HER-2與Ki-67檢測(cè)對(duì)直腸癌惡性程度和預(yù)后判定的價(jià)值陳麗霞

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HER-2與Ki-67檢測(cè)對(duì)直腸癌惡性程度和預(yù)后判定的價(jià)值陳麗霞

目的探討HER-2與Ki-67檢測(cè)在判定直腸癌惡性程度和預(yù)后的臨床應(yīng)用價(jià)值。方法選取已經(jīng)確診的127例直腸癌患者的病理切除組織及40例癌旁組織為研究對(duì)象，采用免疫組化的方法檢測(cè)HER-2與Ki-67在直腸癌組織中及癌旁組織中的表達(dá)情況，并分析HER-2、Ki-67陽(yáng)性表達(dá)情況與直腸癌病理特征的關(guān)系以及兩者的相關(guān)性。結(jié)果HER-2與Ki-67在直腸癌中的表達(dá)陽(yáng)性率均高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。HER-2在不同腫瘤分化程度、年齡、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中呈現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；在不同性別、年齡、腫瘤大小、腫瘤分期中無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。Ki-67的表達(dá)在不同腫瘤的分化程度、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤大小中呈現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；HER-2、Ki-67陽(yáng)性患者的無(wú)病進(jìn)展期和總生存期均短于影響的患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。在不同性別、年齡中無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。經(jīng)相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，HER-2與Ki-67在直腸癌中的表達(dá)無(wú)關(guān)聯(lián)（P＞0.05）。結(jié)論HER-2與Ki-67與直腸癌的發(fā)展有密切關(guān)系，兩組高表達(dá)往往預(yù)示著惡性程度高，預(yù)后差，聯(lián)合檢測(cè)對(duì)估算預(yù)后有重要價(jià)值。

HER-2；Ki-67；直腸癌；免疫組化；惡性程度；預(yù)后

直腸癌是消化道惡性腫瘤之一，臨床表現(xiàn)為膿血便、便秘、腹瀉等，嚴(yán)重危害人類的健康。雖然臨床上治療手段不斷更新，但其發(fā)病率和死亡率仍居惡性腫瘤前列。腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移是影響患者預(yù)后的重要因素［1］。直腸癌的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后尚不十分清楚。人類表皮生長(zhǎng)因子受體2（HER-2）能夠反映惡性腫瘤細(xì)胞增殖的情況，與多種腫瘤的發(fā)生、生物學(xué)行為和預(yù)后有關(guān)。Ki-67為敏感的細(xì)胞核增殖標(biāo)志物，Ki-67抗原是反映細(xì)胞群體增殖活性的可靠指標(biāo)。本研究旨在探討HER-2與K i-67檢測(cè)在判定直腸癌惡性程度和預(yù)后的臨床價(jià)值，以為臨床診斷和治療提供可靠指標(biāo)。

資料與方法

一、一般資料

選取我院2014年1月至2015年10月收治的127例直腸癌患者的病理標(biāo)本為研究對(duì)象，納入標(biāo)準(zhǔn)：①均確診為原發(fā)性直腸癌，有明確的病理學(xué)診斷；②采用直腸癌根治術(shù)治療，術(shù)前未行放化療；③簽署知情同意書；④臨床資料完整；⑤癌組織及癌旁組織為經(jīng)內(nèi)鏡活檢或手術(shù)切除標(biāo)本。排除標(biāo)準(zhǔn)：①急性感染、炎癥性疾??；②肥胖、糖尿??；③神經(jīng)系統(tǒng)疾??；④有凝血功能障礙者。共納入127例直腸癌患者的病理標(biāo)本，其中男69例，女58例，年齡41～85歲。

二、實(shí)驗(yàn)試劑

鼠抗人Ki-67、HER-2單克隆抗體及Envision即用型試劑盒均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司，蘇木精購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司，無(wú)水乙醇、10%的多聚甲醛、70%的酒精溶液、80%的酒精溶液、95%的酒精溶液、二甲苯、1%伊紅酒精溶液、1%鹽酸乙醇溶液等購(gòu)自山東大學(xué)齊魯醫(yī)院臨床基礎(chǔ)研究所。

