• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    REDE-DHPLC檢測(cè)NSCLC血漿EGFR突變及其臨床意義*

    2016-09-02 01:49:12藍(lán)美玲趙蓮花肖華亮
    重慶醫(yī)學(xué) 2016年13期
    關(guān)鍵詞:一致性血漿檢測(cè)

    闕 丹,肖 何,陳 川,藍(lán)美玲,李 建,黃 環(huán),趙蓮花,肖華亮,王 閣△

    (第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所:1.腫瘤中心;2.病理科,重慶 400042)

    ?

    論著·臨床研究

    REDE-DHPLC檢測(cè)NSCLC血漿EGFR突變及其臨床意義*

    闕丹1,肖何1,陳川1,藍(lán)美玲1,李建1,黃環(huán)1,趙蓮花1,肖華亮2,王閣1△

    (第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所:1.腫瘤中心;2.病理科,重慶 400042)

    目的探討酶切富集聯(lián)合變性高效液相色譜法(REDE-DHPLC)檢測(cè)非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)患者外周血表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)突變的臨床應(yīng)用價(jià)值。方法采用REDE-DHPLC法對(duì)該院收治的403例NSCLC患者血漿EGFR 19和21外顯子突變狀態(tài)進(jìn)行檢測(cè),分析突變與基線資料的相關(guān)性。其中115例患者同時(shí)采用ARMS法對(duì)腫瘤組織樣本進(jìn)行突變檢測(cè),比較兩種方法檢測(cè)的一致性。結(jié)果403例患者血漿樣本總突變率為26.3%(106/403)。女性、不吸煙、腺癌及晚期(Ⅲb~Ⅳ)患者血漿EGFR突變率分別顯著高于男性、吸煙、非腺癌及早期患者(P<0.05)。多變量Logistic分析顯示性別、吸煙史及組織類型是血漿EGFR突變的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素(P<0.05)。115例配對(duì)樣本中,以組織樣本為標(biāo)準(zhǔn),REDE-DHPLC法檢測(cè)血漿EGFR突變的敏感度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值分別為69.0%、97.3%、93.5%、84.5%,兩種檢測(cè)方法具有較好的一致性(κ=0.702)。 結(jié)論性別、吸煙史及組織類型是NSCLC患者血漿EGFR突變的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素,REDE-DHPLC法檢測(cè)血漿EGFR突變敏感度及特異度較高。

    癌,非小細(xì)胞肺;色譜法,高壓液相;酶切富集;受體,表皮生長(zhǎng)因子

    肺癌是目前發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤,其中非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)約占85%[1],多數(shù)患者在確診時(shí)已屬晚期,失去手術(shù)治療機(jī)會(huì)。以酪氨酸激酶抑制劑(TKI)為代表的靶向治療給臨床NSCLC的治療提供了新的思路,成為近年研究的熱點(diǎn)。組織樣本是檢測(cè)表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)突變的“金標(biāo)準(zhǔn)”,但多數(shù)晚期患者常無(wú)法獲取滿意組織樣本用于突變檢測(cè)。因此,尋找更易獲取、方便動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)的樣本對(duì)臨床具有重要意義。近期,國(guó)內(nèi)外多項(xiàng)臨床研究顯示外周血EGFR突變與組織樣本具有較高的符合率[2-4],但各檢測(cè)方法的敏感度和特異度存在一定差異,外周血樣本能否替代組織樣本用于臨床突變檢測(cè)有待進(jìn)一步研究。本研究采用酶切富集聯(lián)合變性高效液相色譜法(restriction endonuclease digestion-denaturing high performance liquid chromatography,REDE-DHPLC)對(duì)NSCLC患者血漿EGFR突變進(jìn)行檢測(cè),分析突變與基線資料的相關(guān)性,并與配對(duì)組織樣本檢測(cè)進(jìn)行對(duì)比分析,探討REDE-DHPLC法檢測(cè)血漿EGFR突變與組織檢測(cè)的一致性。

    1 資料與方法

    1.1一般資料收集2012年1月至2014年12月本院腫瘤中心收治的403例NSCLC患者臨床資料,其中男282例,女121例,年齡33~86歲,平均(60.5±10.0)歲。患者均經(jīng)病理確診為NSCLC。403例患者均在首次入科治療前采集空腹血漿進(jìn)行血漿突變檢測(cè),其中115例患者在血漿檢測(cè)同時(shí)對(duì)穿刺或術(shù)后病理標(biāo)本進(jìn)行組織突變檢測(cè)(與血漿檢測(cè)時(shí)間差小于1個(gè)月)。403例患者及家屬均簽署知情同意書。

    1.2方法403例NSCLC患者血漿EGFR 19和21外顯子突變采用REDE-DHPLC法進(jìn)行檢測(cè),115例配對(duì)患者的組織樣本采用ARMS法進(jìn)行檢測(cè)。EGFR 19和21外顯子引物設(shè)計(jì)參考文獻(xiàn)[5]進(jìn)行。

