腱骨愈合。

實(shí)驗(yàn)表明，自體肌腱重建前交叉韌帶術(shù)后移植物和骨隧道的愈合進(jìn)程大致為急性炎癥期、缺血壞死期、膠原纖維重構(gòu)期和慢性炎癥期等腱骨愈合過程，四期為連續(xù)的組織修復(fù)重建的過程。生物力學(xué)研究表明，在腱骨愈合早期，即ACL重建術(shù)后早期腱骨愈合界面強(qiáng)度較弱，直到第12周時(shí)才較為牢固，骨髓道內(nèi)添加富血小板血漿后加速了肌腱愈合的過程。

本研究存在以下缺點(diǎn)：a)動(dòng)物樣本量較??；b)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)不等同于人體內(nèi)的重建過程；c)染色手段較少；d)只進(jìn)行了大體觀察、組織學(xué)觀察及生物力學(xué)的測試沒有涉及到分子基因水平的研究。但是通過實(shí)驗(yàn)對比研究確實(shí)證明了應(yīng)用自體肌腱重建比格犬前交叉韌帶可以達(dá)到腱骨愈合，添加富血小板血漿可以促進(jìn)腱骨愈合，為臨床應(yīng)用提供一定的理論基礎(chǔ)。

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Reconstruction of Anterior Cruciate Ligament of Beagle Dogs by Autologous Tendon with Platelet-rich Plasma

Ma Zhengsheng，Zhang Lei，Yue Gang，etal

(Department of Orthopeadics，General Hospital of Kailuan，Tangshan063000，China)

ObjectiveTo research early histological and biomechanical outcome of reconstruction anterior cruciate ligament of beagle dogs by autologous tendon adding platelet-rich plasma.MethodsWe selected 36 healthy adult male beagle dogs and divided them into model group and research group. The same side tendons of the flexor digitorum longus (8 cm in length) were harvested in all dogs and folded in half to create a 4-cm-long double-stranded graft in two groups，but we added platelet-rich plasma when reconstruction of autologous tendon in research group. At the four，eight and twelve-week，6 beagle dogs drawing randomly from two groups were sacrificed and 12 knee joints were obtained including the femoral components and the anterior cruciate ligament. Eight of them were to study the biomechanics and the rest were for histological examination.At last，statistical analysis was carried out on the experimental data.ResultsFour-weeks after opertiaon，histological findings showed that there were the formation of fibrovascular in the tendon-bone interface in model group and there were more intensive fibrovascular and arranged in order associated with type Ⅱcollagen deposition of chondriod cells from bone growth to the tendon in the tendon-bone interface in research group. Eight-week after operation，there were formation of the new bone around tendons and the thickening of the bone tunnel wall.However，during this period，the collagen fibers machine were not sufficient and tendon continuity of bone could only occasionally be seen in model group. In research group，the collagen fibers grow to maturity and the continuity of the tendon bone and the small amounts of vertical arrangement of Sharpey-like fibers in the tendon bone interface center visible could be seen.At the twelve-week，the small amounts of vertical arrangement of Sharpey-like fibers could be seen in model group.In research group，the tendon bone healing process to enter a period of chronic inflammatory reaction and the tendon bone healing had gradually in a stable.The biomechanics research showed that the tendons of two groups could be pulled out from the bone tunne at the four-week and eight-week.At the twelve-week，the tendons in model group could be gradually pulled out of the tendon from the clamp.Whether，the tendons in research group could not be pulled out from the bone tunne and ruptured in the middle.ConclusionThe reconstruction of anterior cruciate ligament can be realized by applying autologous tendon and achieve tendon bone healing. In addition，autologous tendon adding platelet-rich plasma can promote tendon-bone healing.

anterior cruciate ligament；platelet-rich plasma；reconstruction of ligment；biomechanics

1008-5572(2016)05-0420-05

R684

A

2015-07-06

馬震勝(1979- )，男，主治醫(yī)師，開灤總醫(yī)院骨科，063000。