芹菜素對人舌鱗癌Tca8113細胞增殖及凋亡的影響

李　英，樸虎雄，玄云澤

(延邊大學(xué)附屬醫(yī)院口腔科，吉林延吉 133000)

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芹菜素對人舌鱗癌Tca8113細胞增殖及凋亡的影響

李英，樸虎雄，玄云澤△

(延邊大學(xué)附屬醫(yī)院口腔科，吉林延吉 133000)

目的探討芹菜素對體外培養(yǎng)的人舌癌Tca8113細胞增殖及凋亡的作用。方法不同濃度(20、40、80、160 μmol/L)芹菜素處理舌癌Tca8113細胞，四甲基偶氮唑鹽(MTT)法檢測對細胞增殖的抑制作用；Annexin V-FITC/PI流式細胞術(shù)檢測細胞的凋亡率；逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)法檢測B淋巴細胞癌-2(Bcl-2)和Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)的mRNA表達變化。結(jié)果芹菜素各組細胞增殖均有不同程度的抑制，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。芹菜素對Tca8113細胞增殖的抑制效果呈一定程度的時間依賴性和劑量依賴性，隨著濃度提高和作用時間延長，抑制效果更明顯(P<0.05)。對照組及不同濃度芹菜素組(除20 μmol/L)組間兩兩比較，藥物濃度越高，細胞凋亡率越顯著(P<0.05)。除20 μmol/L外芹菜素各濃度組組人舌鱗癌細胞連續(xù)培養(yǎng)48 h后,Bcl-2 mRNA的表達水平隨著濃度降低，而Bax mRNA表達水平增高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論芹菜素對人舌癌Tca8113細胞的增殖具有抑制作用，并誘導(dǎo)細胞的凋亡，其機制可能與抑制Bcl-2 mRNA表達、促進Bax mRNA表達有關(guān)。

芹菜素；癌，鱗狀細胞；舌腫瘤；細胞凋亡；細胞增殖；基因，bcl-2；bax

芹菜素是一種天然黃酮類化合物，具有抗菌、抗病毒、抗氧化等藥理作用，尤其抗腫瘤作用較明顯[1-3]。國內(nèi)外眾多學(xué)者對芹菜素的抗腫瘤作用及其機制做了大量研究，然而有關(guān)舌鱗癌方面研究報道較少。本研究檢測芹菜素對舌鱗癌細胞株Tca8113細胞增殖及凋亡的影響，對凋亡機制進行了初步探討，為人舌癌的預(yù)防及治療提供理論依據(jù)和實驗基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料芹菜素購自美國Sigma公司；RPMI-1640培養(yǎng)基購自北京Hyclone公司；胰蛋白酶、胎牛血清、四甲基偶氮唑鹽(MTT)、50×Tae電泳緩沖液購自北京Solarbio公司；二甲基亞砜(DMSO)購自美國AMRESCO公司；Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑購自上海bestbio公司；焦碳酸二乙酯(DEPC)購自北京NobleRyder公司；瓊脂糖購自西班牙biowest Agarose公司；Trizol總RNA抽提試劑盒購自北京ihvitrogen公司；一步法逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)Kit試劑盒、Maker購自日本TaKaRa公司；溴化乙錠(EB)購自北京sybr green公司；內(nèi)參照β-actin引物、B淋巴細胞癌-2(Bcl-2)引物、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)引物，購自上海生工生物技術(shù)有限公司。

1.2方法

1.2.1細胞株及細胞培養(yǎng)舌癌Tca8113細胞株由延邊大學(xué)病理教研室提供；培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，于37 ℃、5%CO2電恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)傳代培養(yǎng)，裝入己滅菌的凍存管中，按4 ℃ 30 min，-20 ℃ 15 min，-80 ℃ 60 min，-196 ℃的順序逐步降溫，液氮凍存，備用。

1.2.2MTT法檢測細胞增殖的影響Tca8113細胞用胰蛋白酶消化，吹打細胞成單細胞懸液，稀釋至5×104個/mL；接種于96孔培養(yǎng)板中，將培養(yǎng)板置入37 ℃含CO2恒溫箱中培養(yǎng)24 h，待細胞貼壁后，吸棄孔內(nèi)上培養(yǎng)液，加入20、40、80、160 μmol/L濃度的芹菜素溶液，設(shè)為不同濃度芹菜素組，僅加等量不含芹菜素的培養(yǎng)液設(shè)對照組，每組6個重復(fù)孔；繼續(xù)在CO2恒溫箱中分別培養(yǎng)24、48、72 h，每孔加20 μL MTT，放置在5%CO2、37 ℃及飽和濕度條件下繼續(xù)CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h，每孔加入150 μL DMSO，在避光狀態(tài)下振蕩10 min，酶標(biāo)儀上設(shè)定490 nm波長,檢測每孔細胞的吸光度(OD)值，每天測量1組，連續(xù)3 d。以上操作重復(fù)3次。各濃度芹菜素組按下列公式計算：細胞生長抑制率=(1-不同濃度芹菜素組OD值/對照組OD值)×100%。

