不同劑量肝素對(duì)高糖誘導(dǎo)后的人腹膜間皮細(xì)胞水通道蛋白1表達(dá)的影響

李鴿，趙久陽(yáng)，任澤銀，肖偉，桂永豐（.湖南省常德市第一人民醫(yī)院 腎病內(nèi)科，湖南 常德，45000；.大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 腎內(nèi)科，遼寧 大連 6000）

論著

不同劑量肝素對(duì)高糖誘導(dǎo)后的人腹膜間皮細(xì)胞水通道蛋白1表達(dá)的影響

李鴿1，趙久陽(yáng)2，任澤銀1，肖偉1，桂永豐1
（1.湖南省常德市第一人民醫(yī)院 腎病內(nèi)科，湖南 常德，415000；2.大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 腎內(nèi)科，遼寧 大連 116000）

目的研究不同劑量肝素對(duì)高糖誘導(dǎo)后的人腹膜間皮細(xì)胞水通道蛋白1（AQP1）mR NA和蛋白表達(dá)水平的影響。方法分離并培養(yǎng)人腹膜間皮細(xì)胞，并用高糖（2.5%葡萄糖溶液）誘導(dǎo)4、8、12和24h；采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（R T-PCR）檢測(cè)AQP1 mR NA的表達(dá)水平，從而確定表達(dá)量達(dá)峰值的誘導(dǎo)時(shí)間。將不同劑量的肝素添加至人腹膜間皮細(xì)胞培養(yǎng)液中，并經(jīng)2.5%高糖溶液誘導(dǎo)后，用R T-PCR及免疫組織化學(xué)法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組AQP1 mR NA和蛋白表達(dá)水平。結(jié)果與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組AQP1 mR NA和蛋白表達(dá)明顯增加，且mR NA表達(dá)呈時(shí)間依賴(lài)性，且在高糖誘導(dǎo)24h時(shí)表達(dá)量達(dá)峰值，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；R T-PCR與免疫組織化學(xué)結(jié)果具有一致性，均提示AQP1mR NA和蛋白表達(dá)水平在2.5%葡萄糖+1.5×10-2mg/ml肝素組呈現(xiàn)明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；免疫組織化學(xué)染色提示2.5%葡萄糖+1.5×10-2mg/ml肝素組細(xì)胞可見(jiàn)胞核及胞漿有空泡樣改變。結(jié)論肝素在高糖環(huán)境中誘導(dǎo)24h后可顯著增加人腹膜間皮細(xì)胞水通道蛋白AQP1 mR NA和蛋白的表達(dá)，且大劑量的肝素能使胞漿及胞核出現(xiàn)明顯的空泡樣改變。

肝素；人腹膜間皮細(xì)胞；水通道蛋白1

腹膜透析是終末期腎衰竭患者可供選擇的治療方法之一，但臨床上腹膜透析患者常發(fā)生腹膜透析管堵塞，為解決該問(wèn)題，體內(nèi)外抗凝劑肝素常添加于腹膜透析液中。有研究顯示，大劑量肝素添加于含葡萄糖的腹膜透析液中可使腹膜透析的超濾量增加[1]，但肝素是否通過(guò)影響腹膜間皮細(xì)胞中水通道蛋白1 （aquaporin 1，AQP1）的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的，國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道，故本實(shí)驗(yàn)探討不同劑量肝素對(duì)高糖誘導(dǎo)后人腹膜間皮細(xì)胞水通道蛋白AQP1表達(dá)的影響。

1　材料與方法

1.1試劑與儀器

1.1.1主要試劑TRIzol試劑盒為美國(guó)Invitrogen公司產(chǎn)品，逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）試劑盒及焦碳酸二乙酯（diethy pyrocarbonate，DEPC）水為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品，鼠抗人細(xì)胞角蛋白單抗、二氨基聯(lián)苯胺（Diaminobenzidine，DAB）顯色液、免疫組織化學(xué)法SP試劑盒，均為北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，鼠抗人波形蛋白抗體、抗白細(xì)胞CD45抗體、抗第Ⅷ因子相關(guān)抗原抗體均為武漢博士德生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，AQP1一抗為美國(guó)Santa Cruz公司產(chǎn)品，細(xì)胞消化液[0.125%胰蛋白酶-0.02%乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）-2Na]為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品，1640培養(yǎng)液為美國(guó)Invitrogen公司產(chǎn)品，胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）為天津TBD公司產(chǎn)品，D-葡萄糖、氯仿、異丙醇等分析純購(gòu)自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，肝素鈉注射液（12 500 u/2 ml，12500u相當(dāng)于100 mg）購(gòu)自江蘇萬(wàn)邦生化醫(yī)藥股份有限公司，PBS液、D-Hank平衡鹽溶液為本實(shí)驗(yàn)室自行配置，過(guò)濾滅菌分裝，室溫保存。