    1.2.1標(biāo)本收集及DNA提取患者入院后采集空腹外周靜脈血4 mL置于EDTA抗凝管中,離心后采用美國(guó)QIAGEN公司生產(chǎn)的QIAamp DNA Blood Mini Kit試劑盒提取游離DNA。從患者石蠟標(biāo)本中獲取5片5 μm厚石蠟標(biāo)本,使用QIAGEN公司生產(chǎn)的FFEP-DNA Kit試劑盒提取組織DNA樣本。

    1.2.2REDE-DHPLC法檢測(cè)血漿檢測(cè)第一輪PCR擴(kuò)增體系為25 μL,包括10 ×PCR緩沖液2 μL、Taq DNA聚合酶(5 U/μL)0.2 μL、dNTP(10 μmol/μL)2 μL、上下游引物(10 μmol/μL)各1 μL、模板DNA 2 μL。PCR條件為:95 ℃ 5 min;95 ℃ 30 s,56 ℃ 30 s,72℃ 50 s,共40個(gè)循環(huán);72 ℃ 7 min。19外顯子為缺失突變(19 Del),將第一輪PCR產(chǎn)物加入含Mse I(美國(guó)NEB公司生產(chǎn))的酶切體系,37 ℃孵育150 min,酶切產(chǎn)物進(jìn)行第二輪PCR,擴(kuò)增體系同第一輪PCR,共40循環(huán)。產(chǎn)物采用美國(guó)Transgenomic公司生產(chǎn)的DNASep柱進(jìn)行分析。21外顯子為置換突變(21 L858R),將第一輪PCR產(chǎn)物加入含Msc I(美國(guó)NEB公司生產(chǎn))的酶切體系,37 ℃孵育150 min,第二輪PCR產(chǎn)物采用Sau96 I酶切(美國(guó)NEB公司生產(chǎn)),而后產(chǎn)物95 ℃孵化5 min,以1 ℃/min 速度將至35 ℃進(jìn)行復(fù)性。設(shè)定DNASep柱緩沖液流速為0.9 mL/min,檢測(cè)器紫外分光光度計(jì)設(shè)為260 nm。檢測(cè)突變圖譜見圖1。

    A:19外顯子缺失突變;B:21外顯子點(diǎn)突變。

    圖1REDE-DHPLC法檢測(cè)血漿樣本19、21外顯子突變檢測(cè)結(jié)果

    1.2.3組織樣本ARMS法突變檢測(cè)組織樣本DNA提取后采用ARMS法進(jìn)行突變檢測(cè)。試劑盒采用廈門艾德公司研發(fā)的人類EGFR基因突變檢測(cè)試劑盒(ADx-ARMS),按照提供的判讀標(biāo)準(zhǔn),對(duì)組織樣本提取的DNA突變情況進(jìn)行檢測(cè),在本院病理科完成。

    1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理運(yùn)用 SPSS20.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,計(jì)數(shù)資料用構(gòu)成比表示,采用χ2檢驗(yàn)分析?;€特征與突變率的關(guān)系采用χ2檢驗(yàn)及Logistic回歸分析,一致性分析采用κ檢驗(yàn),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié) 果

    2.1患者血漿EGFR突變率比較患者血漿樣本總突變率為26.3%(106/403),其中19和21外顯子突變率分別為62.3%(66/106)和 37.7%(40/106)。

    2.2血漿EGFR突變與基線特征相關(guān)性分析血漿EGFR突變與患者臨床基線特征相關(guān)性分析顯示,女性、不吸煙、腺癌及晚期(Ⅲb~Ⅳ)患者血漿EGFR突變率分別顯著高于男性、吸煙、非腺癌及早期(Ⅰa~Ⅲa)患者(P<0.05),見表1。以單因素分析P<0.01的變量(性別、吸煙史、組織類型及分期)為自變量,以血漿突變狀態(tài)為因變量進(jìn)行Logistic多變量逐步向前回歸,結(jié)果表明,性別、吸煙史及組織類型是NSCLC患者血漿EGFR突變的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素,見表2。

    表1 患者血漿EGFR突變與基線特征的關(guān)系(n)

    表2 多變量逐步Logistic回歸分析結(jié)果

    2.3配對(duì)樣本一致性比較115例配對(duì)患者中,42例組織檢測(cè)結(jié)果為突變型,其中13例血漿檢測(cè)結(jié)果為野生型;31例血漿檢測(cè)結(jié)果為突變型,其中2例組織檢測(cè)結(jié)果為野生型。以組織檢測(cè)為標(biāo)準(zhǔn),REDE-DHPLC法檢測(cè)血漿樣本的敏感度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值分別為69.0%、97.3%、93.5%、84.5%,兩種檢測(cè)方法具有較好的一致性(κ=0.702),見表3。

    表3 兩種檢測(cè)方法一致性比較

    3 討 論

    大型臨床研究均表明,TKI能顯著延長(zhǎng)EGFR突變NSCLC患者無(wú)進(jìn)展生存期,療效明顯優(yōu)于化療方案[6-7]。EGFR基因突變是患者TKI獲益的關(guān)鍵,組織樣本是突變檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”[8],但大部分NSCLC患者在確診時(shí)已進(jìn)入晚期,常無(wú)法獲得足夠組織樣本進(jìn)行突變檢測(cè)。Mok等[6]研究中僅36%患者可提供用于檢測(cè)突變的組織樣本,這導(dǎo)致組織樣本突變檢測(cè)在臨床應(yīng)用中受到一定限制。外周血循環(huán)腫瘤DNA主要來(lái)源于凋亡壞死和脫落的腫瘤細(xì)胞,其遺傳特性與腫瘤細(xì)胞基因組DNA相同[2],這為血漿樣本用于EGFR突變檢測(cè)提供了可行性。此外,外周血檢測(cè)還具有易獲取、創(chuàng)傷小、患者易接受、方便動(dòng)態(tài)檢測(cè)等特點(diǎn),具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。

