內(nèi)皮抑素30肽對(duì)HepG2細(xì)胞黏附、侵襲能力影響的機(jī)制研究*

郭紅艷，劉秀財(cái)，李淑艷（齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院 生物化學(xué)教研室，黑龍江 齊齊哈爾 161006）

論著

內(nèi)皮抑素30肽對(duì)HepG2細(xì)胞黏附、侵襲能力影響的機(jī)制研究*

郭紅艷，劉秀財(cái)，李淑艷
（齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院 生物化學(xué)教研室，黑龍江 齊齊哈爾 161006）

目的探討R GD修飾的人內(nèi)皮抑素30肽對(duì)HepG2細(xì)胞黏附、侵襲的影響及作用機(jī)制。方法人工合成人內(nèi)皮抑素1～30位氨基酸（30肽，序列25～31由R GIR GAD改為R GDR GD）所對(duì)應(yīng)的核苷酸序列，連接到質(zhì)粒pTYB2中，再轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌BL21（DE3）中表達(dá)，同法合成人內(nèi)皮抑素1～27位氨基酸構(gòu)成的27肽作為對(duì)照。細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)及Transwell實(shí)驗(yàn)分別檢測30肽和27肽對(duì)HepG2細(xì)胞黏附能力和侵襲能力的影響，同時(shí)篩選與侵襲作用相關(guān)的整合素；免疫熒光檢測30肽和27肽對(duì)αvβ3整合素的聚集作用，流式細(xì)胞儀檢測30肽和27肽對(duì)HepG2細(xì)胞表面相應(yīng)整合素表達(dá)的影響；逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（R T-PCR）及Western blot檢測30肽和27肽對(duì)HepG2細(xì)胞TIMP1和TIMP2 mR NA和蛋白質(zhì)表達(dá)量的影響。結(jié)果30肽能明顯抑制HepG2細(xì)胞黏附、侵襲，對(duì)侵襲作用的影響與整合素αvβ3相關(guān)，同時(shí)，30肽能上調(diào)HepG2細(xì)胞中TIMP1和TIMP2 mR NA及蛋白質(zhì)的表達(dá)，30肽加αvβ3抗體后，上述作用明顯增強(qiáng)。結(jié)論30肽可能是通過整合素αvβ3發(fā)揮其抗腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移作用，可以成為臨床上肝癌的輔助化療藥物發(fā)揮作用。

內(nèi)皮抑素；R GD序列；侵襲；TIMP

內(nèi)皮抑素是O'Reilly等[1]發(fā)現(xiàn)的一種內(nèi)源性血管生成抑制劑，由膠原蛋白ΧⅧ羧基端的184個(gè)氨基酸殘基組成，研究發(fā)現(xiàn)其具有抑制腫瘤生長、改善肺纖維化等作用，且與其他多種疾病相關(guān)[2-3]，因此，內(nèi)皮抑素日益受到研究者的關(guān)注和重視。

已有研究證實(shí)，內(nèi)皮抑素活性區(qū)主要在N端的1～27個(gè)Aa上[4]，因此，本課題組構(gòu)建并表達(dá)了人內(nèi)皮抑素1～30位氨基酸（30肽，序列25～31由RGIRGAD改為RGDRGD）所對(duì)應(yīng)的核苷酸序列，前期研究證明，30肽具有更強(qiáng)的抑制腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的能力[5]，本文擬在前期工作的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究30肽抑制腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制。本文以人HepG2細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)材料，探討經(jīng)過RGD修飾的30肽通過與何種整合素特異性結(jié)合調(diào)節(jié)腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，為30肽用于臨床治療腫瘤提供理論指導(dǎo)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基（Gibco）、新生牛血清（PAA）、胰酶（DIFCO）購買于美國Invitrogen公司，人工基底膜Matrigel（E1270）購買于美國sigma公司，antibody（anti-α5、anti-β1、anti-β3、anti-αvβ3、anti-TIMP1、anti-TIMP2、anti β-actin）以及二抗購自美國Santa Cruz公司，Transwell小室購自美國Corning Costar公司，R NA提取試劑盒購于美國Promega公司，DRR019A逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（reversetranscription-polymerasechainreaction，RT-PCR）試劑盒購自日本TaKaRa公司；研究所用30肽和27肽是課題組分別從構(gòu)建的30肽和27肽基因工程菌中提取純化，并通過葡聚糖凝膠G15層析去除DTT、Tricine-SDS-PAGE鑒定。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)