1.2.3Annexin V-FITC/PI染色法應(yīng)用流式細胞儀檢測細胞凋亡率與MTT法相似，以細胞密度(5×104個/mL)接種于培養(yǎng)瓶中，每瓶約l×106個細胞，加入適量培養(yǎng)液培養(yǎng)貼壁后棄去培養(yǎng)液，更換等量濃度分別為20、40、80、160 μmol/L芹菜素的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，對照組加入等量RPMI-1640；離心收集懸浮細胞，棄去培養(yǎng)基，用冷磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細胞2次，加入400 μL的1×Binding Buffer懸浮細胞，濃度大約為1×106個/mL；將5 μL Annexin V-FITC加入細胞懸浮液中混勻，于2～8 ℃避光條件下孵育，加入10 μL碘化丙啶(PI)輕輕混勻，于2～8 ℃避光條件下孵育5 min，在1 h內(nèi)用流式細胞儀檢測。機械損傷細胞(Annexin V FITC-/PI+)；正常的活細胞不被Annexin V-FITC和PI染色(Annexin V FITC-/PI-)；早期的凋亡細胞僅Annexin V-FITC染色，PI染色呈陰性(Annexin V FITC+/PI-)；壞死細胞和凋亡晚期細胞可以同時被Annexin V-FITC和PI染色(Annexin V FITC+/PI+)，則早、晚期凋亡細胞及壞死細胞均計為凋亡細胞。

1.2.4RT-PCR 檢測法Bcl-2、Bax的mRNA表達同上1.2.2細胞培養(yǎng)，加入不同濃度芹菜素培養(yǎng)48 h,1.0 mL Trizol加到細胞表面，室溫下裂解細胞；冰上靜置并加入氯仿后蓋緊EP管管蓋，振蕩混勻，待溶液呈乳白狀而無分相現(xiàn)象后冰上靜置3 min，離心15 min；取出勻漿液，將上層無色的上清液轉(zhuǎn)移至另一干凈EP管中，加入異丙醇并充分混勻，冰上靜置，離心10 min；棄去上清液，RNA沉于管底，沿EP管壁加入75%冰乙醇，離心5 min；RNA沉淀于室溫晾干，當(dāng)RNA 沉淀變透明后用30 μL去RNA酶的純水溶解RNA，溫浴10 min；待沉淀完全溶解后，置于-80 ℃冰箱保存；核蛋白儀測量RNA濃度和純度鑒定，制備的瓊脂糖凝膠板放入電泳槽中，倒入1×TAE電泳緩沖液，取5 μL總RNA加樣，1.0%瓊脂糖凝膠上電泳30 min，電泳膠移至紫外燈下觀察RNA是否降解來鑒定RNA完整性。β-actin引物擴增片段長度為350 bp做內(nèi)參照，Bcl-2擴增片段長度為195 bp，Bax擴增片段長度為276 bp；在Microtube管中配制混合液，離心使模版RNA混合液聚集于管底部，混合物置于PCR儀上進行變性、退火反應(yīng)；冰浴條件下，在PCR儀上進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)；拍打PCR管，混勻，在PCR儀進行擴增；瓊脂糖凝膠的制備后入電泳槽中進行電泳40～60 min后，膠塊置于紫外凝膠圖像分析儀下觀察，掃描。成像分析ImageJ軟件測定各條帶的光密度值,每組試驗做3個平行重復(fù)，以3次重復(fù)的平均值為依據(jù)，計算樣品中目的基因β-actin擴增條帶的光密度值比值。

2　結(jié)　果

2.1MTT法檢測芹菜素對Tca8113細胞增殖的抑制效果芹菜素各組細胞增殖均有不同程度的抑制，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。芹菜素對Tca8113細胞增殖的抑制效果呈一定程度的時間依賴性和劑量依賴性，隨著濃度提高和作用時間延長，抑制效果更明顯(P<0.05)，見表1。

表1　芹菜素不同濃度、不同時間對Tca 8113細胞抑制率(%)

a:P<0.05，與24 h比較；b:P<0.05，與對照組比較。

2.2流式細胞術(shù)檢測芹菜素作用于Tca8113細胞48 h凋亡率試驗結(jié)果表明，除了20 μmol/L外,隨著藥物濃度提高，芹菜素對Tca8113細胞早期、晚期及總凋亡率均有上升趨勢。對照組及不同濃度芹菜素組兩兩比較表明，隨著藥物濃度提高，細胞凋亡率更為顯著(P<0.05)，見表2、圖1。

表2　芹菜素作用48 h后不同濃度對Tea8113細胞凋亡

a:P<0.05，與對照組比較。

2.3PCR-RT檢測芹菜素作用48 h時Tca8113細胞Bcl-2、Bax的mRNA表達變化除20 μmol/L外，芹菜素各濃度組組人舌鱗癌細胞連續(xù)培養(yǎng)48 h后,Bcl-2 mRNA的表達水平隨著濃度降低，而Bax mRNA表達水平增高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表3、圖2。

表3　不同濃度Bcl-2、Bax mRNA光密度值分析

a:P<0.05，與對照組比較。

A：對照組；B：芹菜素20 μmol/L組，48 h；C：芹菜素40 μmol/L組，48 h；D：芹菜素80 μmol/L組，48 h；芹菜素160 μmol/L組，48 h。