    目前,應(yīng)用于血漿EGFR突變檢測(cè)的方法包括ARMS法、PCR限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析法、突變富集型PCR、DHPLC法、微數(shù)字PCR、熒光定量PCR等[9]。由于納入患者樣本量及基線特征的差異、血樣本采集時(shí)間的不同、檢測(cè)方法靈敏度差異等,各檢測(cè)方法與組織樣本檢測(cè)的一致性為48.2%~92.0%[3-6]。部分方法對(duì)儀器和操作要求較高、檢測(cè)成本高、操作復(fù)雜,臨床廣泛推廣仍存在一定困難。DHPLC法具有操作簡(jiǎn)單、快速、自動(dòng)化程度高等優(yōu)點(diǎn),目前已在臨床EGFR突變檢測(cè)中開展應(yīng)用,Bai等[5]報(bào)道DHPLC法檢測(cè)血漿EGFR突變的檢測(cè)限值約為3%。楊卓等[10]采用REDE-DHPLC法對(duì)質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品EGFR突變進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)其檢測(cè)限值達(dá)到0.1%,顯著高于傳統(tǒng)DHPLC法。本研究結(jié)果中,患者血漿樣本總突變率為26.3%(106/403),其中19和21外顯子突變率分別為62.3%(66/106)和37.7%(40/106),與既往報(bào)道基本一致[3-5]。研究發(fā)現(xiàn),女性、非吸煙者、肺腺癌及亞洲人種是組織EGFR突變的高發(fā)對(duì)象[9]。本研究對(duì)血漿樣本突變分析發(fā)現(xiàn)性別、吸煙史及組織類型是患者血漿EGFR突變的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素,可作為初步判斷患者潛在突變的因素。

    115例配對(duì)樣本中,以組織檢測(cè)為標(biāo)準(zhǔn),REDE-DHPLC法檢測(cè)血漿樣本的敏感度和特異度分別為69.0%和97.3%,兩種方法具有較好的一致性。在42例組織突變樣本中,有13例血漿檢測(cè)為野生型。考慮主要與檢測(cè)方法靈敏度相關(guān)。Liu等[11]采用直接測(cè)序法檢測(cè)患者血漿EGFR突變發(fā)現(xiàn),突變率僅為5.1%,遠(yuǎn)低于組織樣本檢測(cè)結(jié)果。而采用敏感性更高的ARMS法重新檢測(cè)發(fā)現(xiàn),5例血漿直接測(cè)序法陰性患者ARMS法檢測(cè)為陽(yáng)性。Rosell等[12]發(fā)現(xiàn),晚期NSCLC患者和低分化癌患者,血漿突變檢出率更高,與組織樣本檢測(cè)具有更高一致性,這可能與晚期患者腫瘤負(fù)荷較大、低分化腫瘤侵襲性強(qiáng),更易血性轉(zhuǎn)移相關(guān),提示腫瘤負(fù)荷與血漿突變檢出率具有相關(guān)性。微數(shù)字PCR法是以單分子反應(yīng)為基礎(chǔ)的極高選擇性檢測(cè)方法,該技術(shù)能夠較易實(shí)現(xiàn)對(duì)單個(gè)分子的檢測(cè),Yung等[13]報(bào)道其檢測(cè)準(zhǔn)確度高達(dá)99%以上,但在對(duì)12例組織直接測(cè)序法檢測(cè)突變陽(yáng)性患者的血漿應(yīng)用微數(shù)字PCR檢測(cè)時(shí)仍有1例患者血漿檢測(cè)陰性,推測(cè)腫瘤異質(zhì)性可能是影響檢測(cè)結(jié)果的因素之一。本研究中,3例組織19 Del患者血漿檢測(cè)為21 L858R,5例組織21 L858R患者血漿檢測(cè)為19 Del,可能與腫瘤自身內(nèi)部、原發(fā)灶與外周血液間等存在異質(zhì)性相關(guān)。本研究中,2例(2.7%)組織檢測(cè)陰性患者血漿檢測(cè)為突變陽(yáng)性,這與Li等[14]的報(bào)道類似,其研究中4例(80%)組織檢測(cè)陰性而血漿陽(yáng)性患者服用TKI后療效較差,提示該血漿檢測(cè)陽(yáng)性結(jié)果可能為假陽(yáng)性。

    REDE-DHPLC具有快速、經(jīng)濟(jì)、自動(dòng)化程度高、可高通量檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn),與組織EGFR突變檢測(cè)結(jié)果具有較高一致性,可作為臨床血漿EGFR突變檢測(cè)有效方法。

    [1]Travis WD,Brambilla E,Riely GJ.New pathologic classification of lung cancer:relevance for clinical practice and clinical trials[J].J Clin Oncol,2013,31(8):992-1001.