人肝癌細(xì)胞株HepG2（本室保存）用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，5%二氧化碳CO2的37℃環(huán)境培養(yǎng)，細(xì)胞在60%～70%融合時(shí)進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.130肽對(duì)HepG2細(xì)胞黏附能力的影響實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)參考文獻(xiàn)[6]的方法，設(shè)立對(duì)照組、27肽組和30肽組。在96孔培養(yǎng)板孔中預(yù)先鋪2μg人工基底膜（matrigel），加2%BSA 20μL/孔，置于22℃1h，PBS沖洗。HepG2細(xì)胞用0、20、40、60、80和100μg/ml的27肽和30肽預(yù)孵育24 h，5×104個(gè)細(xì)胞/孔，置于37℃90 min。用PBS沖洗掉未黏附的細(xì)胞，加入MTT 20μl/孔，37℃孵育 4 h，棄去 MTT，加入100μl/孔DMSO，用酶標(biāo)儀在570 nm測定吸光度值，計(jì)算各組的相對(duì)黏附率，每組設(shè)3個(gè)平行對(duì)照，實(shí)驗(yàn)在不同時(shí)間進(jìn)行3次。

1.3.230肽對(duì)HepG2細(xì)胞侵襲能力的影響及相關(guān)整合素篩選實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)參考Liu等[7]人的方法。在Transwell小室的內(nèi)表面涂5μg Matrigel，置于37℃干燥后形成一個(gè)基質(zhì)屏障層。設(shè)立對(duì)照組、27肽處理組和30肽處理組，其中對(duì)照組細(xì)胞未經(jīng)肽處理，27肽組和30肽組細(xì)胞分別經(jīng)45μg/ml的27肽和30肽處理24 h。用胰酶消化細(xì)胞后，將細(xì)胞懸液加到Transwell小室中，每小室100μl，細(xì)胞數(shù)均為1×105個(gè)。在24孔培養(yǎng)板內(nèi)加入含20%FBS的RPMI1640培養(yǎng)液，每孔500μl。將小室浸于24孔板的條件培養(yǎng)基中，37℃，5%二氧化碳CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24h。吸棄上室中的溶液，用棉簽輕輕擦去小室內(nèi)側(cè)壁未轉(zhuǎn)膜的細(xì)胞，用0.1%結(jié)晶紫染小室膜20 min，晾干，在100倍顯微鏡下計(jì)數(shù)侵襲細(xì)胞數(shù)，拍照保存。每膜計(jì)數(shù)上下左右中5個(gè)不同視野的穿膜細(xì)胞數(shù)，計(jì)算平均值。同時(shí)，以單加30肽為對(duì)照，同時(shí)向 4個(gè)小室中對(duì)應(yīng)加入抗 α5、β1、β3、αvβ3整合素抗體（終濃度為50μg/ml）。檢測30肽分別加入α5、β1、β3、αvβ3整合素抗體后對(duì)HepG2細(xì)胞侵襲能力的影響。每組設(shè)3個(gè)平行孔，不同時(shí)間進(jìn)行3次。

1.3.3流式細(xì)胞術(shù)分析30肽對(duì)細(xì)胞表面αvβ3整合素表達(dá)水平的影響參考Chen等[8]人的方法。設(shè)立對(duì)照組、27肽組和30肽組。其中對(duì)照組細(xì)胞未經(jīng)肽處理，27肽組和30肽組細(xì)胞分別經(jīng)45μg/ml的27肽和30肽處理24 h，HepG2細(xì)胞生長到融合狀態(tài)后用0.25%胰酶消化，用PBS洗滌后制成單細(xì)胞懸液，與熒光標(biāo)記的抗αvβ3抗體一抗37℃孵育30 min，用PBS沖洗后，按1×105個(gè)細(xì)胞/管分裝，與FITC標(biāo)記的二抗在37℃避光孵育30 min，用PBS沖洗，F(xiàn)ACSCalibur流式細(xì)胞儀檢測，實(shí)驗(yàn)在不同時(shí)間進(jìn)行3次。

