胃腸道間質(zhì)瘤中環(huán)氧合酶2及NF-κB的表達(dá)*

李小紅,成元華△,郭立新

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)教研室，貴陽 550004；2.四川大學(xué)華西醫(yī)院病理科，成都 610041)

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·論著·

胃腸道間質(zhì)瘤中環(huán)氧合酶2及NF-κB的表達(dá)*

李小紅1,成元華1△,郭立新2

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)教研室，貴陽 550004；2.四川大學(xué)華西醫(yī)院病理科，成都 610041)

目的探討胃腸道間質(zhì)瘤(GISTs)中環(huán)氧合酶2(COX2)及核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)基因的蛋白表達(dá)情況與臨床病理特征及預(yù)后之間的關(guān)系。方法采用免疫組織化學(xué)EnVision兩步法檢測GISTs病例腫瘤組織中COX2及NF-κB的蛋白表達(dá)情況，并對患者進(jìn)行隨訪。結(jié)果115例GISTs中：男61例，女54例，年齡19～80歲，中位年齡55歲，發(fā)病高峰年齡56～59歲。腫瘤位于胃75例、腸31例和胃腸外9例；發(fā)生于胃者最多見，占65.2%，其次為腸(占27.0%)。梭形細(xì)胞為主型95例(82.6%)、上皮樣細(xì)胞為主型10例(8.7%)和混合細(xì)胞型10例(8.7%)。極低危險(xiǎn)度組22例、低危險(xiǎn)度組33例、中危險(xiǎn)度組18例及高危險(xiǎn)度組42例。COX2蛋白陽性表達(dá)93例，陽性表達(dá)率為80.9%；NF-κB蛋白陽性表達(dá)94例，陽性表達(dá)率為81.7%。COX2蛋白及NF-κB蛋白表達(dá)情況在不同危險(xiǎn)度分組之間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，在高危險(xiǎn)度組中陽性表達(dá)率最高，而在不同性別、年齡、發(fā)生部位、組織學(xué)類型及是否轉(zhuǎn)移組間比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。59例患者獲訪，隨訪率51.3%；其中COX2蛋白強(qiáng)陽性表達(dá)(+++)29例，9例轉(zhuǎn)移，1例死亡；NF-κB蛋白強(qiáng)陽性表達(dá)(+++)32例，其中10例轉(zhuǎn)移，1例死亡。結(jié)論GISTs中COX2及 NF-κB在的表達(dá)與危險(xiǎn)度分級相關(guān)，是影響患者預(yù)后的重要因素之一。

胃腸道間質(zhì)瘤；環(huán)氧合酶2；NF-κB；免疫組織化學(xué)；預(yù)后

胃腸道間質(zhì)瘤(gastrointestinal stromal tumors，GISTs)是消化道最常見的間葉源性腫瘤。據(jù)國外文獻(xiàn)報(bào)道，其發(fā)病率約為1/10萬至2/10萬，占胃腸道腫瘤的1%～4%[1]，其預(yù)后尚難準(zhǔn)確評估。環(huán)氧合酶(cyclooxygenase，COX)是一種催化花生四烯酸轉(zhuǎn)化為前列腺素的限速酶，分為COX1、COX2和COX3 3個亞型[2]。近年來研究表明，COX2除在炎癥反應(yīng)中起重要作用外，與腫瘤也密切相關(guān)，它可刺激腫瘤細(xì)胞的增殖和生長、抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)腫瘤內(nèi)血管的形成、增加細(xì)胞侵襲力、抑制機(jī)體的免疫功能以及促進(jìn)癌前病變向腫瘤轉(zhuǎn)化等，因此在多種腫瘤組織中COX2呈高表達(dá)。NF-κB是一種普遍存在于細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子，是多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的匯聚點(diǎn)，參與多種相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)檢測了GISTs病例腫瘤組織中COX2及NF-κB基因的蛋白表達(dá)情況，以期了解COX2及NF-κB的表達(dá)與GISTs病例臨床病理特征之間的關(guān)系，并為準(zhǔn)確評估患者預(yù)后提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料收集2010年1月至2014年8月貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院病理科及2003年1月至2009年12月四川大學(xué)華西醫(yī)院病理科保存的發(fā)生在胃腸道及腹腔的并經(jīng)組織形態(tài)學(xué)、免疫組織化學(xué)和(或)分子生物學(xué)檢測確診的115例GISTs病例的蠟塊及臨床資料作為研究對象，并由兩位高年資病理醫(yī)師復(fù)查確診。根據(jù)中國抗癌協(xié)會臨床腫瘤學(xué)協(xié)作專業(yè)委員會(CSCO)胃腸間質(zhì)瘤專家委員會推薦的GISTs危險(xiǎn)度分級標(biāo)準(zhǔn)[3]，分為4個組：極低危險(xiǎn)度組22例、低危險(xiǎn)度組33例、中危險(xiǎn)度組18例及高危險(xiǎn)度組42例。

