miR-101、miR-223和miR-424在肺結(jié)核診斷中的價(jià)值*

顏保松，王　靜，羅　杰，陳　鳴，鄧少麗△

(1.第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所檢驗(yàn)科，重慶 400042；2.重慶市公共衛(wèi)生醫(yī)療救治中心檢驗(yàn)科　400036)

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論著·臨床研究

miR-101、miR-223和miR-424在肺結(jié)核診斷中的價(jià)值*

顏保松1，王靜2，羅杰1，陳鳴1，鄧少麗1△

(1.第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所檢驗(yàn)科，重慶 400042；2.重慶市公共衛(wèi)生醫(yī)療救治中心檢驗(yàn)科400036)

目的探尋對(duì)肺結(jié)核有潛在診斷價(jià)值的miRNA標(biāo)記物。方法以健康組、肺炎組和肺癌組作為對(duì)照組，以肺結(jié)核患者作為肺結(jié)核組，采用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)并分析8種miRNA(miR-21、miR-29a、miR-101、miR-378、miR-146a、miR-223、miR-361-5p和miR-424)在44例肺結(jié)核組和98例對(duì)照組外周血單個(gè)核細(xì)胞中的表達(dá)差異。選取合適的miRNA采用Logistic回歸進(jìn)行篩選并建立回歸方程，通過ROC曲線評(píng)價(jià)該方程的診斷效能。結(jié)果Logistic回歸篩選出3種對(duì)肺結(jié)核診斷有意義的miRNA分子即miR-101、miR-223和miR-424，ROC曲線分析顯示這3種miRNA的組合對(duì)肺結(jié)核具有良好的診斷效能：AUC=0.939，診斷特異性為81.63%，靈敏性為90.91%。結(jié)論miR-101、miR-223和miR-424可作為肺結(jié)核潛在的有診斷價(jià)值的標(biāo)記物。

微RNAs；結(jié)核，肺；診斷；標(biāo)記物

結(jié)核病是一個(gè)重大的全球性公共衛(wèi)生問題，嚴(yán)重威脅著人類健康。肺結(jié)核是結(jié)核病中最常見的臨床類型，相比肺外結(jié)核，其能夠經(jīng)飛沫播散的特性注定了其在結(jié)核病防控工作中的重要地位。然而肺結(jié)核因臨床表現(xiàn)多樣，影像學(xué)表現(xiàn)缺乏足夠的特異性，實(shí)驗(yàn)室也缺乏理想的生物學(xué)指標(biāo)，致使其診斷至今仍然困擾著臨床醫(yī)務(wù)工作者。MicroRNA(miRNA)是一類長(zhǎng)度約22 nt的非編碼單鏈RNA，通過抑制或降解特異性mRNA分子介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，參與到細(xì)胞的多種生物學(xué)進(jìn)程，與許多疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[1]。近年來(lái)miRNA表達(dá)及功能的相關(guān)研究表明結(jié)核病患者體內(nèi)一些miRNA的表達(dá)水平發(fā)生了改變[2]，基因組學(xué)的研究結(jié)果也間接證實(shí)了上述結(jié)論[3-4]，提示這些異常表達(dá)的miRNA有可能作為診斷肺結(jié)核潛在的生物標(biāo)記物。本研究選取多種已報(bào)道的表達(dá)有差異的miRNA通過qRT-PCR技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)驗(yàn)證，采用Logistic回歸并結(jié)合ROC曲線進(jìn)行分析，旨在篩選出對(duì)肺結(jié)核有診斷價(jià)值的miRNA分子。