    [2]Zhao X,Han RB,Zhao J,et al.Comparison of epidermal growth factor receptor mutation statuses in tissue and plasma in stage Ⅰ-Ⅳ non-small cell lung cancer patients[J].Respiration,2013,85(2):119-125.

    [3]Chen YM,Fan WC,Tseng PC,et al.Plasma epidermal growth factor receptor mutation analysis and possible clinical applications in pulmonary adenocarcinoma patients treated with erlotinib[J].Oncol Lett,2012,3(3):713-717.

    [4]Sun H,Gan ZC,Gao JJ,et al.Non-invasive detection of EGFR deletion at exon 19 in non-small cell lung cancer by real time diagnostic[J].Clin Lab,2014,60(9):1517-1526.

    [5]Bai H,Mao L,Wang HS,et al.Epidermal growth factor receptor mutations in plasma DNA samples predict tumor response in Chinese patients with stages IIIB to IV non-small-cell lung cancer[J].J Clin Oncol,2009,27(16):2653-2659.

    [6]Mok TS,Wu YL,Thongprasert S,et al.Gefitinib or carboplatin-paclitaxel in pulmonary adenocarcinoma[J].N Engl J Med,2009,361(10):947-957.

    [7]Mitsudomi T,Morita S,Yatabe Y,et al.Gefitinib versus cisplatin plus docetaxel in patients with non-small-cell lung cancer harbouring mutations of the epidermal growth factor receptor (WJTOG3405):an open label,randomised phase 3 trial[J].Lancet Oncol,2010,11(2):121-128.

    [8]Pan JB,Hou YH,Zhang GJ.Correlation between efficacy of the EGFR tyrosine kinase inhibitor and serum tumor markers in lung adenocarcinoma patients[J].Clin Lab,2014,60(9):1439-1447.

    [9]Ellison G,Zhu G,Moulis A,et al.EGFR mutation testing in lung cancer:a review of available methods and their use for analysis of tumour tissue and cytology samples[J].J Clin Pathol,2013,66(2):79-89.

    [10]楊卓,龍美娟,王斐,等.酶切富集聯(lián)合DHPLC檢測(cè)腫瘤患者外周血EGFR和KRAS基因突變及其臨床應(yīng)用[J].中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2011,34(4):327-332.

    [11]Liu Y,Liu B,Li XY,et al.A comparison of ARMS and direct sequencing for EGFR mutation analysis and tyrosine kinase inhibitors treatment prediction in body fluid samples of non-small-cell lung cancer patients[J].J Exp Clin Cancer Res,2011,30(1):111.

    [12]Rosell R,Carcereny E,Gervais R,et al.Erlotinib versus standard chemotherapy as first-line treatment for European patients with advanced EGFR mutation-positive non-small-cell lung cancer (EURTAC):a multicentre,open-label,randomised phase 3 trial[J].Lancet Oncol,2012,13(3):239-246.

    [13]YungTK,ChanK.,MokTS,etal.Single-

    Molecule detection of epidermal growth factor receptor mutations in plasma by microfluidics digital PCR in Non-Small cell lung cancer patients[J].Clin Cancer Res,2009,15(6):2076-2084.

    [14]Li X,Ren R,Ren S,et al.Peripheral blood for epidermal growth factor receptor mutation detection in non-small cell lung cancer patients[J].Transl Oncol,2014,7(3):341-348.

    Detect of plasma EGFR mutations in NSCLC by REDE-DHPLC method and its clinical significance*

    QueDan1,XiaoHe1,ChenChuan1,LanMeiling1,LiJian1,HuangHuan1,ZhaoLianhua1,XiaoHualiang2,WangGe1△

    (1.TumorCenter;2.DepartmentofPathology,ResearchInstituteofFieldSurgery,ThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400042,China)

    ObjectiveTo investigate the clinical application value of peripheral blood epidermal growth factor receptor (EGFR) mutations in non-small cell lung cancer (NSCLC) detected by the restriction endonuclease digestion combine with denaturing high performance liquid chromatography (REDE-DHPLC).MethodsFour hundred and three patients with NSCLC in our department were detected plasma EGFR mutations for exons 19 and 21 by the REDE-DHPLC method.The relationships of EGFR mutations with the patients′ clinical characteristics at baseline were analyzed.Among 403 patients,115 cases were detected EGFR mutations in tumor tissue by simultaneously adopting the ARMS method.The consistency of the two methods was compared.ResultsThe total activating mutation rate of EGFR was 26.3 %( 106/403) in plasma.The mutation rate in female,non-smoking,adenocarcinoma and stage ⅢB-Ⅳ were significantly higher than that in men,smoking,non-adenocarcinoma and stage ⅠA-ⅢA(P<0.05).The multivariate Logistic analysis results showed that gender,smoking history and histological types were the independent predictors of EGFR mutations in plasma(P<0.05).In the 115 matched samples,taking the tissue samples as standards,the sensitivity,specificity,positive predictive value and negative predictive value of the REDE-DHPLC for detecting EGFR mutation were 69.0%,97.3%,93.5% and 84.5% respectively.The two detection methods had better consistency(κ=0.702,P<0.01).ConclusionGender,smoking history and histological types are the independent predictors of plasma EGFR mutation.REDE-DHPLC has higher sensitivity and higher specificity for detecting plasma EGFR mutation.