1.2方法采用免疫組織化學(xué)EnVision兩步法進(jìn)行染色，多克隆COX2抗體購自美國CST公司，稀釋度1∶500；多克隆NF-κB p65抗體購自武漢博士德生物技術(shù)有限公司，稀釋度1∶100。染色步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。每次實(shí)驗(yàn)均設(shè)立相應(yīng)的陽性對照，PBS液代替一抗作為空白對照。

1.3免疫組織化學(xué)結(jié)果判定COX2及NF-κB陽性定位于腫瘤細(xì)胞細(xì)胞質(zhì),根據(jù)以下兩方面的總分綜合判定，A 選染色均勻腫瘤區(qū)10個高倍視野，以陽性細(xì)胞所占百分比計(jì)分(0～3分)：切片中無陽性細(xì)胞，記 0分；陽性細(xì)胞率小于25%，記1分；陽性細(xì)胞率25%～50% ，記2分；陽性細(xì)胞率大于50%，記 3分。B 按染色強(qiáng)度分(0～3分)：不著色記0分；黃色記1分；棕黃色記2分；黃褐色記3分。將A和B兩項(xiàng)評分相加，0～1分為陰性(-)，2分為弱陽性(+)，3～4分為中度陽性(++)，5～6分為強(qiáng)陽性(+++)；陰性、弱陽性為低表達(dá)，中度陽性、強(qiáng)陽性為高表達(dá)。

1.4隨訪對所有病例進(jìn)行電話隨訪，隨訪截止時間為2015年4月30日。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料采用率表示，進(jìn)行χ2檢驗(yàn)；相關(guān)性采用spearson相關(guān)性檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)　果

2.1臨床病理資料115例原發(fā)性GISTs中：男61例，女54例，男∶女=1.13∶1.00；年齡19～80歲，中位年齡55歲，發(fā)病高峰年齡56～59歲。腫瘤位于胃75例、腸31例和胃腸外9例；發(fā)生于胃者最多見，占65.2%，其次為腸(占27.0%)。梭形細(xì)胞為主型95例(82.6%)、上皮樣細(xì)胞為主型10例(8.7%)和混合細(xì)胞型10例(8.7%)。極低危險(xiǎn)度和低危險(xiǎn)度組中未見轉(zhuǎn)移；中危險(xiǎn)度組中1例發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；高危險(xiǎn)度組中11例發(fā)生轉(zhuǎn)移(轉(zhuǎn)移至肝3例、淋巴結(jié)6例、脾被膜1例及肺1例)。

2.2免疫組織化學(xué)染色

2.2.1COX2的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系115例GISTs中COX2蛋白陽性表達(dá)93例，陽性表達(dá)率為80.9%；COX2蛋白表達(dá)情況在不同危險(xiǎn)度分組之間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1，并且隨著危險(xiǎn)度增加，COX2蛋白表達(dá)陽性率也增加，在中危險(xiǎn)度組及高危險(xiǎn)度組中陽性率高于極低危險(xiǎn)度組及低危險(xiǎn)度組，且COX2的蛋白表達(dá)與危險(xiǎn)度分級呈正相關(guān)(表2)。但在不同性別、年齡、發(fā)生部位、組織學(xué)類型間比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1　GISTs中COX2的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

表2　GISTs中COX2的表達(dá)與危險(xiǎn)度分級的關(guān)系(n)

2.2.2NF-κB的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系115例GISTs中NF-κB蛋白陽性表達(dá)94例，陽性表達(dá)率為81.7%。NF-κB蛋白表達(dá)情況在不同危險(xiǎn)度分組之間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，在高危險(xiǎn)度組中NF-κB陽性表達(dá)率最高(表3)，且與危險(xiǎn)度分級呈正相關(guān)(表4)，但在不同性別、年齡、發(fā)生部位及組織學(xué)類型之間比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表3　GISTs中NF-κB的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

