郭謙楠,馮戰(zhàn)啟,康 冰,王 瑜,邢孟艷,龍建綱
(1.西安交通大學生命科學與技術(shù)學院線粒體生物醫(yī)學研究所,西安 710049;2.河南省人民醫(yī)院/鄭州大學人民醫(yī)院醫(yī)學遺傳所,鄭州 450003;3.河南省鄭州市第一人民醫(yī)院泌尿外科,鄭州 450000)
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·論著·
河南漢族父親MTHFR基因?qū)δ赣H不明原因反復自然流產(chǎn)的影響*
郭謙楠1,2,馮戰(zhàn)啟3,康冰2,王瑜2,邢孟艷2,龍建綱1△
(1.西安交通大學生命科學與技術(shù)學院線粒體生物醫(yī)學研究所,西安 710049;2.河南省人民醫(yī)院/鄭州大學人民醫(yī)院醫(yī)學遺傳所,鄭州 450003;3.河南省鄭州市第一人民醫(yī)院泌尿外科,鄭州 450000)
目的探討父親亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)基因C677T多態(tài)性是否與母親不明原因反復自然流產(chǎn)(URSA)的發(fā)生有關。方法通過聚合酶鏈式反應-測序(PCR-測序)的方法對329對河南漢族URSA夫婦(觀察組)及292對河南漢族健康夫婦(對照組)基因型進行分析。 結(jié)果無論是在對照組中還是觀察組中,男、女之間的MTHFR C677T多態(tài)性位點的C和T等位基因頻率和各基因型頻率分布差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05);觀察組中男女各方的MTHFR C677T多態(tài)性位點的T等位基因頻率和含T的各基因型頻率均顯著高于相應的對照組(P<0.05),在女性中T等位基因是C等位基因發(fā)生URSA風險的2.267倍(95%CI:1.804~2.843),在男性中T等位基因是C等位基因發(fā)生URSA風險的2.239倍(95%CI:1.783~2.811)。夫妻聯(lián)合基因型分析中,夫婦 TT/TT基因型發(fā)生URSA的風險最高,是CC/CC基因型夫婦的19.909倍(95%CI:8.608~46.049)。結(jié)論父母的MTHFR 677C>T是URSA發(fā)生的獨立遺傳易感因素。
亞甲基四氫葉酸還原酶;流產(chǎn),習慣性;原因不明;同型半胱氨酸
亞甲基四氫葉酸還原酶(methylenetetrahydrofolate reductase,MTHFR)是葉酸代謝途徑中的關鍵酶,突變可導致其酶活性的降低,牽制5,10-亞甲基四氫葉酸(5,10-MTHF)向5-甲基四氫葉酸(5-MTHF)的轉(zhuǎn)化。5-MTHF是體內(nèi)主要的蛋白質(zhì)和DNA甲基供體,參與同型半胱氨酸(Hcy)向蛋氨酸的轉(zhuǎn)化,進而影響后續(xù)的蛋氨酸代謝循環(huán)和DNA的合成、修復及甲基化。因此,MTHFR與葉酸的新陳代謝、DNA 的遺傳穩(wěn)定性和維持正常的Hcy血清水平密切相關。MTHFR的多態(tài)性基因位點C677T已被證實與其編碼酶的活性、血清葉酸和血漿同型半胱氨酸濃度密切相關。MTHFR C677T多態(tài)性位點與紅細胞和血清葉酸濃度、血漿Hcy濃度,以及心血管疾病易感性的關聯(lián)性研究在國內(nèi)外都比較深入,TT基因型人群的紅細胞葉酸和血清葉酸的濃度均顯著低于野生CC基因型人群[1-2],但血漿Hcy的濃度卻顯著增高[1-2];并且T等位基因是心血管疾病發(fā)生的遺傳易感因素。
國內(nèi)外在URSA方面的研究揭示女性MTHFR C677T的T等位基因是URSA的遺傳風險因素[3-4],并且與包括不明原因反復自然流產(chǎn)(URSA)在內(nèi)的不良妊娠均相關[5],但URSA與男性MTHFR基因相關性的研究鮮見報道。近年來國內(nèi)外的研究表明,MTHFR C677T多態(tài)性位點與男性不育有關并可能會影響精子質(zhì)量[6-8],暗示男性的C677T多態(tài)性可能與其配偶發(fā)生URSA有關。王亞文等[9]在32個小標本量中國人群中的調(diào)查僅發(fā)現(xiàn)男性的MTHFR C677T基因型只有與女性聯(lián)合分析時才有意義,單獨分析時無意義。因此,本研究旨在探討是否男性像女性一樣其男性的MTHFR C677T基因多態(tài)性與URSA的發(fā)生有關,這種關聯(lián)性是男性獨立存在的還是必須和其女性配偶雙方一起時才存在,現(xiàn)報道如下。
1.1一般資料均采集在河南居住的河南籍漢族夫婦雙方外周血血液標本。 觀察組329對夫婦(女:25~32歲;男:27~34歲),5~12周URSA≥2次,未曾有過正常妊娠,雙方身體健康,無生殖系統(tǒng)結(jié)構(gòu)異常,無明顯肥胖,無家族遺傳病史,無支原體、衣原體及常見的病毒細菌感染,無內(nèi)分泌異常且染色體核型均正常。對照組292對夫婦(女:24~32歲;男:27~34歲),身體健康,無明顯肥胖,無家族遺傳病史,無任何不良妊娠史和重大疾病史,并曾至少生育有1名健康子女,且女方至少在妊娠前2個月內(nèi)和妊娠后早期1個月內(nèi)未曾服用過人工葉酸制劑,男方則從未服用過人工葉酸制劑。