1　資料與方法

1.1一般資料肺結(jié)核組44例，選自2015年9～11月就診于重慶市公共衛(wèi)生醫(yī)療救治中心的住院患者；對(duì)照組98例，為同期就診于第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所的住院患者(肺炎組、肺癌組)和健康體檢者(健康組)?；颊呒{入標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡18～75歲；(2)無(wú)人類免疫缺陷病毒(HIV)感染及其他自身免疫性疾病，近期未接受過糖皮質(zhì)激素類藥物或免疫抑制劑類藥物的治療；(3)無(wú)心、肝及腎等臟器的功能障礙；(4)健康組為無(wú)任何臨床癥狀且常規(guī)體檢未發(fā)現(xiàn)異常者，肺結(jié)核組、肺炎組及肺癌組均由3位經(jīng)驗(yàn)豐富的醫(yī)生根據(jù)臨床表現(xiàn)、影像學(xué)資料、微生物學(xué)結(jié)果及病理結(jié)果等作出診斷；(5)活動(dòng)性肺結(jié)核組及肺炎組未經(jīng)針對(duì)性治療或治療時(shí)間小于3 d，且無(wú)腫瘤及其他感染性疾??；肺癌組未經(jīng)手術(shù)切除或化療時(shí)間小于3 d，且無(wú)其他腫瘤及感染性疾病。采集的臨床資料包括：所有研究對(duì)象的年齡、性別、抗酸染色結(jié)果、健康組結(jié)核T細(xì)胞斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)(T-SPOT.TB)結(jié)果，肺癌組研究對(duì)象的肺癌病理類型，以及肺炎組研究對(duì)象的感染類型等。本研究經(jīng)第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所及重慶市公共衛(wèi)生醫(yī)療救治中心倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有研究對(duì)象均簽署知情同意書。

表1　　研究對(duì)象臨床資料

-：無(wú)數(shù)據(jù)。

1.2方法

1.2.1候選miRNA的確定文獻(xiàn)[5-12]報(bào)道了多種在肺結(jié)核患者血清(血漿)或外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)或淋巴細(xì)胞中存在差異表達(dá)的miRNA分子，為擴(kuò)大篩選范圍，本研究忽略標(biāo)本類型及對(duì)照組的因素。在經(jīng)qRT-PCR技術(shù)驗(yàn)證過的存在差異的miRNA分子中進(jìn)行選擇，優(yōu)先選擇經(jīng)ROC評(píng)價(jià)證實(shí)診斷效能優(yōu)良者，最終選定了8種miRNA。8種候選miRNA為：miR-21[5]、miR-29a[6]、miR-101[7]、miR-378[7]、miR-146a[8]、miR-223[9-10]、miR-361-5p[11]、miR-424[8,10]。根據(jù)上述文獻(xiàn)報(bào)道，與健康組比較，肺結(jié)核患者低表達(dá)miR-101、miR-146a，高表達(dá)miR-29a、miR-361-5p、miR-378、miR-424；與肺炎組(或肺癌組)比較，肺結(jié)核患者miR-21、miR-101和miR-223表達(dá)水平較低。

1.2.2PBMCs的分離抽取研究對(duì)象外周靜脈血2 mL，乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，采用人淋巴細(xì)胞分離液(天津美德太平洋科技有限公司)以密度梯度離心法分離PBMCs。具體操作如下：(1)用2 mL無(wú)菌磷酸鹽緩沖液(PBS)等倍稀釋抗凝全血，緩慢加入到2 mL人淋巴細(xì)胞分離液的表面；(2)1 000 g常溫下離心22 min，用無(wú)菌塑料吸管小心吸取中間白細(xì)胞層；(3)用注射用生理鹽水洗滌細(xì)胞2次(800 g離心10 min)；(4)將上述分離的PBMCs加入1 mL TRIzol(Invitrogen公司)重懸混勻，充分裂解后置-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3總RNA的提取及miRNA的qRT-PCR檢測(cè)使用TRIzol試劑嚴(yán)格按照說明書操作進(jìn)行總RNA(含miRNA)的提取，采用NanoDrop ND-1000分光光度計(jì)(Thermo Scientific)檢測(cè)所提取的RNA的質(zhì)量和濃度，留取符合實(shí)驗(yàn)要求的RNA樣本(濃度大于或等于50 ng/μL，吸光度比值A(chǔ)260/A280≥1.7)進(jìn)行后續(xù)的qRT-PCR檢測(cè)。使用All-in-OneTMmiRNA 實(shí)時(shí)定量PCR(qRT-PCR) Detection Kit試劑 (GeneCopoeia公司)按照說明書操作進(jìn)行miRNA的加尾、逆轉(zhuǎn)錄及qPCR檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)所需的內(nèi)參及特異性上游引物均購(gòu)自GeneCopoeia公司。qPCR反應(yīng)在BIO-RAD C1000 PCR擴(kuò)增儀上按以下程序進(jìn)行：93 ℃預(yù)變性10 min；93 ℃變性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，循環(huán)40次。