實(shí)驗(yàn)三：間歇采樣重復(fù)轉(zhuǎn)發(fā)干擾的采樣周期Ts=3 μs，采樣間隔τ=0.7 μs，干信比取40 dB，所得目標(biāo)信息如表4所示，仿真結(jié)果如圖5所示。

1.3.4免疫熒光檢測30肽對(duì)細(xì)胞表面αvβ3整合素聚集作用的影響設(shè)立對(duì)照組、27肽組和30肽組。取對(duì)數(shù)生長期HepG2細(xì)胞，5×105個(gè)細(xì)胞/孔接種24孔培養(yǎng)板，孵育24 h，給藥組分別加入終濃度為45μg/ml的27肽和30肽，對(duì)照組加入相同體積PBS，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，PBS沖洗2次，4%多聚甲醛固定20min，5%BSA封閉30min，每孔加入αvβ3一抗，置于4℃濕盒內(nèi)過夜，PBS振洗3次，每孔加入FITC標(biāo)記的二抗，37℃1 h，PBS沖洗3次，置于熒光顯微鏡下觀察并拍照,實(shí)驗(yàn)在不同時(shí)間進(jìn)行3次。

1.3.5R T-PCR檢測30肽對(duì)TIMP1和 TIMP2 mR NA表達(dá)的影響用RT-PCR方法檢測金屬蛋白酶組織抑制劑（tissue inhibitor of metalloproteinases，TIMP）家族TIMP1和TIMP2 mRNA在30肽及27肽作用下的變化，終濃度為45μg/ml的30肽和27肽分別作用HepG2細(xì)胞0、12、24及48 h后，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，PCR引物序列見附表，PCR反應(yīng)條件如下：94℃預(yù)變性2 min，94℃變性30s，退火30 s，72℃延伸60 s，循環(huán)次數(shù)為35循環(huán)（β-actin為30循環(huán)）；擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，紫外線下凝膠置于成像系統(tǒng)下進(jìn)行拍照，記錄。

另外分別用45μg/ml的30肽、45μg/ml的αvβ3抗體和 45μg/ml的 30肽 +45μg/ml的αvβ3抗體作用于HepG2細(xì)胞24 h，后續(xù)處理同上，分別檢測細(xì)胞中TIMP1和TIMP2 mRNA，以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.6Western blot檢測30肽對(duì)TIMP1和TIMP2表達(dá)的影響用Western blot方法檢測TIMP1和TIMP2蛋白在30肽及27肽作用下表達(dá)的變化。終濃度為45μg/ml的30肽和27肽分別作用HepG2細(xì)胞0、12、24及48 h后，分別收集細(xì)胞（800 rpm，5 min）提取蛋白，檢測細(xì)胞總蛋白濃度。取50μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉液中室溫封閉2h，加入相應(yīng)稀釋倍數(shù)的一抗，4℃孵育過夜，洗膜后，加入1∶5000的HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育2 h，采用化學(xué)發(fā)光法（ECL）曝光膠片，沖洗顯色檢測相應(yīng)的蛋白條帶，GPS8000型凝膠成像分析系統(tǒng)掃描分析蛋白條帶。

另外設(shè)立30肽組、αvβ3抗體組和30肽+αvβ3抗體組，各組中分別用45μg/ml的30肽、45μg/ml 的αvβ3抗體和45μg/ml的30肽+45μg/ml的αvβ3抗體作用于HepG2細(xì)胞24 h，后續(xù)處理同上，分別檢測細(xì)胞中TIMP1和TIMP2蛋白，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，t檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.130肽對(duì)HepG2細(xì)胞黏附能力的抑制作用

2.230肽對(duì)HepG2細(xì)胞侵襲能力的抑制作用

圖1　30肽對(duì)HepG2細(xì)胞黏附能力的影響

體外侵襲實(shí)驗(yàn)檢測30肽對(duì)細(xì)胞侵襲能力的影響，從圖2A、B可見，3組細(xì)胞的穿膜細(xì)胞數(shù)分別是（205.6±20.13）、（132.9±13.55）和（71.25±9.45），肽處理組的穿膜細(xì)胞數(shù)均低于對(duì)照組，30肽組穿膜細(xì)胞數(shù)顯著低于27肽組；30肽加入α5、β1、β3及αvβ3整合素抗體后，穿膜細(xì)胞數(shù)分別為（80±8.02）、（79.17±8.12）、（82.5±8.19）和（39.99±4.35）?？梢娭挥屑尤毽羦β3抗體后，30肽對(duì)HepG2細(xì)胞的侵襲能力得到進(jìn)一步抑制，其余抗體對(duì)HepG2細(xì)胞的侵襲能力無明顯影響（見圖2C、D）。