三、方法

1.一般資料的分析

所有研究病例均由高年資病理醫(yī)師對(duì)染色切片進(jìn)行組織學(xué)觀察和復(fù)診，對(duì)直腸癌患者的臨床及病理因素進(jìn)行分析，包括年齡：≤60歲、＞60歲病理分期：參照美國(guó)國(guó)立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（NCCN）指南2012分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分期，入組患者均選取Ⅰ期Ⅱ期和Ⅲ期分期者；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況：有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；浸潤(rùn)深度分為：黏膜下層及肌層、全層及漿膜外；Dukes分期：分為A、B、C、D四期。腫瘤大?。耗[瘤直徑≤5 cm，＞5 cm；組織學(xué)分級(jí)：根據(jù)WHO分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)將其分為高分化、中分化、低分化。生存期：PFS（無(wú)進(jìn)展生存期）；OS總生存期。

2.免疫組化染色法

將所獲取病理組織經(jīng)4%甲醛固定48 h后，采用石蠟包埋，標(biāo)本經(jīng)4μm連續(xù)切片，室溫放置30m in后，切片常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度酒精水化，消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性。HER-2用EDTA修復(fù)液，購(gòu)自武漢博士德生物有限公司，高壓加熱5m in修復(fù)抗原，K i-67采用檸檬酸鹽緩沖液高溫加熱3min修復(fù)抗原，Ki-67與抗體稀釋劑以1：200混合配制，HER-2為即用型，無(wú)需配制。將配制好的Ki-67抗原及即用型HER-2滴加在切片上，4℃過(guò)夜，采用免疫組織化學(xué)Envision二步法染色，DBA顯色后，顯微鏡下觀察顯色結(jié)果，蘇木精復(fù)染，脫水，透明，中性樹膠封固。用已知直腸癌組織陽(yáng)性切片作為陽(yáng)性對(duì)照，PBS緩沖液代替一抗作陰性對(duì)照。隨機(jī)選擇5個(gè)具有代表意義的高倍視野（×400），每個(gè)視野中計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞的陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)，判斷表達(dá)程度。Ki-67定位于細(xì)胞核，陽(yáng)性細(xì)胞染色呈現(xiàn)棕黃色或棕褐色。HER-2定位于細(xì)胞膜和胞漿，陽(yáng)性細(xì)胞染色呈現(xiàn)棕黃色或棕褐色。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS15.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)數(shù)資料以%表示，統(tǒng)計(jì)分析應(yīng)用Fisher確切概率法，相關(guān)性分析采料用speannan等級(jí)相關(guān)檢驗(yàn)。以P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、HER-2的表達(dá)情況

HER-2的蛋白表達(dá)位于細(xì)胞膜，在惡性腫瘤組織中表達(dá)水平較高，呈棕黃/棕褐色顆粒狀，腫瘤間質(zhì)均不著色，見(jiàn)圖1。HER-2在癌旁組織表達(dá)較為微弱。40例癌旁組織中僅有1例呈現(xiàn)過(guò)表達(dá)，陽(yáng)性率為2.5%（1/40）。在直腸癌中有69例陽(yáng)性表達(dá)，陽(yáng)性率為54.3%（69/127）。HER-2在直腸癌組織中的表達(dá)顯著高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表1。

圖1　 HER-2在結(jié)直腸癌中的表達(dá)（×400）

表1　 HER-2及Ki-67在直腸癌腫瘤組織以及癌旁組織中的表達(dá)情況［n（%）］

二、Ki-67的表達(dá)情況

Ki-67為增殖指數(shù)，表達(dá)于細(xì)胞周期不同階段，蛋白表達(dá)位于細(xì)胞膜，在惡性腫瘤組織中表達(dá)水平較高，呈棕黃色或棕褐色顆粒，反應(yīng)腫瘤細(xì)胞的增殖狀況，見(jiàn)圖2。Ki-67在癌旁組織中的表達(dá)較微弱，有少數(shù)癌旁組織的腺體頸的少量細(xì)胞核染色，有10例呈現(xiàn)陽(yáng)性表達(dá)，陽(yáng)性率為25.0%（10/40）。在直腸癌中有95例陽(yáng)性表達(dá)，陽(yáng)性率為74.8%（95/127）。Ki-67在直腸癌組織中的表達(dá)顯著高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表1。