1.1.2主要儀器二氧化碳CO2培養(yǎng)箱及高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)為德國(guó)賀力式公司生產(chǎn)，垂直層流潔凈工作臺(tái)為上海上凈凈化設(shè)備有限公司生產(chǎn)，紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（型號(hào)UV-9100）為北京瑞利分析儀器公司生產(chǎn)，紫外分析儀（型號(hào)WFH-201）購(gòu)自溫州市孚華分析儀器廠，倒置相差顯微鏡購(gòu)自日本奧林巴斯公司，凝膠成像分析系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Pharmacia Biotech公司，水平電泳槽購(gòu)自北京市六一儀器廠，PCR儀購(gòu)自美國(guó)Biometra公司。

1.2人腹膜間皮細(xì)胞的分離、培養(yǎng)與鑒定

本實(shí)驗(yàn)從連續(xù)性腹膜透析患者透出液中分離并提取人腹膜間皮細(xì)胞，無(wú)菌條件下收集患者流出液標(biāo)本，4℃、1200r/min離心5min。D-Hank平衡鹽溶液洗滌沉淀3次，將細(xì)胞接種于含10%（V/V）胎牛血清的1640培養(yǎng)液中，置于二氧化碳CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)。每3天換液1次。原代培養(yǎng)的人腹膜間皮細(xì)胞最初呈多形性，星狀及梭狀占多數(shù)。待細(xì)胞生長(zhǎng)融合后形成典型的鋪路石樣外觀（見(jiàn)圖1），這與周循等人描述的人腹膜間皮細(xì)胞形態(tài)一致[2]。用0.125%胰蛋白酶-0.01%EDTA 2 ml混合液消化細(xì)胞，吸管吹打均勻，使細(xì)胞密度保持在1×105～1× 106個(gè)/ml。第2代細(xì)胞用于形態(tài)學(xué)及免疫組織化學(xué)鑒定，第3代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。免疫組織化學(xué)法顯示，抗細(xì)胞角蛋白抗體陽(yáng)性、抗波形蛋白抗體染色陽(yáng)性（見(jiàn)圖2、3），抗第Ⅷ因子抗體和抗白細(xì)胞CD45抗體染色陰性（見(jiàn)圖4、5），由此可排除血管內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等[3-4]，證明其是腹膜間皮細(xì)胞。

