免疫球蛋白對(duì)HFMD合并AFP患兒的保護(hù)作用及機(jī)制*

李紅梅，肖　農(nóng)，陳玉霞，劉　祎

(1.重慶市紅十字會(huì)醫(yī)院兒科　400020;2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院神經(jīng)康復(fù)科　400014)

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論著·臨床研究

免疫球蛋白對(duì)HFMD合并AFP患兒的保護(hù)作用及機(jī)制*

李紅梅1，肖農(nóng)2，陳玉霞2，劉祎2

(1.重慶市紅十字會(huì)醫(yī)院兒科400020;2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院神經(jīng)康復(fù)科400014)

目的研究靜脈注射人血免疫球蛋白(IVIG)對(duì)手足口病(HFMD)合并急性弛緩性癱瘓(AFP)患兒的保護(hù)作用及免疫學(xué)機(jī)制。方法受試者分為HFMD合并AFP免疫球蛋白治療前組(治療前組)，免疫球蛋白治療組(IVIG組)，無(wú)免疫球蛋白治療組(無(wú)IVIG組)和健康對(duì)照組(對(duì)照組)，各30例。采用手法肌力評(píng)定法(MMT)檢測(cè)患兒肌力，采用生物素雙抗原夾心酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)各組血清抗神經(jīng)節(jié)苷脂M1(GM1)抗體、白細(xì)胞介素(IL)-6、IL-8、腫瘤壞死因子α(TNF-α)。結(jié)果IVIG組較治療前組和無(wú)IVIG組的肌力恢復(fù)明顯。同時(shí)，抗GM1抗體、IL-6、IL-8、TNF-α在3組HFMD合并AFP患兒中均較對(duì)照組高，而IVIG組抗GM1抗體、IL-6、IL-8、TNF-α較治療前組和無(wú)IVIG組顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論IVIG對(duì)HFMD合并AFP患者有明顯的治療作用，其機(jī)制可能通過(guò)拮抗高水平抗GM1抗體、IL-6、IL-8、TNF-α等細(xì)胞因子，實(shí)現(xiàn)免疫調(diào)節(jié)作用。

手足口病；免疫球蛋白；急性弛緩性癱瘓；細(xì)胞因子

手足口病(hand foot and mouth disease，HFMD)是腸道病毒引起的傳染病，多發(fā)生于學(xué)齡前兒童，多數(shù)具有自限性。然而少數(shù)重癥病例中，患兒可表現(xiàn)出嚴(yán)重的神經(jīng)并發(fā)癥，如急性弛緩性癱瘓(acute flaccid paralysis,AFP)[1-2]。如果病情發(fā)展快，導(dǎo)致死亡。目前，治療重癥小兒HFMO缺乏特效藥物[3]。作者的前期研究發(fā)現(xiàn)IVIG治療HFMD合并AFP患兒，具有減輕癥狀、縮短病程、改善預(yù)后的臨床療效[4]。同時(shí)，多項(xiàng)研究報(bào)道HFMD合并AFP的發(fā)病可能與病毒的直接損傷和免疫性損傷有關(guān)，免疫異常參與了HFMD合并AFP的病理生理過(guò)程[5-6]。重癥HFMO常由EV71型腸道病毒感染所致，靜脈注射人血免疫球蛋白(intravenous Immunoglobulin，IVIG)可作為重癥腸道病毒感染的免疫治療方法[7]。然而IVIG治療HFMD合并AFP的確切免疫學(xué)機(jī)制目前尚不清楚。本研究旨在探討IVIG在HFMD合并AFP的作用及免疫學(xué)機(jī)制。