續(xù)表3　GISTs中NF-κB的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.2.3COX2與NF-κB表達(dá)的關(guān)系115例GISTs中有84例均檢測到了COX2和NF-κB的陽性表達(dá)10例只檢測到了NF-κB表達(dá)，9例只檢測到COX2表達(dá)，12例兩者均不表達(dá)。COX2與NF-κB在GISTs中的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.457，P<0.01)。

2.3COX2及NF-κB蛋白的表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系115例GISTs中59例患者獲訪，隨訪率為51.3%。這59例中27例為高危險(xiǎn)度患者，其中1例脾被膜轉(zhuǎn)移，已經(jīng)死亡； 3例肝轉(zhuǎn)移，其中1例間斷服用伊馬替尼，6例淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；1例肺轉(zhuǎn)移。8例中度危險(xiǎn)度患者中，1例發(fā)生了淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。極低危險(xiǎn)度及低危險(xiǎn)度患者均未發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移。結(jié)果顯示，COX2、NF-κB的表達(dá)與預(yù)后具有相關(guān)性(P<0.05)；隨著COX2及NF-κB表達(dá)強(qiáng)度的增加，GISTs的轉(zhuǎn)移率增加。見圖1、2，表5。

表4　GISTs中NF-κB的表達(dá)與危險(xiǎn)度分級的關(guān)系(n)

A:陰性表達(dá)；B:陽性表達(dá)。

圖1GISTs中COX2的表達(dá)(EnVision×200)

A:陰性表達(dá)；B:陽性表達(dá)。

圖2　GISTs中NF-κB的表達(dá)(EnVision×200)表5　GISTs中COX2、NF-κB的表達(dá)與預(yù)后的相關(guān)性(n)

3　討　論

COX是前列腺素合成過程中的限速酶，分為COX1、COX2和COX3 3個亞型。在正常生理狀態(tài)下，COX2在絕大多數(shù)組織中檢測不到，只有接受相應(yīng)的刺激后細(xì)胞才開始合成，而其表達(dá)的上調(diào)常提示炎癥和腫瘤的存在。近年的研究表明，COX2除在炎癥中發(fā)揮作用外，與腫瘤也密切相關(guān)。腫瘤內(nèi)的血管是腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)，腫瘤周圍已存在的血管表達(dá)COX1，但無COX2的表達(dá)；腫瘤內(nèi)新生的血管內(nèi)皮細(xì)胞及與血管生成有關(guān)的細(xì)胞則主要表達(dá)COX2[4]。有研究發(fā)現(xiàn)，COX2在老年患者胃癌組織中的表達(dá)明顯高于老年正常胃黏膜組織及異型增生，并且COX2的表達(dá)與胃癌的分化程度、浸潤、轉(zhuǎn)移及生存期明顯相關(guān)[5]。

NF-κB是普遍存在于細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子，為細(xì)胞內(nèi)多種信號通路的交匯點(diǎn)，其活化后廣泛參與多種基因表達(dá)的調(diào)控，如COX2、VEGF、bcl-2和bax等[6-8]。既往研究發(fā)現(xiàn)，COX2啟動子上有2個NF-κB的結(jié)合位點(diǎn)，因此NF-κB對COX2的表達(dá)起到了至關(guān)重要的作用，而COX2是NF-κB下游因子中重要的效應(yīng)因子[9-10]。有研究報(bào)道，在胃癌細(xì)胞中FOXP3通過抑制NF-κB的活化而降低了COX2的表達(dá)，從而對腫瘤發(fā)揮抑制作用[11]。已有的研究普遍認(rèn)為， COX2和NF-κB的表達(dá)在胃癌的發(fā)生發(fā)展中起促進(jìn)作用[12-13]。COX2的表達(dá)受NF-κB的調(diào)控并促進(jìn)肝癌的發(fā)生已經(jīng)得到了證實(shí)[14]。