圖1　人腹膜間皮細(xì)胞 （×400）

圖2　細(xì)胞角蛋白陽(yáng)性 （×100）

圖3　細(xì)胞波形蛋白陽(yáng)性 （×100）

圖4　第Ⅷ因子相關(guān)抗原陰性 （×100）

圖5　白細(xì)胞CD45抗原陰性 （×100）

1.3經(jīng)2.5%高糖誘導(dǎo)后AQP1 mRNA表達(dá)水平呈時(shí)間依賴(lài)性

將3次傳代后的人腹膜間皮細(xì)胞均勻接種于6孔培養(yǎng)板上，用無(wú)血清的1640培養(yǎng)液同步消化24 h。無(wú)菌稱(chēng)取葡萄糖2.5 g，溶于100 ml無(wú)菌三蒸水中，配置成2.5%高糖溶液。將2.5%高糖添加于細(xì)胞培養(yǎng)液中，分別誘導(dǎo)4、8、12和24 h，比較誘導(dǎo)不同時(shí)間后AQP1 mRNA的表達(dá)水平。提取細(xì)胞總RNA，在6孔細(xì)胞板內(nèi)加入1 ml TRIzol，輕輕吹打數(shù)次，收集細(xì)胞于2 ml離心管內(nèi)（德國(guó)Eppendorf公司），室溫靜置5min。加入氯仿200μl，振蕩充分搖勻，室溫靜置5min，4℃、1000r/min離心10min。加入與上清液等體積的異丙醇，上下混勻，室溫靜置5min，4℃、1200r/min離心10min。用75%乙醇1 ml清洗沉淀，4℃、1 200 r/min離心5 min，棄上清留沉淀，室溫干燥。用8μl DEPC處理水溶解沉淀。取2μl RNA樣本，在紫外分光光度計(jì)下測(cè)量260和280nm下光密度（optical density，OD）值，A260/A280值在1.8～2.0。凝膠成像儀下可見(jiàn)28、18和5S 3條清晰的RNA帶，說(shuō)明RNA無(wú)降解。cDNA的合成參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作程序進(jìn)行。反應(yīng)體系為10μl，反應(yīng)條件為：37℃預(yù)變性10 min，42℃變性60 min，99℃延伸5min。引物序列從Genebank中查閱，采用Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì)引物。β-actin（531bp）：正向引物5'-CCCTGGACTTCGAGCAAGAGAT-3'，反向引物5'-GTTTTCTGCGCAAGTTAGG-3'；AQP1 （336 bp）：正向引物5'-AGATCAGCATCTTCCGTG-3'，反向引物5'-AGTTGTGTGTGATCACCG-3'；PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min；55℃變性1 min；72℃延伸1min。反應(yīng)后取5μl PCR產(chǎn)物在1.2%瓊脂糖凝膠上電泳，凝膠成像分析系統(tǒng)中觀察并拍照。對(duì)圖像中的內(nèi)參（β-actin）和目的基因（AQP1）的DNA條帶進(jìn)行光密度分析，用AQP1光密度值/β-actin光密度值表示目的基因相對(duì)表達(dá)量。每組測(cè)3個(gè)數(shù)值，求平均數(shù)，然后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.4RT-PCR檢測(cè)不同實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞AQP1基因表達(dá)水平

用一定劑量的無(wú)菌注射用水稀釋肝素鈉注射液（50 mg/ml），配置不同濃度的肝素溶液，并加入到細(xì)胞培養(yǎng)液中，用2.5%葡萄糖誘導(dǎo)細(xì)胞24 h；按照不同實(shí)驗(yàn)要求隨機(jī)分為以下5組：①無(wú)葡萄糖無(wú)肝素對(duì)照組（對(duì)照組）；②2.5%葡萄糖組；③2.5%葡萄糖+ 2.5×10-3mg/ml肝素組；④2.5%葡萄糖+5.0×10-3mg/ml肝素組；⑤2.5%葡萄糖+1.5×10-2mg/ml肝素組。細(xì)胞RNA的提取、逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以及PCR擴(kuò)增方法同1.3所述。

1.5免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)AQP1蛋白表達(dá)

收集細(xì)胞，PBS沖洗3次，多聚甲醛冰上固定30min。PBS再次沖洗3次。自然風(fēng)干后，用3%過(guò)氧化氫H2O2室溫避光孵育30 min，PBS沖洗3次。血清封閉非特異性抗原后，加Ⅰ抗AQP1多克隆抗體，4℃孵育過(guò)夜。加入生物素化Ⅱ抗，37℃孵育30min，PBS洗3次，加入鏈酶親合素-生物素-堿性磷酸酶復(fù)合物，37℃孵育30min，PBS洗3次。滴加DAB顯色液，鏡下觀察至出現(xiàn)棕黃色陽(yáng)性信號(hào)后蒸餾水沖洗終止反應(yīng)。蘇木素復(fù)染，碳酸鋰水溶液返藍(lán)，梯度乙醇逐級(jí)脫水，透明，過(guò)二甲苯溶液，中性樹(shù)膠封片，自然風(fēng)干。每張切片隨機(jī)取5個(gè)視野光鏡拍照，用Image ProPlus6.0圖像分析軟件測(cè)出OD值，并計(jì)算平均光密度。著色越深，則OD值越大，表明該蛋白表達(dá)水平越高，比較對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組不同劑量肝素對(duì)高糖誘導(dǎo)24 h后AQP1的蛋白表達(dá)水平差異是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1RT-PCR反應(yīng)

經(jīng)2.5%葡萄糖誘導(dǎo)4、8、12和24 h后，人腹膜間皮細(xì)胞水通道蛋白AQP1的mRNA表達(dá)水平呈現(xiàn)出時(shí)間依賴(lài)性，誘導(dǎo)4、8、12和24 h后AQP1 mRNA表達(dá)比誘導(dǎo)前有上調(diào)（F=11.392，P=0.004），提示高糖可上調(diào)AQP1的表達(dá)。誘導(dǎo)24h時(shí)mRNA表達(dá)量比誘導(dǎo)4、8和12h增加（F=7.513，P=0.035），而誘導(dǎo)4、8和12 h組間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.121，P=0.623）（見(jiàn)圖6）。