1　資料與方法

1.1一般資料2012年8月至2014年9月在重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院和重慶市紅十字會(huì)醫(yī)院收治的260例HFMD患兒中選擇60例(男30例，女30例)嚴(yán)重程度基本對(duì)等的HFMD合并AFP患兒及30例年齡、性別相當(dāng)?shù)慕】祪和癁檠芯繉?duì)象，年齡在2～6歲，患兒均符合衛(wèi)生部制定的《手足口病診療指南(2010版)》[8]和AFP診斷標(biāo)準(zhǔn)[9]。同時(shí)均排除神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等基礎(chǔ)疾病。擬給予IVIG治療的患兒入院后2 h內(nèi)(IVIG治療前)和注射 IVIG 2 g·kg-1·d-1×5 d后24 h內(nèi)抽取血樣，無(wú)IVIG治療的患兒于常規(guī)治療5 d后24 h內(nèi)抽取血樣。樣本共分為4組，分別為治療前組、IVIG組、無(wú)IVIG治療組和健康對(duì)照組。研究對(duì)象監(jiān)護(hù)人簽署知情同意書(shū)，所有研究均獲重慶市紅十字會(huì)醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究倫理委員會(huì)審批同意。

1.2肌力檢測(cè)采用手法肌力評(píng)定法檢測(cè)患兒肌力。按照肌力的情況分為0～5級(jí)。

1.3樣本收集及細(xì)胞因子測(cè)定各組樣本抽取靜脈血3 mL，2 000 r/min離心8 min，分離血清標(biāo)本保存于-80 ℃?zhèn)溆?。采用酶?lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)血清中抗GM1抗體、白細(xì)胞介素(IL)-6、IL-8和腫瘤壞死因子α(TNF-α)水平，操作步驟嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。IL-6、IL-8和 TNF-α試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所，抗GM1抗體試劑盒購(gòu)于上海研吉生物有限公司。

2　結(jié)　果

2.1IVIG促進(jìn)HFMD合并AFP患兒患肢肌力恢復(fù)手法肌力評(píng)定法檢測(cè)各組HFMD合并AFP患兒患肢肌力結(jié)果顯示，IVIG組患肢肌力級(jí)數(shù)較治療前組和無(wú)IVIG組顯著提高(P<0.05)，見(jiàn)表1。以上提示，IVIG治療是緩解HFMD合并AFP患兒主要癥狀的有效方法。

表1　HFMD合并AFP患兒患肢肌力比較[n(%)]

aP<0.05，與治療前組比較；bP<0.05，與無(wú)IVIG組比較。

2.2免疫學(xué)相關(guān)細(xì)胞因子變化ELISA結(jié)果顯示在各組HFMD合并AFP患兒免疫學(xué)相關(guān)細(xì)胞因子抗GM1抗體、IL-6、IL-8和TNF-α均較健康對(duì)照組增高(P<0.05)。然而，IVIG組抗GM1抗體、IL-6、IL-8和TNF-α的水平均較治療前組和無(wú)IVIG組減低(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2　各組HFMD合并AFP患兒細(xì)胞因子變化的比較±s)

a:P<0.01，與健康對(duì)照組比較;b:P<0.01，與治療前組比較；c:P<0.05,與無(wú)IVIG組比較。

3　討　論

目前HFMD合并AFP無(wú)特效抗病毒治療方法，缺乏有效的治療手段。IVIG是從健康人血清中提取的混合的正常多克隆IgG，包含有多反應(yīng)性天然抗體，針對(duì)異型抗原的抗體，能中和毒素，調(diào)節(jié)炎性介質(zhì)的產(chǎn)生，改善機(jī)體內(nèi)環(huán)境[10]。其機(jī)制主要通過(guò)以下3種途徑發(fā)揮作用[11]：(1)IVIG 含有針對(duì)病毒自身的中和抗體，可以直接作用于病毒，使其失去感染性[12];(2)其IgG Fc段具有免疫調(diào)節(jié)作用，能競(jìng)爭(zhēng)性中和Fc受體，通過(guò)Fc段唾液酸化，誘導(dǎo)抗炎反應(yīng)[13];(3)IVIG含有針對(duì)IL-6、IL-8、干擾素等細(xì)胞因子的抗體[14]。在我們的前期研究中發(fā)現(xiàn)，IVIG可緩解HFMD合并AFP患者臨床癥狀，縮短病程[4]。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，IVIG治療后的HFMD合并AFP患者患肢肌力級(jí)數(shù)較治療前組和無(wú)IVIG組顯著提高。由此提示，IVIG是治療HFMD合并AFP的一個(gè)有效藥物。然而，IVIG治療HFMD合并AFP的具體機(jī)制如何，值得進(jìn)一步研究。