1.2方法
1.2.1基因組DNA提取抽取外周血靜脈血2 mL,EDTA抗凝,-20 ℃保存。利用TIANamp Genomic DNA Kit試劑盒提取DNA。
1.2.2PCR-直接測序分析基因型(1)MTHFR C677T位點擴增的引物設計:參照GenBank中MTHFR基因序列,采用Primer5軟件設計PCR引物。C677T位點上游引物TP1:5′-GAA GCA GGG AGC TTT GAG GCT G-3′,下游引物TP2:5′-CCC ATG TCG GTG CAT GCC TTC-3′,由上海生物工程公司合成,蒸餾水稀釋至10 μmol/L。(2)反應條件為95℃預變性5 min,94 ℃ 30 s,63 ℃ 30 s,72℃ 30 s共40個循環(huán),隨后72 ℃延伸9 min。(3)運用下游引物TP2進行PCR產(chǎn)物基因序列測序(PCR產(chǎn)物送上海生物工程公司測序)。
1.3統(tǒng)計學處理采用SPSS13.0進行統(tǒng)計學分析,通過基因型頻率計算等位基因頻率,以Hardy-Weinberg平衡檢驗確認樣本的群體代表性?;蛐鸵约盎蝾l率分布的比較采用Personχ2檢驗。關聯(lián)分析用χ2檢驗和Logistic回歸,必要時用Fisher精確概率檢驗,計算比值比(Odds ratios,ORs)評價相對危險度,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
2.1MTHFR C677T多態(tài)性位點反向測序結(jié)果基因序列測序見圖1。
A:CC純合基因型;B:TT純合基因型。
圖1MTHFR C677T多態(tài)性位點反向測序結(jié)果
2.2MTHFR C677T等位基因頻率的分布兩組MTHFR C677T多態(tài)性基因位點的基因型分布均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律(P>0.05),具有群體代表性。經(jīng)χ2檢驗(T等位基因分布差異研究以C等位基因為參照來進行統(tǒng)計學分析):MTHFR C677T在對照組女性T等位基因頻率為39.7%,觀察組女性為59.9%,對照組男性為42.6%,觀察組男性為62.5%。兩組內(nèi)男女之間的頻率分布差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),即C677T的多態(tài)性分布在各組內(nèi)均無性別差異,見表1。觀察組中T等位基因頻率比對照組中男、女均顯著提高(女性之間,χ2=50.264,P=0.000,OR=2.267,95%CI:1.804~2.843;男性之間,χ2=48.834,P=0.000,OR=2.239,95%CI:1.783~2.811);女性T等位基因是C等位基因發(fā)生URSA風險的2.267倍,男性T等位基因是C等位基因發(fā)生URSA風險的2.239倍。
表1 MTHFR C677T基因位點多態(tài)性在男、女雙方中分布情況的比較[n(%)]
2.3不同性別MTHFR C677T基因型分析結(jié)果經(jīng)Logistic回歸分析,觀察組與對照組中各基因型頻率分布以見表2。采用χ2計算,含T的各基因型分布差異研究分別以CC基因型為參照來進行統(tǒng)計學分析。攜帶MTHFR 677CT基因型女性發(fā)生URSA的風險是677CC女性的2.126倍(χ2=14.208,OR=2.126,95%CI:1.432~3.157,P<0.05),MTHFR 677TT基因型女性發(fā)生URSA的風險是677CC女性的4.666倍(χ2=45.779,OR=4.666,95%CI:2.953~7.371,P<0.05);攜帶MTHFR 677CT基因型男性使其女性伴侶發(fā)生URSA的風險是677CC男性的2.178倍(χ2=13.943,OR=2.178,95%CI:1.442~3.288,P<0.05),MTHFR 677TT基因型男性使其女性伴侶發(fā)生URSA的風險是677CC男性的4.632倍(χ2=44.829,OR=4.632,95%CI:2.923~7.338,P<0.05)。
表2 兩組MTHFRC677T基因型分布
