甘草酸苷對肝癌細胞SMCC-7721凋亡的誘導作用*

鄭曉珂，王利娟，張紅巧，楊小昂

(1.鄭州大學第五附屬醫(yī)院腫瘤科，鄭州 450052；2.鄭州大學醫(yī)藥科學研究院，鄭州 450052)

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·論著·

甘草酸苷對肝癌細胞SMCC-7721凋亡的誘導作用*

鄭曉珂1，王利娟1，張紅巧1，楊小昂2

(1.鄭州大學第五附屬醫(yī)院腫瘤科，鄭州 450052；2.鄭州大學醫(yī)藥科學研究院，鄭州 450052)

目的探討甘草酸苷對肝癌細胞SMCC-7721凋亡誘導作用及相關機制。方法以甘草酸苷(0、10、30、100 μg/mL)處理肝癌細胞SMCC-7721 48 h后，咪唑藍(MTT)法檢測肝癌細胞活力的影響；流式細胞術檢測細胞凋亡和線粒體膜電位；紫外分光光度法檢測細胞中含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Caspase-3)、Caspase-9活性的影響；Western blot分析線粒體途徑中相關蛋白p53、細胞色素C(CytC)、B淋巴細胞瘤-2(Bcl-2)和Bcl-2相關蛋白(Bax)的表達。結果與陰性對照比較，10、30、100 μg/mL甘草酸苷可顯著降低細胞的活力(P<0.01)，誘導細胞凋亡(P<0.01)，促進線粒體膜電位去極化(P<0.01)，抑制肝癌細胞SMCC-7721Caspase-3、Caspase-9活性(P<0.01)，并上調(diào)p53、CytC、Bax的表達(P<0.01)，下調(diào)Bcl-2的表達(P<0.01)，且作用呈現(xiàn)濃度依賴關系。結論甘草酸苷可通過線粒體途徑誘導肝癌細胞SMCC-7721凋亡。

肝腫瘤；細胞凋亡；甘草酸；肝癌細胞SMCC-7721；甘草酸苷；線粒體途徑

肝癌是世界上最常見的癌癥之一，目前臨床上使用的化療藥物在殺死癌細胞的同時，也殺死了正常的細胞，給患者造成了很大痛苦，尋找高效、低毒的藥物具有顯著意義。病毒引起的肝硬化、肝炎是肝癌產(chǎn)生的危險因素[1-2]。在治療慢性病毒性乙型肝炎的臨床研究中發(fā)現(xiàn)，復方甘草酸苷有降低肝細胞損害的作用[3]。亦有研究表明甘草酸苷對急性肝衰竭大鼠模型具有保護作用[4]。本課題考察甘草酸苷對肝癌細胞SMCC-7721的凋亡誘導作用及其機制，現(xiàn)報道如下。

1　材料與方法

1.1材料人肝癌細胞SMCC-7721購于中國科學院上海細胞庫，目錄號為TCHu 52。 復方甘草酸苷注射液，由日本米諾發(fā)源制藥株氏會社提供，含甘草酸苷2 mg/mL，注冊號為H20030185。兔抗p53、細胞色素C(CytC)、B淋巴細胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相關X蛋白(Bax)單克隆抗體購自美國Abcam公司；Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒、線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1法)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3(Caspase-3)、9分光光度法檢測試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GADPH)購自碧云天生物技術研究所；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、MTT購自美國Gibco公司。Forma Class Ⅱ生化培養(yǎng)箱購自美國Themo公司；ChemiDoc MP凝膠成像系統(tǒng)購自Bio-Rad公司； FACSCalibur流式細胞儀購自美國BD公司；雙垂直電泳儀、轉(zhuǎn)印電泳儀購自北京六一儀器廠；Tecan Infinite F200/M200型多功能酶標儀購自瑞士TECAN集團公司。

1.2方法

1.2.1MTT法將處于對數(shù)生長期的肝癌細胞SMCC-7721，消化，調(diào)整細胞濃度，接種，培養(yǎng)24 h。加入含甘草酸苷(10、30、100 μg/mL)DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，加MTT(5 mg/mL)20 μL，4 h后，吸棄上清液，并加入DMSO 150 μL，振蕩搖勻，在酶標儀570 nm處測定光密度(OD)值。