研究發(fā)現(xiàn)，重癥HFMD，尤其EV71 感染的HFMD，其發(fā)病機(jī)制可能與病毒的直接侵犯和免疫性損傷有關(guān)，失調(diào)的炎癥反應(yīng)和免疫異常參與了重癥HFMD 患兒的病理過(guò)程[5-6]。Chen等[15]在小鼠實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)癱瘓的病因機(jī)制同脊髓灰質(zhì)炎相似，EV71可以沿神經(jīng)傳導(dǎo)，病毒首先于脊髓低節(jié)段特別是前角出現(xiàn)并迅速增加，之后逐漸擴(kuò)散至脊髓高位節(jié)段和腦組織。同時(shí)，有研究發(fā)現(xiàn)一些HFMD合并AFP患兒的神經(jīng)傳導(dǎo)速度結(jié)果異常，提示HFMD合并AFP存在周圍神經(jīng)損害。以上提示HFMD合并AFP可能與病毒引起的自身免疫反應(yīng)有關(guān)。因此，免疫異?？赡苁荋FMD合并AFP的重要機(jī)制之一。

近年來(lái)，隨著抗神經(jīng)節(jié)苷脂抗體參與免疫介導(dǎo)的周圍神經(jīng)疾病如急性吉蘭-巴雷綜合征、多灶運(yùn)動(dòng)神經(jīng)病、慢性炎性脫鞘性多發(fā)周圍神經(jīng)病等疾病的研究逐漸不斷深入，其在免疫介導(dǎo)的神經(jīng)疾病中的作用引起關(guān)注[16]。神經(jīng)節(jié)苷脂種類很多，主要根據(jù)其糖基結(jié)合唾液酸分子的數(shù)目及部位進(jìn)行分類，含一個(gè)分子唾液酸稱為GM,含2、3、4個(gè)唾液酸分子分別為GD、GT 和GQ；又根據(jù)所含己糖的數(shù)目和種類分為GM1、GM2、GM3、GM4，其中GM1是神經(jīng)膜最豐富的神經(jīng)節(jié)苷脂之一[17]。GM1參與的免疫異?？赡茉贗VIG治療HFMD合并AFP中發(fā)揮作用。

本研究結(jié)果顯示，抗GM1抗體在HFMD合并AFP患者中顯著增高，而給予IVIG治療，其濃度組較治療前和無(wú)IVIG治療組顯著下調(diào)，提示IVIG可拮抗HFMD合并AFP患兒高水平抗GM1抗體，調(diào)節(jié)免疫異常。神經(jīng)節(jié)苷脂廣泛分布于全身各組織細(xì)胞膜的外表面，以神經(jīng)系統(tǒng)含量最豐富，由碳水化合物和脂質(zhì)組成的酸性糖酯，參與神經(jīng)細(xì)胞膜的構(gòu)成，并維持其穩(wěn)定性，對(duì)細(xì)胞新陳代謝及營(yíng)養(yǎng)有重要意義。正常情況下，神經(jīng)節(jié)苷脂不受免疫系統(tǒng)的攻擊；當(dāng)感染、炎性損傷等各種刺激下，造神經(jīng)節(jié)苷脂抗原成分暴露，體內(nèi)不依賴T細(xì)胞的B淋巴細(xì)胞即產(chǎn)生抗神經(jīng)節(jié)苷脂的自身抗體，同時(shí)激活補(bǔ)體、形成免疫復(fù)合物并誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，最終導(dǎo)致神經(jīng)軸索及髓鞘的病變[18]。