    carcinoma,non-small-cell lung;chromatography,high pressure liguid;enzyme digestion enrichment;receptor,epidermal growth factor

    10.3969/j.issn.1671-8348.2016.13.013

    吳階平基金資助項(xiàng)目(320.6750.12228;320.6750.12177)。作者簡(jiǎn)介:闕丹(1988-),在讀碩士研究生,醫(yī)師,主要從事肺癌靶向治療方面研究?!?/p>

    ,Tel:(023)68757617;E-mail:wangge70@hotmail.com。

    R734.2

    A

    1671-8348(2016)13-1767-03

    2015-11-21

    2016-01-16)

    猜你喜歡
    一致性血漿檢測(cè)
    糖尿病早期認(rèn)知功能障礙與血漿P-tau217相關(guān)性研究進(jìn)展
    關(guān)注減污降碳協(xié)同的一致性和整體性
    公民與法治(2022年5期)2022-07-29 00:47:28
    “不等式”檢測(cè)題
    “一元一次不等式”檢測(cè)題
    “一元一次不等式組”檢測(cè)題
    注重教、學(xué)、評(píng)一致性 提高一輪復(fù)習(xí)效率
    血漿置換加雙重血漿分子吸附對(duì)自身免疫性肝炎合并肝衰竭的細(xì)胞因子的影響
    IOl-master 700和Pentacam測(cè)量Kappa角一致性分析
    CHF患者血漿NT-proBNP、UA和hs-CRP的變化及其臨床意義
    小波變換在PCB缺陷檢測(cè)中的應(yīng)用
    亚洲人成网站在线观看播放| 黄色一级大片看看| 蜜桃在线观看..| 人妻 亚洲 视频| 国产伦在线观看视频一区| av福利片在线观看| 色婷婷av一区二区三区视频| 日本av手机在线免费观看| 国产美女午夜福利| 国产精品国产av在线观看| 大香蕉久久网| 色综合色国产| 熟女av电影| 亚洲无线观看免费| 亚洲性久久影院| 欧美激情极品国产一区二区三区 | 亚洲精品,欧美精品| 蜜臀久久99精品久久宅男| 亚洲欧美日韩无卡精品| 国产精品av视频在线免费观看| 丰满人妻一区二区三区视频av| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 成人特级av手机在线观看| 亚洲国产精品成人久久小说| av视频免费观看在线观看| 国产免费一级a男人的天堂| 最近最新中文字幕免费大全7| 六月丁香七月| 国产大屁股一区二区在线视频| 伦理电影大哥的女人| 成人黄色视频免费在线看| 舔av片在线| 午夜激情福利司机影院| 国产成人a区在线观看| 在线亚洲精品国产二区图片欧美 | 日韩av免费高清视频| 国产精品一区二区在线不卡| 美女福利国产在线 | 日韩欧美一区视频在线观看 | 少妇高潮的动态图| h日本视频在线播放| av在线蜜桃| 日本av免费视频播放| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 99久久精品热视频| 亚洲av日韩在线播放| 插逼视频在线观看| 欧美精品一区二区大全| 男人舔奶头视频| 在线观看一区二区三区| av又黄又爽大尺度在线免费看| 国模一区二区三区四区视频| 亚洲精品久久午夜乱码| 国产在视频线精品| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 亚洲成人一二三区av| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 成人综合一区亚洲| 日韩成人伦理影院| 最近中文字幕2019免费版| 男女边摸边吃奶| 亚洲av成人精品一二三区| 精品久久久久久久久av| 亚洲色图综合在线观看| 五月天丁香电影| 国产一级毛片在线| 亚洲第一av免费看| 乱系列少妇在线播放| 女性被躁到高潮视频| 免费看日本二区| 丝袜喷水一区| 国产精品99久久久久久久久| 国产成人精品久久久久久| 精华霜和精华液先用哪个| 97超视频在线观看视频| 一级毛片久久久久久久久女| 国产精品久久久久成人av| 日本黄色片子视频| 精品亚洲成a人片在线观看 | av一本久久久久| 天天躁日日操中文字幕| 国产精品99久久99久久久不卡 | 久久热精品热| 最黄视频免费看| 欧美精品国产亚洲| 国产免费视频播放在线视频| 深爱激情五月婷婷| 最后的刺客免费高清国语| a级毛色黄片| 亚洲不卡免费看| 久久久精品免费免费高清| 性高湖久久久久久久久免费观看| 午夜福利高清视频| 成人国产麻豆网| 欧美性感艳星| 国产精品熟女久久久久浪| 在线亚洲精品国产二区图片欧美 | 一本久久精品| 性色avwww在线观看| 五月天丁香电影| 婷婷色av中文字幕| 国产高清三级在线| 国产成人freesex在线| 国产永久视频网站| 亚洲成人中文字幕在线播放| 中国三级夫妇交换| 在线观看三级黄色| 18禁在线播放成人免费| 欧美日韩国产mv在线观看视频 | 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 一区二区av电影网| 美女国产视频在线观看| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91 | 99热6这里只有精品| 成人午夜精彩视频在线观看| 男女下面进入的视频免费午夜| 美女内射精品一级片tv| 国产色婷婷99| 久久久亚洲精品成人影院| 国产精品爽爽va在线观看网站| 色视频www国产| 久久鲁丝午夜福利片| 