2.5%葡萄糖組、2.5%葡萄糖+2.5×10-3mg/ml肝素組、2.5%葡萄糖+5.0×10-3mg/ml肝素組以及2.5%葡萄糖+1.5×10-2mg/ml肝素組與對(duì)照組比較，AQP1的mRNA表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F= 15.638，P=0.002）。而2.5%葡萄糖+2.5×10-3mg/ml肝素組與2.5%葡萄糖+5.0×10-3mg/ml肝素組中AQP1 mRNA的表達(dá)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F= 1.085，P=0.533），而2.5%葡萄糖+1.5×10-2mg/ml肝素組較前3組可明顯增加腹膜間皮細(xì)胞上AQP1 mRNA的表達(dá)（F=10.473，P=0.027）（見(jiàn)圖7）。

2.2免疫組織化學(xué)法

實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組中均有AQP1蛋白表達(dá)（見(jiàn)圖8、9）。與對(duì)照組比較，2.5%葡萄糖組、2.5%葡萄糖組+不同劑量肝素組的AQP1蛋白陽(yáng)性表達(dá)明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=9.367，P=0.003），胞核上亦可見(jiàn)棕黃色深染顆粒；2.5%葡萄糖+1.5×10-2mg/ml肝素組與3組的AQP1表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=7.421，P=0.016）；而2.5%葡萄糖組、2.5%葡萄糖+2.5×10-3mg/ml肝素組、2.5%葡萄糖+5.0×10-3mg/ml肝素組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=2.540，P=0.297）（見(jiàn)圖10～13）。2.5%葡萄糖+1.5×10-2mg/ml肝素組免疫組織化學(xué)染色可見(jiàn)胞核及胞漿有空泡樣變，而2.5%葡萄糖+常規(guī)劑量肝素組胞漿及胞核未見(jiàn)明顯空泡樣變。

圖6　AQP1 mRNA經(jīng)高糖誘導(dǎo)后的時(shí)間依賴(lài)表達(dá)

圖7　不同劑量肝素+2.5%葡萄糖對(duì)AQP1 mRNA表達(dá)的影響

圖8　對(duì)照組AQP1蛋白表達(dá)陽(yáng)性 （×400）

圖9　2.5%葡萄糖組AQP1蛋白表達(dá)陽(yáng)性 （×400）

圖10　2.5%葡萄糖+2.5×10-3mg/ml肝素組AQP1蛋白表達(dá)陽(yáng)性 （×400）

圖11　2.5%葡萄糖+5.0×10-3mg/ml肝素組AQP1蛋白表達(dá)陽(yáng)性 （×400）

圖12　2.5%葡萄糖+1.5×10-2mg/ml肝素組AQP1蛋白表達(dá)陽(yáng)性 （×400）

圖13　不同劑量肝素+2.5%葡萄糖對(duì)AQP1蛋白表達(dá)的影響

3　討論

一直以來(lái)，傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為腹膜透析中水分子的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)方式是簡(jiǎn)單擴(kuò)散，但Agre等[5]發(fā)現(xiàn)了28kD通道整合膜蛋白，提出水轉(zhuǎn)運(yùn)方式是通過(guò)通道蛋白介導(dǎo)的。Rippe等[6]首次運(yùn)用大孔、小孔、超微孔的3孔模型對(duì)水的跨膜轉(zhuǎn)進(jìn)行了解釋。超微孔（3～）對(duì)水分子具有選擇通透性，水通道蛋白（aquaporins，AQPs）為超微孔的對(duì)應(yīng)物，可選擇性地跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)水分子及甘油、尿素等某些小分子溶質(zhì)。水通道蛋白廣泛存在于動(dòng)植物及微生物的細(xì)胞膜上，迄今為止已發(fā)現(xiàn)200余種，在哺乳動(dòng)物中，已克隆并鑒定出13種，分為AQP0～AQP12[7]。

在某些特定條件下，水通道蛋白的表達(dá)受到激素、滲透壓改變和某些藥物的影響[8]。Tang等[9]提出AQP1存在于腹膜間皮細(xì)胞上，滲透劑葡萄糖可誘導(dǎo)其轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。葡萄糖可引起人腹膜細(xì)胞形態(tài)改變，如微絨毛倒伏、缺失、細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的線(xiàn)粒體出現(xiàn)空泡樣變等[10]。Yang等[11]用氯化汞HgCl2阻斷大鼠腹膜細(xì)胞上的AQP1，66%水分子轉(zhuǎn)運(yùn)受到抑制。腹膜間皮細(xì)胞水通道蛋白AQP1數(shù)量、結(jié)構(gòu)或功能的改變對(duì)腹膜透析的水超濾有一定影響。陳生曉等[12]認(rèn)為高糖腹膜透析液可以促進(jìn)腹膜間皮細(xì)胞AQP1的表達(dá)。李正紅等[13]認(rèn)為高糖能增加AQP1從胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到胞膜上，從而增加該細(xì)胞對(duì)水的通透性。這種轉(zhuǎn)移機(jī)制的存在提示AQP1在細(xì)胞內(nèi)分布的改變可能也與腹膜超濾衰竭的發(fā)生有關(guān)。