圖2　 Ki-67在結(jié)直腸癌中的表達(dá)（×400）

三、HER-2與K i-67的表達(dá)與直腸癌病理特征的關(guān)系分析

HER-2在不同腫瘤分化程度、年齡、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中呈現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；在不同性別、年齡、腫瘤大小、腫瘤分期中無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。Ki-67的表達(dá)在不同腫瘤的分化程度、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤大小、腫瘤分期中呈現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；在不同性別、年齡無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表2。

表2　 HER-2與Ki-67的表達(dá)與直腸癌病理特征的關(guān)系分析

四、HER-2和Ki-67的表達(dá)與直腸癌患者生存期的關(guān)系

隨訪至2015年12月為止，HER-2表達(dá)陽(yáng)性的患者無(wú)進(jìn)展生存期、總生存期分別（4.21±1.55）月、（9.23±1.85）月，短于陰性患者的（5.35±1.52）月、（10.43±1.39）月，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。Ki-67表達(dá)陽(yáng)性的患者吳冰進(jìn)展生存期、總生存期分別為（4.02±1.21）月、（9.12±1.77）月，短于陰性患者的（5.17±1.08）月、（10.37±1.84）月，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

五、HER-2與Ki-67在直腸癌中表達(dá)的相關(guān)性分析

經(jīng)相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，HER-2與Ki-67在直腸癌中的表達(dá)無(wú)關(guān)聯(lián)（P＞0.05），見(jiàn)表3。

表3　 HER-2與Ki-67在直腸癌中表達(dá)的相關(guān)性分析

討論

直腸癌是比較常見(jiàn)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，其發(fā)病率占到惡性腫瘤的第3位，死亡率的第5位。近年來(lái)，我國(guó)直腸癌的發(fā)病率有逐漸增加的趨勢(shì)。與其他惡性腫瘤一樣，直腸癌也以侵襲、轉(zhuǎn)移為重要特征，這是導(dǎo)致患者死亡最重要的原因之一。直腸癌的發(fā)生是一個(gè)多基因參與、多步驟的復(fù)雜生物學(xué)過(guò)程，主要包括組織上皮細(xì)胞分化、增殖、存活和凋亡機(jī)制的紊亂。從分子生物學(xué)角度分析，在直腸癌多階段發(fā)展過(guò)程中，伴隨著一系列的特異和積累的遺傳學(xué)改變，如原癌基因突變、激活和抑癌基因的失活。HER-2與Ki-67在腫瘤細(xì)胞增殖中起著重要作用，近年來(lái)有研究顯示，HER-2與K i-67蛋白的表達(dá)程度對(duì)指導(dǎo)臨床治療以及估計(jì)預(yù)后有重要的檢測(cè)價(jià)值［3］。

HER-2屬于酪氨酸激酶Ⅰ型受體家族，是一種重要的原癌基因，定位于人類染色體區(qū)帶，屬于生長(zhǎng)因子受體家族，具有絡(luò)氨酸蛋白激酶活性。正常的情況下該基因處于失活狀態(tài)，可檢測(cè)到少量表達(dá)，可調(diào)節(jié)正常的細(xì)胞［4］。當(dāng)受到某些體內(nèi)外的因素刺激后，HER-2受體表達(dá)增多，具有抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，促進(jìn)腫瘤血管生成及加速腫瘤細(xì)胞侵襲力的作用［5］。HER-2癌基因在卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌以及非小細(xì)胞肺癌中均有擴(kuò)增或過(guò)度表達(dá)。但HER-2的表達(dá)與結(jié)腸癌的生物學(xué)行為間的研究，目前還存在分歧。有文獻(xiàn)報(bào)道，HER-2蛋白在結(jié)直腸癌中的表達(dá)很低，與腫瘤浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移、預(yù)后等無(wú)相關(guān)性。而一些文獻(xiàn)報(bào)道，HER-2蛋白在結(jié)直腸癌中存在較高的陽(yáng)性表達(dá)率，有文獻(xiàn)報(bào)道為90%，并能反應(yīng)腫瘤的浸潤(rùn)、分化、轉(zhuǎn)移、預(yù)后等情況［6］。本研究結(jié)果顯示，HER-2在直腸癌中的陽(yáng)性表達(dá)率為54.3%顯著高于癌旁組織。而且結(jié)果還顯示，HER-2在不同腫瘤分化程度、年齡、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中呈現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；這表明HER-2的高表達(dá)往往預(yù)示著癌組織分化程度越差、浸潤(rùn)程度越深、侵襲性越強(qiáng)和轉(zhuǎn)移性越強(qiáng)，提示預(yù)后越差對(duì)各種治療的抵抗性越強(qiáng)。