成人国产麻豆网| 亚洲欧美清纯卡通| 美女中出高潮动态图| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 毛片一级片免费看久久久久| 久久婷婷青草| 黄片wwwwww| 超碰av人人做人人爽久久| 最后的刺客免费高清国语| 精品人妻熟女av久视频| 国产深夜福利视频在线观看| av在线蜜桃| 久久ye,这里只有精品| 美女视频免费永久观看网站| 成年美女黄网站色视频大全免费 | 一级毛片 在线播放| 国产人妻一区二区三区在| 亚洲国产精品999| 精品国产乱码久久久久久小说| 一级毛片我不卡| 国产色婷婷99| av国产免费在线观看| 亚洲高清免费不卡视频| 国产av一区二区精品久久 | 午夜福利视频精品| a级毛色黄片| 老女人水多毛片| 黄色欧美视频在线观看| 亚洲精品一二三| 国产精品一区二区在线观看99| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 国产精品无大码| 欧美少妇被猛烈插入视频| 国模一区二区三区四区视频| 在线 av 中文字幕| 久久国产亚洲av麻豆专区| 国产精品国产三级国产专区5o| 一级爰片在线观看| 成人亚洲精品一区在线观看 | 人人妻人人添人人爽欧美一区卜 | 欧美激情国产日韩精品一区| 日韩人妻高清精品专区| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 嫩草影院入口| 在线免费观看不下载黄p国产| 99久久人妻综合| 国产成人freesex在线| av在线观看视频网站免费| 夫妻午夜视频| 日本欧美国产在线视频| 国产日韩欧美在线精品| 2021少妇久久久久久久久久久| 丰满少妇做爰视频| 91精品国产九色| 亚洲无线观看免费| 午夜福利在线在线| 多毛熟女@视频| 国产精品久久久久久精品电影小说 | 欧美成人午夜免费资源| 伦精品一区二区三区| 亚洲av中文av极速乱| 国产亚洲欧美精品永久| 国产片特级美女逼逼视频| 最近最新中文字幕大全电影3| 亚洲三级黄色毛片| 国产探花极品一区二区| 国产爱豆传媒在线观看| 丰满人妻一区二区三区视频av| 亚洲,一卡二卡三卡| 少妇熟女欧美另类| 免费少妇av软件| 网址你懂的国产日韩在线| 久久精品人妻少妇| 各种免费的搞黄视频| 国产av国产精品国产| 亚洲欧美日韩另类电影网站 | 日韩成人伦理影院| 交换朋友夫妻互换小说| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 一二三四中文在线观看免费高清| 97精品久久久久久久久久精品| 国产大屁股一区二区在线视频| 欧美人与善性xxx| 亚洲一区二区三区欧美精品| 各种免费的搞黄视频| 在线观看免费高清a一片| 性色av一级| 午夜免费观看性视频| 成年美女黄网站色视频大全免费 | 国产精品一区www在线观看| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 亚洲欧美成人精品一区二区| 两个人的视频大全免费| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 欧美一区二区亚洲| 国产 精品1| 国产成人a区在线观看| 女人久久www免费人成看片| 国产亚洲5aaaaa淫片| 一本色道久久久久久精品综合| 天天躁日日操中文字幕| 亚洲精品第二区| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 欧美激情国产日韩精品一区| 2022亚洲国产成人精品| 国产精品欧美亚洲77777| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 啦啦啦啦在线视频资源| 午夜免费男女啪啪视频观看| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 美女国产视频在线观看| 国产黄片视频在线免费观看| 国产精品一二三区在线看| 18+在线观看网站| 亚洲电影在线观看av| 久久久久久伊人网av| 男男h啪啪无遮挡| 免费看av在线观看网站| 国产探花极品一区二区| 少妇被粗大猛烈的视频| 天堂8中文在线网| 久久精品久久久久久久性| 亚洲精品一二三| 国产有黄有色有爽视频| 亚洲美女黄色视频免费看| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91 | 少妇熟女欧美另类| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 国产精品成人在线| 最近中文字幕高清免费大全6| 欧美 日韩 精品 国产| 色综合色国产| 亚洲av.av天堂| 在现免费观看毛片| 亚洲人成网站在线观看播放| 国产黄频视频在线观看| 亚洲精品久久午夜乱码| 熟妇人妻不卡中文字幕| 99视频精品全部免费 在线| 精品午夜福利在线看| av女优亚洲男人天堂| 久久这里有精品视频免费| 2022亚洲国产成人精品| 少妇人妻一区二区三区视频| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 嘟嘟电影网在线观看| av视频免费观看在线观看| 久久99蜜桃精品久久| 亚洲色图综合在线观看| av线在线观看网站| 全区人妻精品视频| 少妇的逼好多水| 国产精品国产三级国产专区5o| 日韩av免费高清视频| 欧美成人一区二区免费高清观看| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 亚洲av欧美aⅴ国产| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图 | 在线观看免费日韩欧美大片 | 日本色播在线视频| 好男人视频免费观看在线| 