1.2.2流式細胞術檢測按1.2.1方法接種，給藥48 h后，按照Annexin V-FITC 細胞凋亡檢測試劑盒說明書的方法進行操作。用0.25%的胰蛋白酶[不含乙二胺四乙酸(EDTA)]消化細胞，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次，離心收集細胞；再按順序依次加入500 μL Binding Buffer、5 μL Annexin V-FITC及 5 μL碘化丙啶(PI)，混勻后，室溫、避光反應10 min左右，在1 h內(nèi)進行流式細胞儀檢測。

1.2.3細胞線粒體膜電位(△ψm)檢測按1.2.1方法接種，給藥48 h后，按照JC-1法說明書的方法進行操作。用0.25%胰蛋白酶(不含EDTA)消化，PBS洗滌2次，離心收集細胞。將10×Incubation Buffer稀釋成1×Incubation Buffer。取1 μL JC-1加入到500 μL 1×Incubation Buffer中配成JC-1工作液，取500 μL JC-1工作液，加入培養(yǎng)板中，37 °C孵育15 min，離心收集細胞，1×Incubation Buffer 500 μL重新懸浮細胞，流式細胞儀分析。線粒體膜電位檢測采用熒光燃料JC-1作為跨膜電位指示劑。JC-1可透過正常細胞膜以單聚體形式聚集細胞內(nèi)，并依賴于線粒體跨膜電位的極性，當其濃度增高可形成多聚體，并發(fā)射紅色熒光 (Q2區(qū)間)；而細胞發(fā)生凋亡時，線粒體跨膜電位去極化，細胞內(nèi)JC-1濃度降低，就以單體的形式存在，發(fā)射綠色熒光(Q4區(qū)間)。根據(jù)這一特征檢測線粒體膜電位的變化。

1.2.4Caspase-3、Caspase-9酶活性檢測按1.2.1方法接種，給藥48 h后，按照Caspase-3、Caspase-9分光光度檢測試劑盒說明書的方法進行操作。用0.25%胰蛋白酶(不含 EDTA)消化，PBS洗滌2次，離心收集細胞。將50 μL 預冷的Lysis Buffer加入細胞中，吹打均勻并置冰上裂解30 min，每隔10 s進行振蕩，4 ℃ 10 000 r/min離心 1 min，小心吸取上清液，置4 ℃待測。取1～2 μL上清液，檢測其中的蛋白濃度。再吸取50 μL含100～200 μg 蛋白的細胞裂解上清液，按順序依次加入2×Reaction Buffer 50 μL、Caspase-3 Substrate 5 μL，于37 ℃避光孵育4 h，用酶標儀檢測405 nm處吸光度，計算出每毫克蛋白相當?shù)腛D值。

1.2.5Western blot檢測按1.2.1方法接種，收集細胞，用裂解液裂解細胞，4 ℃ 10 000 r/min離心10 min，獲得蛋白樣品。BCA蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度。蛋白變性，30～50 ng蛋白樣品上樣，進行十二烷基磺酸鈉(SDS)凝膠電泳2 h，濕法轉(zhuǎn)膜30～60 min，5%脫脂奶粉封閉，加入一抗(1∶100)4 °C孵育過夜，三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽溶液(TBST)洗滌3次，后加入二抗(1∶500)室溫孵育1.0～1.5 h，TBST洗滌3次。后加電化學發(fā)光(ECL)曝光液在凝膠成像系統(tǒng)中曝光。并用“Quantity one”軟件對蛋白灰度值進行統(tǒng)計分析。

2　結　　果

2.1甘草酸苷對肝癌細胞肝癌細胞SMCC-7721活力的影響隨著作用濃度的增加，甘草酸苷對肝癌細胞SMCC-7721活力抑制作用逐漸增強，在100 μg/mL時，抑制程度最大，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見圖1。

2.2甘草酸苷對肝癌細胞SMCC-7721凋亡的影響正常肝癌細胞SMCC-7721中僅有少量的細胞發(fā)生早期凋亡和晚期凋亡；隨著給藥濃度的增加，早期和晚期凋亡細胞數(shù)均顯著增加，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。