1.2.4數(shù)據(jù)處理以U6 snRNA作為內(nèi)參對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理，設(shè)定健康組某個(gè)研究對(duì)象miRNA的表達(dá)量為1，通過2-△△CT法計(jì)算肺結(jié)核組相對(duì)對(duì)照組miRNA的表達(dá)變化倍數(shù)?？紤]到影響qRT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果的因素相對(duì)較多，對(duì)表達(dá)差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的miRNA，本研究設(shè)定其相對(duì)表達(dá)變化倍數(shù)需大于或等于1.5或小于或等于0.5才適合作為診斷指標(biāo)進(jìn)入回歸方程進(jìn)行分析。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用Graphpad Prism 5.0統(tǒng)計(jì)軟件，根據(jù)方差是否齊性以Mann-Whitney檢驗(yàn)或t檢驗(yàn)比較兩組間差異，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件以Logistic逐步向前法建立多元回歸方程，并以ROC曲線分析評(píng)價(jià)該方程的診斷效能。

2　結(jié)　　果

2.1臨床資料本研究共納入研究對(duì)象142例，其中肺結(jié)核組44例，對(duì)照組98例(健康組36例，肺炎組32例，肺癌組30例)。其中，年齡及性別在肺結(jié)核組和對(duì)照組之間的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

n：肺結(jié)核組相對(duì)對(duì)照組mRNA表達(dá)的變化倍數(shù)。*P<0.01，與肺結(jié)核組比較。

圖18種miRNA在肺結(jié)核組和3組對(duì)照組中的表達(dá)情況

2.2PBMCs中候選miRNA的表達(dá)情況

2.2.1候選miRNA表達(dá)水平的差異肺結(jié)核組與健康組比較，miR-29a、miR-101、miR-378和miR-424的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，肺結(jié)核組低表達(dá)miR-29a和miR-101，高表達(dá)miR-378和miR-424；肺結(jié)核組與肺炎組比較，8種miRNA的表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，肺結(jié)核組的表達(dá)水平均低于肺炎組；肺結(jié)核組與肺癌組比較，除miR-29a外另外7種miRNA的表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，肺結(jié)核組的表達(dá)水平均低于肺癌組，見圖1。

2.2.2候選miRNA表達(dá)水平的變化倍數(shù)除miR-29a外，其余7種miRNA均適合進(jìn)入回歸方程。miR-29a的表達(dá)雖然差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但其改變倍數(shù)為0.84(肺結(jié)核組與健康組比較)和0.74(肺結(jié)核組與肺炎組比較)，不滿足實(shí)驗(yàn)要求，見圖1。

2.3回歸方程的建立及ROC曲線評(píng)價(jià)回歸方程的診斷效能排除miR-29a，對(duì)剩余7種miRNA采用Logistic回歸進(jìn)行分析，建立的回歸方程為：Logit(患肺結(jié)核概率P)=1.698-4.791×(miR-101)-3.428×(miR-223)+2.968×(miR-424)。ROC曲線分析證實(shí)了該模型對(duì)肺結(jié)核具有良好的診斷效能，曲線下面積(AUC)=0.939，95%CI：0.900～0.977；診斷靈敏性為90.91%，特異性為81.63%，見圖2。