成人美女网站在线观看视频| 国产乱人视频| 搡老乐熟女国产| 亚洲国产成人一精品久久久| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 一边亲一边摸免费视频| 少妇熟女欧美另类| 久久99热6这里只有精品| 精品视频人人做人人爽| 亚洲av国产av综合av卡| 久久影院123| 欧美极品一区二区三区四区| 久久人妻熟女aⅴ| 欧美zozozo另类| 国产精品不卡视频一区二区| 国产视频首页在线观看| 赤兔流量卡办理| 国产亚洲欧美精品永久| 亚洲三级黄色毛片| 高清av免费在线| av黄色大香蕉| 亚洲av.av天堂| 免费黄网站久久成人精品| 黄片无遮挡物在线观看| 妹子高潮喷水视频| 亚洲欧美精品专区久久| 美女高潮的动态| 午夜日本视频在线| 少妇熟女欧美另类| 亚洲真实伦在线观看| 黄色视频在线播放观看不卡| 久久久久久久久久久免费av| 亚洲成人手机| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 久久6这里有精品| 久久久久久久久久成人| 视频中文字幕在线观看| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频 | 少妇裸体淫交视频免费看高清| 国产午夜精品一二区理论片| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 秋霞伦理黄片| 国国产精品蜜臀av免费| 亚洲人成网站在线观看播放| 色婷婷av一区二区三区视频| 国产精品一二三区在线看| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 卡戴珊不雅视频在线播放| 亚洲第一av免费看| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91 | 午夜福利网站1000一区二区三区| 久久久久网色| 中文天堂在线官网| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 两个人的视频大全免费| 精品人妻熟女av久视频| 亚洲av国产av综合av卡| a级毛色黄片| freevideosex欧美| 天堂俺去俺来也www色官网| 这个男人来自地球电影免费观看 | 日韩亚洲欧美综合| 亚洲av欧美aⅴ国产| 国产老妇伦熟女老妇高清| 制服丝袜香蕉在线| 国产淫片久久久久久久久| 在线看a的网站| 美女cb高潮喷水在线观看| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 国产有黄有色有爽视频| 老司机影院成人| 亚洲第一区二区三区不卡| 性色avwww在线观看| 最近中文字幕2019免费版| 欧美成人一区二区免费高清观看| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 能在线免费看毛片的网站| 黑丝袜美女国产一区| 国产免费一区二区三区四区乱码| 高清午夜精品一区二区三区| 女性被躁到高潮视频| 身体一侧抽搐| 国产精品久久久久久精品电影小说 | 最近中文字幕高清免费大全6| 内射极品少妇av片p| 在线观看美女被高潮喷水网站| 国产成人一区二区在线| 在线亚洲精品国产二区图片欧美 | 在线观看av片永久免费下载| 久久精品国产亚洲网站| 国产黄频视频在线观看| 国产v大片淫在线免费观看| 亚洲天堂av无毛| 国产精品伦人一区二区| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 99热这里只有精品一区| www.色视频.com| 又爽又黄a免费视频| 国产成人免费观看mmmm| 久久国产精品男人的天堂亚洲 | 国产成人freesex在线| 久久青草综合色| 久久精品国产亚洲av涩爱| 国产黄片视频在线免费观看| 亚洲经典国产精华液单| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 欧美最新免费一区二区三区| av国产久精品久网站免费入址| 波野结衣二区三区在线| 中文字幕精品免费在线观看视频 | 国产乱来视频区| 国产精品国产三级专区第一集| 99热全是精品| av国产免费在线观看| 久久久久久人妻| 亚洲国产精品专区欧美| 99热这里只有是精品50| 国产精品欧美亚洲77777| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 丰满乱子伦码专区| 一个人看视频在线观看www免费| 一区二区三区四区激情视频| 亚洲最大成人中文| 能在线免费看毛片的网站| 欧美三级亚洲精品| 最近2019中文字幕mv第一页| 国产黄频视频在线观看| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 亚洲伊人久久精品综合| 青春草视频在线免费观看| 免费av中文字幕在线| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 久久综合国产亚洲精品| 亚洲性久久影院| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 国产黄片美女视频| 婷婷色综合www| 1000部很黄的大片| 久久99热6这里只有精品| 日本午夜av视频| 欧美成人午夜免费资源| 亚洲av福利一区| 精品亚洲成国产av| 有码 亚洲区| 日韩成人伦理影院| 毛片一级片免费看久久久久| 永久网站在线| 国产精品国产三级国产专区5o| 日本色播在线视频| videos熟女内射| 2018国产大陆天天弄谢| 人妻一区二区av| 亚洲色图综合在线观看| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 