*：P<0.01，與對照組比較。

圖1　　甘草酸苷對肝癌細胞SMCC-7721活力的影響

a：P<0.01，與對照組比較。

表2　　甘草酸苷對肝癌細胞SMCC-7721線粒體膜電位及

a：P<0.05，b：P<0.01，與對照組比較。

*：P<0.01，與對照組比較。

圖2甘草酸苷對肝癌細胞SMCC-7721中及CytC水平的影響

2.3甘草酸苷對肝癌細胞SMCC-7721線粒體膜電位的影響隨著給藥濃度的增加，甘草酸苷可顯著引起細胞線粒體膜電位去極化，且作用呈現(xiàn)濃度依賴關系，見表2。

2.4甘草酸苷對肝癌細胞SMCC-7721中Caspase-3、Caspase-9活性的影響與對照組相比，隨著給藥濃度的增加，甘草酸苷能顯著抑制肝癌細胞SMCC-7721中Caspase-3、Caspase-9活性，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表2。

2.5甘草酸苷對肝癌細胞SMCC-7721中p53及CytC水平的影響與對照組相比，隨著給藥濃度的增加，甘草酸苷能顯著抑制p53及CytC的表達，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見圖2。

2.6甘草酸苷對肝癌細胞SMCC-7721中Bax、Bcl-2水平的影響與對照組相比，隨著給藥濃度的增加，甘草酸苷能顯著提高Bax的表達，下調(diào)Bcl-2的表達，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見圖3。

*：P<0.01，與對照組比較。

圖3甘草酸苷對肝癌細胞SMCC-7721中Bax、Bcl-2水平的影響

3　討　　論

肝癌的發(fā)生不僅僅因為細胞增殖過度和分化異常，細胞程序性凋亡減少也可導致其發(fā)生。因此通過誘導腫瘤細胞凋亡使其重新恢復細胞凋亡能力，已成為腫瘤治療目前的研究熱點之一[5]。乙型肝炎、丙型肝炎病毒感染是肝細胞癌產(chǎn)生的危險因素之一[1-2]。甘草酸苷具有抗病毒引起的肝炎[3]。因此本文通過MTT實驗和 Annexin V-FITC流式細胞法檢測甘草酸苷對肝癌細胞SMCC-7721的作用，發(fā)現(xiàn)一定劑量甘草酸苷能顯著抑制肝癌細胞SMCC-7721活力，誘導肝癌細胞SMCC-7721凋亡。

凋亡途徑包括內(nèi)源性和外源性兩個通路，內(nèi)源性通路由線粒體途徑介導。線粒體是細胞能量代謝的中心，細胞凋亡會使線粒體功能發(fā)生紊亂及障礙，而線粒體功能障礙反之也會促使自由基大量產(chǎn)生、興奮性氨基酸大量釋放、鈣離子超載外，也能直接誘導細胞凋亡。當含Bcl-2家族的成員的在接受細胞內(nèi)的死亡信號后被激活，會引起線粒體膜通透性明顯升高，誘發(fā)CytC的釋放，誘導Caspase-9的活化激活級聯(lián)反應。Bax mRNA 表達低下或缺失參與了肝膽管癌的發(fā)生、發(fā)展過程[6]。Bcl-2過表達參與了肝癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移等過程[7]。通過線粒體途徑及上調(diào)Bax表達、增加Bax/Bcl-2比率可誘導肝癌SMMC-7721細胞凋亡[8]。當甘草酸苷作用SMMC-721后，可提高Bax表達，抑制Bcl-2表達，提示甘草酸苷可通過調(diào)節(jié)Bax、Bcl-2蛋白表達從而誘導腫瘤細胞凋亡。