2.4男女配對MTHFR C677T基因型合并分析經(jīng)Logistic回歸分析,觀察組與對照組中各基因型頻率分布以及比值比等數(shù)據(jù)見表3。從4個T到1個T的統(tǒng)計學分析均以0個T為參照對象進行統(tǒng)計學分析。夫妻為TT/TT基因型組合時,URSA發(fā)生的風險最大。夫妻雙方為4個T基因型(TT/TT)時發(fā)生URSA的風險是雙方為0個T(CC/CC)基因型的19.909倍(95%CI:8.608~46.049,P<0.05),夫妻雙方為3個T基因型(CT/TT)時發(fā)生URSA的風險是雙方為0個T基因型的13.273倍(95%CI:6.539~26.941,P<0.05),夫妻雙方為2個T基因型(CT/CT或者CC/TT)時發(fā)生URSA的風險是雙方為0個T基因型的7.056倍(95%CI:3.528~14.110,P<0.05),夫妻雙方為1個T基因型(CT/CC)時發(fā)生URSA的風險是雙方為0個T基因型的6.772倍(95%CI:3.210~14.282,P<0.05)。
表3 不良妊娠夫婦MTHFR C677T 合并基因型分析結(jié)果
MTHFR C677T對酶活性的不利影響可通過飲食對葉酸攝取量的增多而得到改善。因此,不同地域和種族間不同的生活飲食習慣可能是造成C677T這個多態(tài)性位點基因頻率的地域[10-11]和種族[12-13]間的差異。例如,在中國人群中,TT純合子頻率約為20%;而在非洲撒哈拉地區(qū)黑人中未發(fā)現(xiàn)有TT純合突變[14]。不同的地域和種族擁有不同的基因型頻率可能是造成與本文與研究結(jié)果不一致的原因。王亞文等[9]對32對URSA的夫婦進行MTHFR C677T多態(tài)性位點基因型分析研究發(fā)現(xiàn),僅夫妻雙方都是純合或雜合突變型,其基因型分布與流產(chǎn)發(fā)生的危險性相關,夫妻雙方有一人是純合或雜合突變型,而另一人為野生型的,其基因型分布與流產(chǎn)發(fā)生的危險性無關,其研究未對樣本進行地域和種族差異的區(qū)分且樣本量偏??;另一方面,王亞文等[9]的研究未考慮對照組在妊娠前和妊娠早期是否有服用人工葉酸制劑。本研究中所選的病例和對照組樣本量大,對照組男性均為未曾服用過人工葉酸制劑的人群,女性則至少在妊娠前2個月內(nèi)和妊娠第1個月內(nèi)未曾服用過人工葉酸制劑,從而在一定程度上排除了由于服食葉酸改善了MTHFR酶活性繼而正常妊娠的高風險基因人群納入對照,保證了對照的可信性,使突變等位基因T對URSA發(fā)生的影響更加準確地得到反映。
本文研究證實父親和母親的MTHFR C677T多態(tài)性位點與母親URSA的發(fā)生密切相關。在母親方面,MTHFR C677T 多態(tài)性位點T等位基因和TT基因型與URSA的發(fā)生風險相關已得到國內(nèi)外文獻的報道[3-4],與本研究發(fā)現(xiàn)一致。
在父親方面,其MTHFR C677T多態(tài)性位點與URSA發(fā)生的風險易感性可獨立于母親基因型單獨成立可能來源于兩個方面的原因。(1)父親MTHFR基因?qū)覦NA遺傳物質(zhì)的影響作用對胚胎的正常發(fā)育有重要影響。MTHFR基因C677T的多態(tài)性位點已證實與男性不育[6-8]、精子的活動率和畸形[6,8]以及胎兒心臟畸形[15-16]有關,因此C677T的T等位基因和TT基因型造成的URSA風險易感性可能來源于其對男性精子的影響。胚胎50%的基因來源于精子,除了受孕功能,精子的基因所起的作用貫穿胚胎發(fā)育的整個過程。如果精子的遺傳物質(zhì)DNA發(fā)生損傷,可以不影響精子受孕功能,精子可以與卵子相遇并結(jié)合,女性同樣會正常懷孕,但妊娠到一定的階段(取決于精子DNA的損傷位置和程度)便會導致胚胎停止發(fā)育,從而出現(xiàn)流產(chǎn)現(xiàn)象。(2)父親MTHFR C677T多態(tài)性位點的基因型對胎兒基因型的影響可能影響胎兒的正常發(fā)育。由表3結(jié)果可知,夫妻為TT/TT基因型時,即胎兒為TT基因型時,URSA發(fā)生的風險最高。女性MTHFR 677T等位基因和TT基因型已證實是胎兒神經(jīng)管缺陷[17]和21三體綜合征的遺傳易感因素[18];在成年人中也已證實MTHFR 677T等位基因和TT基因型是腫瘤癌癥的遺傳易感因素[19-20]。因此,在胚胎期,胎兒的MTHFR C677T的T等位基因和TT基因型可能對其本身的發(fā)育有關,而父親MTHFR 677C>T突變增加胎兒T風險基因型的遺傳概率。
本研究從男女雙方按性別分組分析及合并分析的研究結(jié)果表明,男、女單獨各方的MTHFR 677C>T突變均是URSA發(fā)生的遺傳易感因素,當夫妻雙方為TT/TT基因型時URSA發(fā)生的風險最大。已知MTHFR 677C>T突變導致的MTHFR酶活性的降低可由葉酸攝入量的增加而得到改善;在女性中,額外添加葉酸攝入量已公認對提高生育質(zhì)量有幫助(降低神經(jīng)管缺陷和唐氏綜合征等妊娠率)。因此,鑒于男性的MTHFR基因是女性URSA發(fā)生的獨立遺傳危險因素,對MTHFR 677TT和677CT突變型的男性患者給予適當?shù)娜~酸補充可能也對提高生育質(zhì)量和防止女性發(fā)生URSA有幫助。