長(zhǎng)期的腹膜透析使腹膜長(zhǎng)期暴露在非生理性的高糖透析液中，可引起腹膜組織纖維化以致超濾衰竭，使患者被迫放棄透析治療[14]。臨床上肝素主要用于預(yù)防腹膜透析管堵塞。肝素作為抗凝劑能夠通過(guò)抑制腹腔內(nèi)纖維蛋白的聚集而間接減少腹膜纖維化的發(fā)生。同時(shí)有擴(kuò)張血管的作用，增加腹膜的通透性，從而增加溶質(zhì)的濾過(guò)。Kar等[15]的研究顯示，高糖誘導(dǎo)的AQP1主要表達(dá)在胞漿及胞膜上，胞核亦有少量陽(yáng)性表達(dá)。

本實(shí)驗(yàn)顯示，無(wú)葡萄糖無(wú)肝素對(duì)照組中胞膜及胞漿AQP1表達(dá)陽(yáng)性而胞核陰性，而2.5%葡萄糖組及2.5%葡萄糖+不同劑量肝素組與對(duì)照組比較，AQP1表達(dá)明顯上調(diào)，同時(shí)顯示胞核亦有陽(yáng)性表達(dá)，尤以1.5×10-2mg/ml肝素+2.5%葡萄糖組更為明顯（P<0.05），提示肝素和葡萄糖可協(xié)同上調(diào)腹膜間皮細(xì)胞水通道蛋白AQP1的表達(dá)。本研究的RT-PCR及免疫組織化學(xué)結(jié)果一致顯示，與無(wú)糖無(wú)肝素的對(duì)照組比較，2.5%葡萄糖組及2.5%葡萄糖+不同濃度肝素組均能增加AQP1 mRNA和蛋白的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；且AQP1 mRNA和蛋白表達(dá)水平在2.5%葡萄糖+1.5×10-2mg/ml肝素組呈現(xiàn)明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。2.5%葡萄糖+1.5×10-2mg/ml肝素組可觀察到人腹膜細(xì)胞胞核及胞漿有空泡樣改變。由此推測(cè)1.5×10-2mg/ml肝素和2.5%葡萄糖對(duì)腹膜透析中腹膜間皮細(xì)胞可能存在一定程度的損傷作用，這一損傷的具體過(guò)程及分子機(jī)制有待深入研究。由此可進(jìn)一步推測(cè)人腹膜間皮細(xì)胞中AQP1表達(dá)或功能的改變可影響跨腹膜水轉(zhuǎn)運(yùn)，甚至可導(dǎo)致腹膜超濾衰竭的發(fā)生。

總之，本研究證實(shí)在高糖環(huán)境下肝素對(duì)體外培養(yǎng)的腹膜間皮細(xì)胞的AQP1表達(dá)有上調(diào)作用，在正常劑量下增加其表達(dá)但不引起細(xì)胞凋亡等空泡樣改變，說(shuō)明中低劑量的肝素既能增加水通道蛋白AQP1的表達(dá)，又可能對(duì)人腹膜間皮細(xì)胞具有一定程度的保護(hù)作用，因此，在腹膜透析時(shí)具有較高的安全性，值得臨床廣泛應(yīng)用及推廣。

[1]Nakayama M,K awaguchi Y,Yamada K,et al.Immunohistochemical detection of advanced glycosylation end-products in the peritoneum and its possible patho-physiological role in CAPD[J]. Kidney Int,1997,51(1):182-186.

[2]周循,凌光輝,鄒莎琳,等.腹膜透析流出液中人腹膜間皮細(xì)胞的培養(yǎng)及轉(zhuǎn)分化特征[J].中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志,2010,20(17):2634-2638.

[3]殷莉波,趙文秀,尹震宇,等.人腹膜間皮細(xì)胞的改良分離及其鑒定[J].中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù),2011,15(27):5007-5010.