外周血細(xì)胞因子檢測(cè)顯示，IL-6、IL-8、TNF-α在HFMD合并AFP患者中較對(duì)照組顯著增高，而給予IVIG治療，其濃度組較治療前和無(wú)IVIG治療組呈同步減低。有研究報(bào)道IL-6、IL-8、TNF-α均由活化的免疫細(xì)胞釋放的介質(zhì)，可直接啟動(dòng)炎性反應(yīng)過(guò)程或通過(guò)刺激其他促炎癥因子的大量釋放間接啟動(dòng)炎性反應(yīng)過(guò)程，能夠?qū)е陆M織、器官的炎癥損傷甚至衰竭、組織壞死，在細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)中起“核心”作用[19-20]，本研究表明IL-6、IL-8、TNF-α等炎癥因子參與HFMD合并AFP的發(fā)生發(fā)展，IVIG的治療作用可能通過(guò)抑制IL-6、IL-8、TNF-α等細(xì)胞因子實(shí)現(xiàn)。

抗GM1抗體、IL-6、IL-8和TNF-α細(xì)胞因子的增加是參與HFMD合并AFP患兒的發(fā)病的重要原因，IVIG對(duì)HFMD合并AFP患兒的治療作用可能是通過(guò)降低免疫學(xué)相關(guān)細(xì)胞因子GM1抗體、IL-6、IL-8和TNF-α細(xì)胞因子的表達(dá)發(fā)揮作用。

綜上所述，IVIG可部分恢復(fù)HFMD合并AFP患兒患肢肌力，其機(jī)制可能通過(guò)拮抗GM1、IL-6、IL-8、TNF-α等重要炎癥因子，從而調(diào)節(jié)自身免疫應(yīng)答，促進(jìn)疾病緩解。

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Protective effects of IVIG on hand foot and mouth disease complicating AFP and its mechanism*

LiHongmei1,XiaoNong2,ChenYuxia2,LiuYi2

(1.DepartmentofPaediatrics,ChongqingRedCrossHospital,Chongqing400020,China;2.DepartmentofNeurologicalRehabilitation,AffiliatedChildren′sHospital,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing400014,China)

ObjectiveTo study the protective effects of intravenous immunoglobulin (IVIG) on hand foot and mouth disease (HFMD) complicating acute flaccid paralysis (AFP),and to explore its immunological mechanism.MethodsThe subjects were divided into four groups in this study,including 30 cases of HFMD complicating AFP before IVIG treatment (before IVIG group),30 cases of HFMD complicating AFP with IVIG treatment group (IVIG group),30 cases of HFMD complicating AFP without IVIG treatment group (without IVIG group),and 30 healthy controls(normal control group).The manual muscle test (MMT) was carried out to detect the muscle strength,the enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) was used to test the expression of anti- GM1 antibody,IL-6,IL-8 and TNF-α.ResultsThe muscle strength in the IVIG group was significantly improved when compared with that before IVIG and without IVIG groups.Moreover,the expressions of anti- GM1 antibody,IL-6,IL-8 and TNF-α in the IVIG group,before IVIG group and without IVIG group were increased when compared with those in the normal control group.Additionally,the expressions of anti- GM1 antibody,IL-6,IL-8 and TNF-α in the IVIG group were decreased compared with those in the before IVIG group and without IVIG groups(P<0.05).ConclusionIVIG may play an important immune-related role in relieving symptoms in children with severe HFMD complicating AFP through inhibiting the high levels of the cytokines including anti- GM1 antibody,IL-6,IL-8 and TNF-α.

hand,foot and mouth disease;immunoglobulin;acute flaccid paralysis;cytokine

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.13.011

重慶市衛(wèi)生局醫(yī)學(xué)科研項(xiàng)目面上項(xiàng)目(2012-2-366)。作者簡(jiǎn)介：李紅梅(1975-)，碩士，主治醫(yī)師，主要從事兒科方面研究。

R725.1

A

1671-8348(2016)13-1761-03

2015-11-18

2016-01-03)