人妻少妇偷人精品九色| 欧美日韩在线观看h| 国产欧美日韩一区二区三区在线 | 看非洲黑人一级黄片| 精品人妻一区二区三区麻豆| 国产男女内射视频| 99re6热这里在线精品视频| 国产精品久久久久久av不卡| 亚洲av日韩在线播放| 99热6这里只有精品| 哪个播放器可以免费观看大片| 老熟女久久久| 国产男女内射视频| 内射极品少妇av片p| 精品久久久久久久末码| 边亲边吃奶的免费视频| 婷婷色av中文字幕| av免费在线看不卡| 免费看不卡的av| 亚洲色图综合在线观看| 日本-黄色视频高清免费观看| 国产 精品1| 日本av免费视频播放| 亚洲精品一区蜜桃| 国国产精品蜜臀av免费| 久久久久国产网址| 国产精品熟女久久久久浪| 国产黄色免费在线视频| 日韩 亚洲 欧美在线| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 51国产日韩欧美| 欧美日韩视频精品一区| 亚洲人成网站在线播| 十分钟在线观看高清视频www | 伊人久久精品亚洲午夜| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 欧美三级亚洲精品| 一级黄片播放器| 街头女战士在线观看网站| 国产深夜福利视频在线观看| 亚洲内射少妇av| 久久精品国产亚洲av涩爱| 一级毛片我不卡| 永久免费av网站大全| 久久精品夜色国产| 精品国产乱码久久久久久小说| 免费黄频网站在线观看国产| 国产精品爽爽va在线观看网站| 伊人久久精品亚洲午夜| 亚洲综合精品二区| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 嘟嘟电影网在线观看| 十分钟在线观看高清视频www | 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 国产免费视频播放在线视频| 寂寞人妻少妇视频99o| 亚洲欧美日韩另类电影网站 | 人妻少妇偷人精品九色| 国产真实伦视频高清在线观看| 精品人妻一区二区三区麻豆| 国产视频首页在线观看| av天堂中文字幕网| 少妇人妻精品综合一区二区| 国内揄拍国产精品人妻在线| 亚洲丝袜综合中文字幕| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 国产在线视频一区二区| 2021少妇久久久久久久久久久| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| av线在线观看网站| 伦理电影免费视频| 久久国产精品大桥未久av | 午夜免费男女啪啪视频观看| 99久久综合免费| 中文字幕av成人在线电影| 国产精品一二三区在线看| 美女国产视频在线观看| 在线播放无遮挡| 六月丁香七月| 亚洲av国产av综合av卡| 久热久热在线精品观看| 黑人高潮一二区| 熟女av电影| 午夜老司机福利剧场| 婷婷色麻豆天堂久久| 国产在线一区二区三区精| 九色成人免费人妻av| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 午夜福利影视在线免费观看| 三级国产精品欧美在线观看| 人妻系列 视频| 久久99热这里只有精品18| 少妇的逼水好多| 亚洲高清免费不卡视频| 日日啪夜夜撸| 精品亚洲成国产av| 青青草视频在线视频观看| 亚洲电影在线观看av| 干丝袜人妻中文字幕| 国产成人免费观看mmmm| 蜜桃在线观看..| 日韩欧美精品免费久久| 久久久亚洲精品成人影院| 午夜精品国产一区二区电影| 日韩av免费高清视频| 少妇高潮的动态图| 51国产日韩欧美| www.色视频.com| 久久这里有精品视频免费| 午夜福利视频精品| 国产黄色免费在线视频| 亚洲国产精品国产精品| av一本久久久久| 五月开心婷婷网| 丝袜脚勾引网站| 搡女人真爽免费视频火全软件| 99久久精品一区二区三区| 男男h啪啪无遮挡| 男人舔奶头视频| 精品亚洲成a人片在线观看 | 大陆偷拍与自拍| 少妇熟女欧美另类| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 99国产精品免费福利视频| 国产精品久久久久成人av| av免费观看日本| h视频一区二区三区| 六月丁香七月| 久久99精品国语久久久| 在线观看一区二区三区激情| 久久6这里有精品| 中文字幕av成人在线电影| 日日啪夜夜爽| 综合色丁香网| 欧美精品一区二区大全| 老熟女久久久| 一级毛片久久久久久久久女| 人妻夜夜爽99麻豆av| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 国产高清国产精品国产三级 | 亚洲精品成人av观看孕妇| 国产成人免费观看mmmm| 一个人看视频在线观看www免费| 亚洲国产色片| 亚洲av成人精品一二三区| 久久毛片免费看一区二区三区| 国产在视频线精品| 精品久久久久久久久亚洲| 赤兔流量卡办理| 春色校园在线视频观看| 国产一区二区在线观看日韩| 国产午夜精品一二区理论片| 婷婷色综合www| 国产一区二区在线观看日韩| 午夜免费男女啪啪视频观看| 日本一二三区视频观看| 看非洲黑人一级黄片| 蜜桃在线观看..| 热99国产精品久久久久久7| 男女下面进入的视频免费午夜| 蜜桃在线观看..| 春色校园在线视频观看| 看非洲黑人一级黄片| 亚洲欧美成人精品一区二区| 国产精品嫩草影院av在线观看| 搡女人真爽免费视频火全软件| 亚洲无线观看免费| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 精品国产三级普通话版| 91狼人影院| 国产老妇伦熟女老妇高清| 99久久精品热视频| 精品少妇黑人巨大在线播放| 国产精品99久久99久久久不卡 | 最新中文字幕久久久久|