Ki-67是目前應(yīng)用最為廣泛的標(biāo)記細(xì)胞增殖活性的指標(biāo)，主要定位于細(xì)胞核，其蛋白定位獨(dú)特，表達(dá)在所有活動(dòng)期的細(xì)胞中，是惡性腫瘤重要的參考指標(biāo)之一。Ki-67蛋白質(zhì)定位于細(xì)胞核內(nèi)，在增殖細(xì)胞的G1、S、G2和M期表達(dá)，G0期不表達(dá)。Ki-67參與細(xì)胞周期的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，而且其半衰期較短，理論上，可作為評(píng)估腫瘤細(xì)胞增殖活性、惡性潛能、預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)最可靠的指標(biāo)。有研究顯示，Ki-67的表達(dá)能夠可靠而迅速的反應(yīng)惡性腫瘤的細(xì)胞增殖率，其表達(dá)量的高低對(duì)腫瘤的治療及轉(zhuǎn)移有著重要的臨床意義［7］。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，Ki-67在結(jié)直腸癌中的表達(dá)顯著高于癌旁組織，與術(shù)后患者的存活時(shí)間呈負(fù)相關(guān)性［8］。本研究結(jié)果也證實(shí)了Ki-67在直腸癌中的表達(dá)高于癌旁組織（74.8%vs25.0%）。而且結(jié)果還顯示，Ki-67的表達(dá)在不同腫瘤的分化程度、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤大小、腫瘤分期中呈現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這表明Ki-67的高表達(dá)往往預(yù)示著腫瘤越大、癌組織分化程度越差、浸潤(rùn)程度越深、侵襲性越強(qiáng)和轉(zhuǎn)移性越強(qiáng)。

本研究結(jié)果還顯示，HER-2與K i-67在直腸癌中的表達(dá)在統(tǒng)計(jì)學(xué)上缺乏相關(guān)性，與王玉環(huán)等的研究一致［9］，但有研究發(fā)現(xiàn)兩者在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)一致，有正相關(guān)性［10］。這還有待進(jìn)一步研究。HER-2與K i-67對(duì)細(xì)胞的增殖有重要作用，提示可作為結(jié)直腸癌診斷的生物學(xué)參考指標(biāo)。隨著和直腸癌分子生物學(xué)研究的不斷進(jìn)展，靶向治療已經(jīng)成為直腸癌個(gè)體化治療的重點(diǎn)。HER-2與K i-67在直腸癌中的表達(dá)特點(diǎn)為靶向治療提供了新思路。綜上所述，HER-2與Ki-67與直腸癌的發(fā)生和發(fā)展有密切關(guān)系，兩組高表達(dá)往往預(yù)示著惡性程度高，預(yù)后差，聯(lián)合檢測(cè)能夠用于判別癌的惡性程度，對(duì)估算預(yù)后有重要價(jià)值。

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（本文編輯：崔曉丙）

10.3969/j.issn.1672-2159.2016.01.025

435002湖北省黃石市第二醫(yī)院病理科

3.免疫組化的結(jié)果判定

由3位病理醫(yī)生對(duì)免疫組化染色進(jìn)行評(píng)價(jià)，陽(yáng)染色強(qiáng)度按下列標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分：無(wú)色為0分；染色弱（淺棕黃色）但明顯強(qiáng)于陰性對(duì)照為1分；染色清晰（棕黃色）為2分；染色強(qiáng)（棕褐色）為3分。陽(yáng)性細(xì)胞率≤25%為1分，陽(yáng)性細(xì)胞率26%～50%為2分，51%～75%為2分，＞75%為3分；其中陽(yáng)性細(xì)胞率＞10%視為異常表達(dá)。將以上兩項(xiàng)得分相加，0分判為陰性（-），1～2分判為弱陽(yáng)性（+），3～4分判為中度陽(yáng)性（++），5～6為強(qiáng)陽(yáng)性（+++）［2］。

（2015-11-27）