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Influence of paternal MTHFR gene on maternal unexplained recurrent spontaneous abortion in Henan Han population*
GuoQiannan1,2,FengZhanqi3,KangBing2,WangYu2,XingMengyan2,LongJiangang1△
(1.InstituteofMitochondrialBiologyandMedicine,SchoolofLifeScienceandTechnology,Xi′anJiaotongUniversity,Xi′an,Shaanxi710049,China;2.InstituteofMedicalGenetics,HenanProvincialPeople′sHospital/People′sHospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhou,Henan450000,China;3.DepartmentofUrologySurgery,theFirstPeople′sHospitalofZhengzhouCity,Zhengzhou,Henan450000,China)
ObjectiveTo explore whether the paternal MTHFR gene C677T polymorphism being associated with the susceptibility of maternal unexplained recurrent spontaneous abortion (URSA).MethodsTotally 329 Henan Han couples with URSA(observation group) and 292 Henan Han healthy couples were detected the MTHFR C677T genotypes by the PCR-sequencing.ResultsThe allele C and T frequencies and genotype frequencies of MTHFR C677T polymorphism site had no statistically significant difference between males and females within either URSA group or control group (P>0.05);the frequency of allele T and the frequencies of allele T-included genotypes at C677T polymorphism site were significantly increased in the males and females of the observation group compared with the control group(P<0.05).The URSA risk occurrence in the female allele T was 2.267 times of that the allele C(95%CI:1.804-2.843),while the URSA risk occurrence in the male allele T was 2.239 times of that the allele C(95%CI:1.783-2.811).In the combined genotype analysis within the couples,the URSA risk occurrence in couple TT/TT genotype was highest and was 19.909 times of that in couple CC/CC genotype(95%CI:8.608-46.049).ConclusionThe parental MTHFR 677C>T is a independent genetic susceptibility factor for URSA occurrence.
methylenetetrahydrofolate reductase;abortion,habitual;unknown origin;homocysteine
10.3969/j.issn.1671-8348.2016.13.003
國家自然科學基金資助項目(81501336)。作者簡介:郭謙楠(1984-),碩士,助理研究員,主要從事不良妊娠基因和單基因病的研究?!?/p>
,E-mail:jglong@mail.xjtu.edu.cn。
R714.21
A
1671-8348(2016)13-1736-04
2015-11-20
2016-01-23)