圖2　　ROC曲線

3　討　　論

對(duì)肺結(jié)核進(jìn)行及時(shí)準(zhǔn)確的診斷，不僅能夠使患者盡早得到針對(duì)性治療進(jìn)而改善預(yù)后，更重要的是能夠使傳染源得到及時(shí)有效的控制，避免結(jié)核病的傳播，然而近期的研究結(jié)果表明肺結(jié)核的診斷經(jīng)常被延誤[13-14]。目前肺結(jié)核的實(shí)驗(yàn)室診斷主要依賴于對(duì)結(jié)核桿菌自身或其成分的檢測(cè)，如痰涂片抗酸染色法、培養(yǎng)法，以及PCR擴(kuò)增法等。這些檢測(cè)方法一方面對(duì)下呼吸道標(biāo)本不易獲得的病例如小兒肺結(jié)核的診斷存在著局限性；另一方面本身也存在著諸如靈敏度較低、儀器設(shè)備要求高、檢測(cè)周期長(zhǎng)等缺陷[15]。近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的基于宿主免疫反應(yīng)的診斷方法如γ干擾素釋放試驗(yàn)(IGRA)雖可在一定程度上彌補(bǔ)上述不足，但是卻不能區(qū)分活動(dòng)性肺結(jié)核和潛伏性結(jié)核感染[16-17]。

miRNA的相關(guān)研究為肺結(jié)核診斷提供了新的思路和方向。盡管目前已有多項(xiàng)關(guān)于miRNA作為肺結(jié)核診斷指標(biāo)的研究報(bào)道[18]，但是這些研究在對(duì)照組的選擇上不夠全面，臨床上肺結(jié)核經(jīng)常要與另外兩種常見的肺部疾病-肺炎與肺癌進(jìn)行鑒別，而這些研究?jī)H僅選擇健康人及(或)潛伏性結(jié)核感染者作為對(duì)照，缺乏足夠的說服力。本研究以健康組、肺炎組和肺癌組共同作為對(duì)照組，通過對(duì)8種候選miRNA進(jìn)行檢測(cè)和篩選，最終確定了3種符合要求的miRNA分子即miR-101、miR-223和miR-424，ROC曲線分析結(jié)果顯示了這3種miRNA的組合對(duì)肺結(jié)核具有良好的診斷價(jià)值，其研究前景值得期待。

雖然本研究和Spinelli等[8]的研究結(jié)果都顯示肺結(jié)核組PBMCs中miR-223的表達(dá)水平與健康組相比差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但是在肺組織[18]或單核/巨噬細(xì)胞[19-20]中miR-223的表達(dá)上調(diào)。上調(diào)表達(dá)的miR-223對(duì)肺結(jié)核患者具有雙重作用，(1)其可通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制抑制中性粒細(xì)胞趨化因子如CXC趨化因子配體2(CXCL2)，CC趨化因子配體3(CCL3)和白細(xì)胞介素6(IL-6)的表達(dá)，避免了大量中性粒細(xì)胞趨化至肺組織而導(dǎo)致的病理?yè)p傷，發(fā)揮對(duì)機(jī)體的保護(hù)作用[12]；(2)miR-223可以通過抑制巨噬細(xì)胞內(nèi)核因子kB(NF-kB)的活性，降低促炎癥因子的表達(dá)[19]，以及抑制巨噬細(xì)胞凋亡等作用來(lái)削弱機(jī)體的抗結(jié)核免疫[20]。本研究結(jié)果顯示，與健康組相比，肺結(jié)核組PBMCs中miR-101表達(dá)下調(diào)及miR-424表達(dá)上調(diào)，與預(yù)期結(jié)果一致，但這兩種miRNA異常表達(dá)的原因及其在肺結(jié)核發(fā)病機(jī)制中的作用尚不清楚，有待進(jìn)一步研究。