2.330肽對(duì)細(xì)胞表面αvβ3整合素表達(dá)的影響

流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示：對(duì)照組、27肽組和30肽組細(xì)胞表面avβ3表達(dá)量變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見圖3）。

圖2　30肽對(duì)HepG2細(xì)胞侵襲能力的抑制作用

圖3　流式細(xì)胞儀檢測30肽對(duì)HepG2細(xì)胞表面αvβ3整合素表達(dá)水平的影響

2.430肽對(duì)αvβ3整合素的聚集作用

免疫熒光結(jié)果顯示：與對(duì)照組及27肽組比較，30肽處理組HepG2細(xì)胞表面αvβ3明顯聚集成簇（見圖4）。

2.5RT-PCR檢測TIMP1和TIMP2基因的表達(dá)

圖4　30肽對(duì)HepG2細(xì)胞表面αvβ3整合素的聚集作用（×400）

圖5　30肽對(duì)HepG2細(xì)胞TIMP1和TIMP2 mRNA表達(dá)的影響及整合素的作用

如圖5A-D，TIMP1和TIMP2的mRNA表達(dá)量隨著27肽和30肽作用時(shí)間的延長而上調(diào)，30肽處理組在24 h開始上調(diào)TIMP1和TIMP2mRNA的表達(dá)（P<0.05）；圖5E-F中，與30肽組和αvβ3抗體組比較，30肽+αvβ3抗體組明顯上調(diào)TIMP1和TIMP2mRNA表達(dá)量。

2.6Western blot檢測TIMP1和TIMP2的表達(dá)

圖6A-D中，反向TIMP1和TIMP2的表達(dá)量隨著27肽和30肽作用時(shí)間的延長而上調(diào)，與27肽處理組比較，30肽處理組在24 h開始上調(diào)TIMP1和TIMP2蛋白的表達(dá)（P<0.05）。圖6E-F中，與30肽組和αvβ3抗體組相比，30肽+αvβ3抗體組明顯上調(diào)TIMP1和TIMP2蛋白的表達(dá)量。

圖6　30肽對(duì)HepG2細(xì)胞TIMP1和TIMP2蛋白表達(dá)的影響及整合素的作用

3　討論

腫瘤轉(zhuǎn)移是一個(gè)復(fù)雜的過程，黏附是腫瘤細(xì)胞侵襲的起始步驟，高侵襲的腫瘤細(xì)胞與基底膜成分的異質(zhì)性黏附能力通常增高，而腫瘤細(xì)胞間的同質(zhì)性黏附能力則會(huì)下降[9]，上述特征有利于腫瘤細(xì)胞與腫瘤母體分離，并侵犯基底膜等正常組織。通過黏附實(shí)驗(yàn)檢測30肽對(duì)腫瘤細(xì)胞與基底膜成分黏附能力的影響，結(jié)果表明，與27肽相比，30肽從40μg/ml開始，明顯抑制HepG2細(xì)胞與matrigel的黏附，并呈劑量依賴性。

基底膜侵襲實(shí)驗(yàn)?zāi)茌^好地反映腫瘤細(xì)胞的侵襲能力，使用matrigel等基質(zhì)成分模擬體內(nèi)基底膜進(jìn)行體外侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明：與27肽組比較，30肽具有明顯降低HepG2細(xì)胞侵襲能力的作用。30肽只比27肽多出一個(gè)RGDRGD序列，30肽抑制腫瘤細(xì)胞黏附、侵襲能力強(qiáng)于27肽，必定與其中的RGDRGD序列相關(guān)。RGD序列是指包含Arg-Gly-Asp3肽的序列，細(xì)胞外基質(zhì)中的蛋白質(zhì)借助其中的RGD序列識(shí)別并結(jié)合不同亞型的整合素，將細(xì)胞外信息傳入細(xì)胞內(nèi)，引發(fā)一系列病理生理變化，調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞黏附，影響腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移及凋亡。