CytC是一種水溶性蛋白，位于線粒體內(nèi)外膜之間，并與內(nèi)膜松弛相連，當線粒體受損后，線粒體通透性轉(zhuǎn)變孔道開放，CytC從構建的空隙中進入細胞質(zhì)中，引起后續(xù)的凋亡反應。線粒體的損傷為線粒體凋亡途徑中標志性的指標。CytC的表達是肝癌細胞凋亡的晚期事件[9]。本試驗發(fā)現(xiàn)，通過一定劑量甘草酸苷作用肝癌細胞SMCC-7721后，細胞質(zhì)中CytC表達上升，線粒體去極化顯著。Caspase-家族在程序性細胞死亡過程中發(fā)揮了關鍵的作用。Caspase-9是凋亡發(fā)生的啟動者，而Caspase-3被認為是Caspase級聯(lián)反應中最重要的執(zhí)行者，活化的Caspase-3可以裂解PARP進而引起DNA的損傷，還可以誘導細胞骨架結構重構和瓦解[10]。Caspase-3低表達在肝癌中的發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要作用[11]。Caspase-9的高表達參與了肝癌的發(fā)生過程[12]。本試驗也證實肝癌細胞SMCC-7721中Caspase-3、Caspase-9活性較低，給予一定劑量的甘草酸苷能顯著抑制Caspase-3、Caspase-9活性的上升。

p53在細胞凋亡引起的DNA損傷過程中是一個關鍵因素，它是第1個被證實的抑癌基因，其產(chǎn)物p53蛋白存在于正常的細胞內(nèi)，參與細胞生長、分化和死亡，與腫瘤的發(fā)生密切相關。研究證實p53能夠引起線粒體介導的Caspase依賴性凋亡的發(fā)生[13]。同時p53能夠調(diào)節(jié)誘導凋亡與抗凋亡基因之間的平衡，而其激活也是凋亡所需的[14]。p53蛋白的低表達是肝癌細胞低分化，高轉(zhuǎn)移潛能，預后差的生物學標志之一[15]。通過提高p53表達，能一定程度上誘導肝癌細胞SMCC-7721凋亡[16]。本試驗也發(fā)現(xiàn)，肝癌細胞SMCC-7721中p53低表達，甘草酸苷作用后，可顯著提高p53表達。

總之，一定劑量的甘草酸苷能誘導肝癌細胞SMCC-7721凋亡，是通過促進細胞線粒體膜電位去極化，上調(diào)p53、CytC、Bax的表達，下調(diào)Bcl-2的表達來實現(xiàn)。

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Induction of glycyrrhizin on apoptosis in hepatocellular carcinoma cell SMCC-7721*

ZhengXiaoke1,WangLijuan1,ZhangHongqiao1,YangXiaoang2

(1.DepartmentofOncology,theFifthAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhou,Henan450052,China;2.InstitudeofMedicine,UniversityofZhengzhou,Zhengzhou,Henan450052,China)

ObjectiveTo explore the molecular biological mechanism and induction of glycyrrhizin on apoptosis in hepatocellular carcinoma cell SMCC-7721.MethodsMTT method was used to detect the viability of SMCC-7721 cells after the cells were cultured with glycyrrhizin of 0 (negative control),10,30 and 100 μg/mL.The mitochondrial membrane potential and cell apoptosis of SMCC-7721 cell was measured by flow cytometry.The activity of Caspase-3,Caspase-9 was assayed by spectrophotometric assay.The mitochondrial pathway related protein p53,cytochrome (CytC),Bax,Bcl-2 was assayed by Western blot.ResultsCompared with negative control group,10,30,100 μg/mL glycyrrhizin inhibited SMCC-7721 cell viability (P<0.01),induced SMCC-7721 cell apoptosis and promoted mitochondrial membrane potential depolarization (P<0.01),as well as inhibited the activity of Caspase-3 and Caspase-9 (P<0.01),upregulated the expression of p53,CytC,Bax(P<0.01) and down-regulated the expression of Bcl-2 (P<0.01).The effects were related with the medicine concentration in does-dependent.Conclusionglycyrrhizin could induce SMCC-7721 cell apoptosis,which might be related with mitochondrial pathway.

liver neoplasms；apoptosis；glycyrrhizic acid；hepatocellular carcinoma cell SMCC-7721；glycyrrhizin；mitochondrial pathway

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.14.003

國家自然科學基金資助項目(81071724)。作者簡介：鄭曉珂(1980-)，主治醫(yī)師，碩士，主要從事惡性腫瘤綜合治療研究。

R735.7

A

1671-8348(2016)14-1879-03

2015-11-12

2015-12-28)