圖1流式細胞儀檢測結(jié)果

A：48 h后Tca8113細胞Bcl-2 mRNA的表達；B：48 h后Tca8113細胞Bax mRNA的表達；C：48 h后Tca8113細胞β-actinm RNA的表達。

圖2PCR-RT檢測結(jié)果

3　討　論

芹菜素作為一種植物源性抗腫瘤藥物，且具有毒副作用小的優(yōu)點，成為有開發(fā)前景的天然腫瘤藥物，是腫瘤研究界的新焦點[3-5]。Choi等[6]研究發(fā)現(xiàn)，在濃度為20～160 μmol/L芹菜素分別作用在乳腺癌MDA-MB-453細胞24、48、72 h，芹菜素對乳腺癌MDA-MB-453細胞增殖的抑制作用有明顯的劑量和時間依賴性。蔡婧等[7]研究發(fā)現(xiàn)不同濃度的芹菜素作用下培養(yǎng)肝癌Huh-7細胞，其抑制率差異有統(tǒng)計學(xué)意義。本研究采用MTT法檢測芹菜素對人舌癌Tca8113細胞增殖的抑制情況，試驗結(jié)果顯示，相同藥物濃度下不同時間、相同時間下不同濃度芹菜素組與對照組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義，而且芹菜素對舌癌Tca8113細胞的增殖的抑制作用呈的一定的時間、劑量依賴性，與乳腺癌、肝癌方面研究報道一致[6-7]。

細胞凋亡是指細胞在一定生理或病理條件下出現(xiàn)的程序主動性、生理性死亡過程，Annexin V-FITC與PI雙標(biāo)記結(jié)合流式細胞術(shù)是檢測體外細胞凋亡的比較常用的方法。但其缺點是晚期凋亡細胞與壞死細胞之間區(qū)分較為困難，若研究凋亡或是壞死本身通路等方面，需進行進一步相關(guān)研究。本研究雖然將晚期凋亡細胞及壞死細胞均統(tǒng)一計為晚期凋亡細胞來進行計算，但僅早期凋亡與對照組相比具有統(tǒng)計學(xué)意義，不同濃度芹菜素組總凋亡率也明顯高于對照組。Moghaddam等[8]、李明勇等[9]檢測芹菜素作用于人胃癌BGC823 細胞、人鼻咽癌CNE-2Z細胞，證實隨著濃度增加，細胞的凋亡率有上升趨勢。本試驗結(jié)果表明不同濃度芹菜素對Tca8113細胞作用48 h，除20 μmol/L外其他組芹菜素濃度依賴性地誘導(dǎo)凋亡，與文獻報道一致。

細胞凋亡過程中多種基因?qū)患せ睢⒈磉_及調(diào)控,從中出現(xiàn)抗凋亡基因和促凋亡基因兩大類相關(guān)的基因，而在此過程中Bcl-2、Bax基因備受關(guān)注。Bcl-2是目前最受重視的調(diào)控凋亡細胞的基因，也是與凋亡有關(guān)的基因主要調(diào)節(jié)者。Bax基因的作用與Bcl-2基因相反，是促凋亡基因，它的過表達可使拮抗Bcl-2的促進細胞增殖及抑制凋亡的作用。編碼的Bax蛋白可自身形成同源二聚體誘導(dǎo)凋亡，而且將與Bcl-2蛋白及Bcl-x1蛋白形成異源二聚體，導(dǎo)致加速細胞凋亡發(fā)生[10-11]。研究發(fā)現(xiàn)，芹菜素作用于肺癌A549細胞、人胃癌細胞，上調(diào)細胞Bax的表達、下調(diào)Bcl-2 表達，且呈劑量依賴性[12-13]。李衛(wèi)林等[14]結(jié)果表明，人前列腺癌PC-3細胞裸鼠移植瘤中芹菜素中、高劑量組能促進Bax的表達、抑制Bcl-2的表達。本試驗通過RT-PCR檢測，人舌鱗癌細胞連續(xù)培養(yǎng)48 h后，除20 μmol/L外其他濃度芹菜素組與對照組相比，Bcl-2、Bax mRNA的表達水平均差異有統(tǒng)計學(xué)意義，這表示降低Bcl-2 mRNA表達、上調(diào)Bax mRNA表達是芹菜素在一定濃度下誘導(dǎo)Tca8113細胞發(fā)生凋亡的機制之一。

綜上所述，芹菜素作為一種植物提取物的活性成分，能夠有效抑制舌鱗癌Tca8113細胞增殖，誘導(dǎo)細胞凋亡，提示芹菜素對舌鱗癌有一定防治作用，且對芹菜素的進一步研究打下基礎(chǔ)。

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李英(1987-)，住院醫(yī)師，碩士，主要從事口腔頜面外科腫瘤研究?！?/p>

,Tel:13943322882；E-mail:xuanyunze@sina.con。

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.13.035

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1671-8348(2016)13-1828-04

2015-11-23

2016-01-26)