整合素在體內(nèi)大多數(shù)細(xì)胞表面廣泛表達(dá)，在多種生命活動(dòng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[10]，與腫瘤等疾病密切相關(guān)[11]，具有RGD序列的小分子多肽會(huì)和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)競爭與整合素的結(jié)合，產(chǎn)生去整合素效應(yīng)。在侵襲實(shí)驗(yàn)中，分別加入α5、β1、β3及αvβ3整合素抗體，篩選30肽識(shí)別并結(jié)合的整合素亞型，結(jié)果加入αvβ3抗體能進(jìn)一步抑制細(xì)胞的侵襲能力，而其他抗體都對(duì)30肽的活性無明顯影響。

在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中，腫瘤細(xì)胞侵襲基底膜是重要環(huán)節(jié)，基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）被認(rèn)為是該過程中主要的蛋白水解酶，是反映腫瘤侵襲能力的重要指標(biāo)，其與多種疾病密切相關(guān)，本課題前期工作證明了30肽能下調(diào)腫瘤細(xì)胞MMP2和MMP9基因的表達(dá)及MMP2和MMP9的活性[5]。TIMP與MMP作用拮抗，是反映腫瘤侵襲能力的重要指標(biāo)，近年來有關(guān)MMP和TIMP的研究越發(fā)引起重視[12-13]，本研究中30肽引起MMP的特異性抑制劑TIMP1和TIMP2的表達(dá)上調(diào)，且在實(shí)驗(yàn)中加入αvβ3整合素抗體明顯增強(qiáng)30肽對(duì)TIMP1 和TIMP2基因表達(dá)的調(diào)控作用。

流式細(xì)胞術(shù)檢測，30肽沒有改變細(xì)胞表面αvβ3整合素的表達(dá)；免疫熒光實(shí)驗(yàn)的結(jié)果中觀察到了腫瘤細(xì)胞表面αvβ3整合素聚集成簇現(xiàn)象，因此考慮30肽不是通過改變整合素的表達(dá)量，而是引起細(xì)胞表面整合素αvβ3聚集成簇，使30肽借助其RGD序列提高了對(duì)整合素αvβ3受體的結(jié)合率和選擇性，產(chǎn)生了去整合素效應(yīng)，削減了整合素介導(dǎo)的對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移的影響。

綜上所述，RGD序列修飾的內(nèi)皮抑素30肽不僅能顯著抑制腫瘤組織新生血管的生成，抑制腫瘤細(xì)胞的生長與增殖，還能有效地抑制HepG2的侵襲與轉(zhuǎn)移。30肽抑制腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移的能力明顯大于內(nèi)皮抑素27肽，其機(jī)制可能是30肽通過RGDRGD序列與αvβ3整合素結(jié)合，上調(diào)TIMP1、TIMP2的表達(dá)，進(jìn)而降低腫瘤細(xì)胞降解細(xì)胞外基質(zhì)的能力，抑制腫瘤細(xì)胞的體外黏附、侵襲和遷移能力。這些結(jié)果為以后30肽輔助化療藥物應(yīng)用于腫瘤的治療提供了理論依據(jù)。

[1]O'reilly MS,Boehm T,Shing Y,et al.Endostatin:An endogenous inhibitor of angiogenesis and tumor growth[J].Cell,1997,88(2): 277-285.

[2]Danielle BR,Roger C,Natália VM,et al.Anti-tumor therapy with macro encapsulated endostatin producer cells[J].BMC Biotechnol, 2010;10(5):1-9.

[3]Jonathan G,Paula C,Graeme J,etal.Serum Endostatin concentrations Are Higher in Men with Symptoms of Intermittent Claudication[J].Dis Markers,2014:2014(1):105-109.

[4]Tjin Tham Sjin RM,Satchi-Fainaro R,Birsner AE,et al.A 27-amino-acidsyntheticpeptidecorrespondingto theNH2 terminal zinc-binding domain of endostatin is responsible for its anti tumor activity1[J].Cancer Res,2005,65(9):3656-3663.