本研究檢測了COX2蛋白及NF-κB蛋白在GISTs中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示隨著GISTs危險(xiǎn)級別的增加，COX2及NF-κB的陽性表達(dá)率增加，這與以往的報(bào)道一致。本研究還發(fā)現(xiàn)GISTs中COX2蛋白及NF-κB蛋白在的表達(dá)在GISTs不同發(fā)生部位及不同組織學(xué)類型組間比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這與Sheehan等[15]報(bào)道的COX2在發(fā)生于胃的GISTs中的表達(dá)強(qiáng)于發(fā)生于腸者及與Stewart等[16]報(bào)道的當(dāng)組織學(xué)以上皮樣形態(tài)為主時COX2表達(dá)陽性率增加不符。這可能與本研究中混合細(xì)胞型及上皮樣細(xì)胞為主型GISTs所占比例過少有關(guān)。通過對在GISTs中COX2及NF-κB表達(dá)的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，COX2及NF-κB在GISTs中的表達(dá)呈正相關(guān)，結(jié)合既往研究提示在GISTs中可能存在：NF-κB的活化促進(jìn)了COX2的表達(dá)，從而促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生，但這一信號通路在GISTs中的作用尚需進(jìn)一步研究。通過對病例的隨訪，本研究發(fā)現(xiàn)在高危險(xiǎn)度組GISTs中有3例發(fā)生了肝轉(zhuǎn)移，其中1例間斷服用伊馬替尼。隨著近年來對伊馬替尼耐藥報(bào)道的增加，對GISTs的藥物治療迫切需要尋找新的靶點(diǎn)。閆競一等[17]研究發(fā)現(xiàn)，COX2抑制劑Ns-398可通過下調(diào)bcl-2基因的表達(dá)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，提示COX2抑制劑可能在GISTs藥物治療中發(fā)揮重要作用。

綜上所述，COX2及NF-κB可能在GISTs的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，可作為評價(jià)GISTs危險(xiǎn)度分級的又一潛在指標(biāo)，并為解決在GISTs中伊馬替尼耐藥問題提供了新的探索方向，但NF-κB這一信號通路在GISTs中的作用還需深入研究。

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Expression of cyclooxygenase 2 and nuclear factor-kappa B in gastrointestinal stromal tumors*

LiXiaohong1,ChengYuanhua1△,GuoLixin2

(1.DepartmentofPathology,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang,Guizhou550004,China;2.DepartmentofPathology,WestChinaHospital,SichuanUniversity,Chengdu,Sichuan610041,China)

ObjectiveTo investigate the relation between the expression situation of cyclooxygenase 2(COX2) and nuclear factor-kappa B (NF-κB) gene protein with the clinicopathologic characteristics and prognosis in gastrointestinal stromal tumors (GISTs).MethodsThe immunohistochemical EnVision two-step technique was used to assess the expression of COX2 and NF-κB protein in tumor tissue of GISTs.The patients were followed up.ResultsIn 115 cases of GISTs,61 cases were male and 54 cases were female.The age ranged 19-80 years old with the median age of 55 years old,the onset peak age was 56-59 years old.75 cases of tumor was located in stomach,31 cases in intestine and 9 cases in extragastrointestinal tract.The occurrence in the stomach was most common,accounting for 65.2%,followed by the intestine (27.0%).The spindle cell was the predominant type in 95 cases(82.6%),epithelioid cell type in 10 cases (8.7%) and 10 cases were mixed cell type(8.7%).The very low risk group had 22 cases,low risk group had 33 cases,moderate risk group had 18 cases and high risk group had 42 cases.93 cases positively expressed COX2 with the positive expression rate of 80.9%;94 cases positively expressed NF-κB protein with the positive expression rate of 81.7%.The difference in the expression of COX2 and NF-κB protein between the different risk groups were statistically significant(P<0.05),the positive expression rate was the highest in the high risk group,but which had no statistically significant difference among different genders,ages,locations,histological types and whether metastasis (P>0.05).59 cases were followed up with the follow-up rate of 51.3%;among them 29 cases were strongly positive expression (+++) of COX2 protein,including 9 cases of metastasis,1 case of death;32 cases of them were strongly positive expression(+++) of NF-κB protein,including 10 cases of metastasis and 1 case and death.ConclusionThe COX2 and NF-κB expression in GISTs is closely correlated with the risk classification,and is one of the important factors affecting the prognosis of patients.

gastrointestinal stromal tumors;cyclooxygenase 2； NF-kappa B；immunohistochemistry； prognosis

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.13.004

貴州省科學(xué)技術(shù)基金資助項(xiàng)目[黔科合J字(2009)2187號、黔科合J字LKG(2013)27號]；貴州省科技計(jì)劃資助項(xiàng)目[黔科合SY字(2011)3062號]；貴陽市科學(xué)技術(shù)計(jì)劃[(2009)筑科農(nóng)合同字第3-020號]。作者簡介：李小紅(1985-)，在讀碩士研究生，主要從事基因與腫瘤相關(guān)性的研究。△

，E-mail:chengyuanhua@gmc.edu.cn。

R735

A

1671-8348(2016)13-1740-04

2015-11-19

2015-12-26)