[4]徐慶,曾莉.人腹膜間皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)[J].深圳中西醫(yī)結(jié)合雜志, 2008,18(1):7-9.

[5]Agre P,King LS,Yasui M,et al.Aquaporin water channels: from atomic structure to clinical medicine[J].J Physiol,2002, 542(1):3-16.

[6]Rippe B,Stelin G,Haraldsson B.Computer simulations of peritoneal fluid transport in CAPD[J].Kidney Int,1991,40(2): 315-325.

[7]杜偉偉,楊洪濤.AQP1與腹膜透析超濾相關(guān)研究進(jìn)展[J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合腎病雜志,2012,13(11):1020-1023.

[8]彭燕,仲建新.水通道蛋白結(jié)構(gòu)、分布與功能[J].中國(guó)醫(yī)學(xué)創(chuàng)新, 2011,8(9):194-196.

[9]Tang S,Leung JC,Lam CW,et al.In vitro studies of aquaporins 1 and 3 expression in cultured human proximal tubular cells: up-regulation by transferring but not albumin[J].Am J Kidney Dis,2001,38(2):317-330.

[10]李志明,馬健飛,趙鋼,等.腹透液相關(guān)濃度葡萄糖對(duì)體外腹膜間皮細(xì)胞的影響[J].中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志,2007,17(5):513-518.

[11]Yang B,Folkesson HG,Yang J,et al.Reduced osmotic water permeability of the peritoneal barrier in aquaporin-1 knockout mice.Am J Physiol[J].1999,276(1):76-81.

[12]陳生曉,任昊,劉鄭榮,等.腹透液對(duì)大鼠腹膜間皮細(xì)胞水通道蛋白1表達(dá)的影響[J].解放軍醫(yī)學(xué)雜志,2008,33(1):72-74.

[13]李正紅,張旭,曹麗萍,等.黃芪注射液對(duì)高糖腹透液作用下人腹膜間皮細(xì)胞AQP1表達(dá)的影響[J].中華中醫(yī)藥雜志,2012,27(4): 1148-1151.

[14]彭衛(wèi)生,周巧玲,余學(xué)清,等.不同濃度葡萄糖透析液及LPS對(duì)腹膜透析大鼠腹膜組織VEGF及血管增生的影響及其意義[J].中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志,2007,17(17):2085-2088.

[15]Kar NL,Fu KL,Hao YL,et al.Expression of aquaporin-1 in human peritonealmesothelialcells and its up-regulation by glucose in vitro[J].J Am Soc Nephrol,2001,12(5):1036-1045.

（張蕾編輯）

Impact of different dosages'heparin on the expression of aquaporins 1 of human peritoneal mesothelial cells induced by high concentration glucose

Ge Li1，Jiu-yang Zhao2，Ze-yin Ren1，Wei Xiao1，Yong-feng Gui1
（1.Department of Nephrology，the First People's Hospital，Changde，Hunan 415000，China；2.Department of Nephrology，the Second Hospital Affiliated to Dalian Medical University，Dalian，Liaoning 116000，China）

Objective To investigate the impact of different dosages'heparin on the expression of aquaporin-1 （AQP1）of human peritoneal mesothelial cells（HPMCs）induced by high concentration glucose（2.5%W/W）.Methods HPMCs were separated from patients and sub-cultured，and induced by high concentration glucose for 4，8，12，and 24 h respectively.This is to determinate the time when the mRNA of AQP1 reaches the maximum level.Heparin of different dosages and 2.5%glucose were added into the cell culture medium.The expression levels of AQP1 were detected by using RT-PCR and immunohistochemistry in both control and experimental groups.Results Compared with the control group，the mRNA expression level of AQP1 was up-regulated in an time-dependant manner，with the maximum expression at 24 h induced by high concentration glucose.The protein expression level of AQP1 was also up-regulated in all experimental groups，particularly by 2.5%glucose and 1.5×10-2mg/ml heparin.The difference was of statistical significance（P＜0.05）.The result of RT-PCR is consistent with that of immunohistochemistry.By using immunohistochemistry，vacuolation was observed in the nucleus and cytoplasm treated by 2.5%glu－cose and 1.5×10-2mg/ml heparin.Conclusion The mRNA and protein expression of AQP1 can be up-regulated by 2.5%glucose and heparin.Vacuolation can be observed in the nucleus and cytoplasm treated by glucose and heparin of high concentration.

heparin；human peritoneal mesothelial cells；aquaporin 1

R 572.2

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.04.004

1005-8982（2016）04-0018-06

2015-11-12