[5]劉哲丞、郭紅艷、姚淑娟、張春晶、劉秀財(cái)、李淑艷.內(nèi)皮抑素30肽對(duì)SGC-7901細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移能力的影響[J].腫瘤防治研究,2012, 39(12):1416-1419.

[6]Wickstrom SA,KariA,JormaKO.AnEndostatin-derived PeptideInteractswithIntegrinsandRegulatesActin Cytoskeleton and Migration of Endothelial Cells[J].J Biol Chem, 2004,279(19):20178-20185.

[7]LiuHK,Wang Q,Li Y,et al.Inhibitory effects of γ-tocotrienol on invasion and metastasis of human gastricadenocarcinoma SGC-7901 cells[J].Journal of Nutritional Biochemistry,2010,21 (9):206-213.

[8]Chen Q,Meng LH,Zhu CH,et al.ADAM15 suppresses cell motility by driving integrinα5β1 cell surface expression via Erk inactivation[J].The International Journal of Biochemistry&Cell Biology,2008,40(10):2164-2173.

[9]Fidler IJ.The pathogenesis of cancer metastasis:the'seed and soil'hypothesis revisited[J].Nat Rev Cancer,2003,3(6):453-458.

[10]Furie N,Shteynberg D,Elkhatib R,et al.Fibulin-5 regulates keloid-derived fibroblast-like cells hrough integrin beta-1[J].Int J Cosmet Sci,2015,Jun 11.doi:10.1111/ics.12245.

[11]Boudjadi S,Carrier JC,Groulx JF,et al.Integrin α1β1 expression is controlled by c-MYC in colorectal cancer cells[J]. Oncogene,2015,6,doi:10.1038/onc.

[12]Prideaux M,Staines KA,Jones ER,et al.MMP and TIMP temporal gene expression during osteocytogenesis[J].Gene Expr Patterns,2015,18(1-2):29-36.

[13]Falcao AS,Kataoka MS,Ribeiro NA,et al.A novel cell line derived from pleomorphic adenoma expresses MMP2,MMP9, TIMP1,TIMP2,and shows numeric chromosomal anomalies[J]. PLoS One,2014,9(8):105231.

（張蕾編輯）

Endostatin 30 peptide inhibit the cell adhesion and invasion of HepG2 cells*

Hong-yan Guo，Xiu-cai Liu，Shu-yan Li
（Department of Biochemistry，Qiqihar Medical University，Qiqihar，Heilongjiang 161006，China）

Objective To study the influence of human endostatin 30 peptide modified RGD on the cell adhesion and invasion of HepG2 cells and the mechanism.Methods The nucleotide sequence encoding amino acids 1-30 of endostatin（peptide 30，with amino acids 25-31 mutated from RGIRGAD to RGDRGD）was artificially synthesized and cloned into the plasmid pTYB2 and expressed in E.coli（DE3），Similarly，peptide 27，corresponding to amino acids 1-27 of endostatin，was produced as a control.The cell adhesion assay and transwell was used to inspect the influence of cell adhesion and invasion activity of HepG2 caused by 30 peptide and 27 peptide，respectively.Meanwhile，integrin associate with invasion was screened out；The aggregation of integrin αvβ3 was detected using by immunofluorescence The expression of integrin on the HepG2 cell surface was measured by flow cytometry in order to test the effect of 30 peptide and 27 peptide.The expression of mRNA and protein was tested by RT-PCR and Western blot，including TIMP1 and TIMP2.Results The cell adhesion and invasion of HepG2 was inhibited obviously by 30 peptide，and it's influence of invasive effect on HepG2 associate with integrin αvβ3.At the same time，the mRNA and protein expression of TIMP1 and TIMP2 were down-regulated by 30 peptide.Above function enhanced obviously after αvβ3 antibody joined to 30 peptide.Conclusions 30 peptide can give full play to its anti-transferance for tumor through integrin αvβ3，30 peptide may help chemotherapeutics to play their function of anti-hepatoma in the clinical treatment.

Endostatin；RGD sequence；invasion；TIMP

R 735

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.04.003

1005-8982（2016）04-0011-07

2015-10-11

黑龍江省教育廳資助項(xiàng)目（No：12511619）；齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院博士專項(xiàng)科研基金項(xiàng)目

李淑艷，E-mail：lsy6910553@163.com，Tel：0452-2663151