本研究觀察到8種候選miRNA中，miR-29a、miR-146a、miR-361-5p的檢測(cè)結(jié)果與預(yù)期結(jié)果不一致，推測(cè)可能以下方面的原因。(1)可能與標(biāo)本類型選擇的不同有關(guān)，如miR-29a和miR-361-5p，其在血清中表達(dá)的變化趨勢(shì)可能并不能代表其在PBMCs中的變化趨勢(shì)。(2)可能與研究樣本量較小有關(guān)，如miR-146a，雖然本研究的結(jié)果顯示結(jié)核組和健康組miR-146a的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但是觀察兩組數(shù)據(jù)，結(jié)核組miR-146a表達(dá)量有低于健康組的趨勢(shì)，若擴(kuò)大樣本量則有可能會(huì)顯現(xiàn)這種差異。(3)可能與所選研究人群的遺傳背景不同有關(guān)。

需要指出的是該項(xiàng)研究尚存在著一定的缺陷和不足。(1)該研究在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方面還不盡完善，如研究樣本量較小且研究對(duì)象來(lái)源比較單一，以及沒有采用獨(dú)立樣本或臨床前瞻性實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行效能驗(yàn)證等，可能會(huì)影響到研究結(jié)論的可信性；(2)該研究最初可供篩選的候選miRNA數(shù)量?jī)H僅只有8種，故最終確定的3種miRNA可能不是最佳的組合方案。盡管如此，本研究仍然認(rèn)為該項(xiàng)研究具有一定的科學(xué)性和實(shí)用性，對(duì)肺結(jié)核生物標(biāo)記物的深入研究具有借鑒意義和重要的參考價(jià)值。

綜上所述，本研究從8種miRNA中篩選得到了3種對(duì)肺結(jié)核有潛在診斷意義的miRNA標(biāo)記物(miR-101、miR-223和miR-424)，這3種miRNA的組合對(duì)肺結(jié)核具有良好的診斷價(jià)值，該研究結(jié)果為進(jìn)一步深入研究肺結(jié)核的實(shí)驗(yàn)室診斷方法提供了科學(xué)的參考資料。

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The diagnostic value of miR-101,miR-223 and miR-424 as potential biomarkers on pulmonary tuberculosis*

YanBaosong1,WangJing2,LuoJie1,ChenMing1,DengShaoli1△

(1.DepartmentofClinicalLaboratory,DapingHospital,ResearchInstituteofFieldSurgery,theThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400042,China；2.DepartmentofClinicalLaboratory,PublicHealthTreatmentCenter,Chongqing400036,China)

ObjectiveTo explore potential miRNA biomarkers for diagnosis of pulmonary tuberculosis.MethodsHealthy group,pneumonia group and lung cancer group were selected as control group,and the patients with pulmonary tuberculosis were acted as experimental group.The expression levels of 8 miRNAs (miR-21,miR-29a,miR-101,miR-378,miR-146a,miR-223,miR-361-5p and miR-424)in 44 cases of experimental group and 98 cases of control group were detected by qRT-PCR,and their differences were compared between each group.Logistic regression was applied to select diagnostic miRNA markers and set up the regression equation；ROC curve was used to evaluate the diagnostic accuracy of the equation.ResultsWe identified a panel of miR-101,miR-223 and miR-424 that yielded high diagnostic accuracy.The AUC for the miRNA panel was 0.939 with 90.91% sensitivity and 81.63% specificity.ConclusionmiR-101,miR-223 and miR-424 might be used as potential biomarkers for diagnosis of pulmonary tuberculosis.

MicroRNAs；tuberculosis,pulmonary；diagnosis；biomarker

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.14.010

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81371760)；國(guó)家傳染病重大專項(xiàng)(2013ZX10003006-003-002)。作者簡(jiǎn)介：顏保松(1980-)，主管技師，在讀碩士，主要從事結(jié)核病研究。△

，E-mail:dengshali@tmmu.edu。

R521

A

1671-8348(2016)14-1902-04

2015-11-08

2016-02-18)