禽畜肉中金剛烷胺殘留量測(cè)定的不確定度評(píng)定

尹麗麗

(上海天祥質(zhì)量技術(shù)服務(wù)有限公司，上海　200233)

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禽畜肉中金剛烷胺殘留量測(cè)定的不確定度評(píng)定

尹麗麗

(上海天祥質(zhì)量技術(shù)服務(wù)有限公司，上海200233)

建立LCMSMS方法測(cè)定禽畜肉中金剛烷胺殘留量的方法，并進(jìn)行了不確定度評(píng)定。本文中的不確定度評(píng)定數(shù)學(xué)模型是根據(jù)CNAS-GL06-2006《化學(xué)分析中不確定度的評(píng)估指南》和JJF1059.1-2012《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》建立的，并對(duì)主要影響因素進(jìn)行了分析，得到了此測(cè)定方法的不確定度報(bào)告。結(jié)果表明：禽畜肉中的金剛烷胺殘留量用LCMSMS方法測(cè)定，其不確定度主要來源于所用儀器，標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制過程和校準(zhǔn)曲線的擬合。

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；動(dòng)物源性食品；金剛烷胺；不確定度

鹽酸金剛烷胺為一種對(duì)稱的三環(huán)狀胺，在病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞過程中起到抑制作用，還對(duì)病毒的脫殼有影響，并對(duì)其繁殖進(jìn)行抑制，因此用作治療和預(yù)防病毒性感染，并對(duì)由于A型流感病毒引起的呼吸道癥狀有很好的治療作用[1-2]。金剛烷胺是最早用于抑制流感病毒的抗病毒藥，在抑制人流感病毒方面，金剛烷胺具有價(jià)格低廉，效果明顯等特點(diǎn)。目前還曾在獸醫(yī)臨床上用于動(dòng)物病毒病的預(yù)防和治療，但并沒被批準(zhǔn)用作獸醫(yī)，畜禽如果用人類的抗病毒藥物，則很有可能引起病毒變異，進(jìn)而影響人類用藥的效果，并且可能導(dǎo)致動(dòng)物病毒產(chǎn)生耐藥性以及免疫抑制，如果不明確機(jī)理，還有可能導(dǎo)致藥物在動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生殘留，間接影響人類健康[3-4]。我國(guó)農(nóng)業(yè)部在2005年發(fā)布了第560號(hào)公告，其中明確禁止在獸藥領(lǐng)域生產(chǎn)和銷售金剛烷胺[5]。2006年美國(guó)FDA也明令禁止將金剛烷胺等人類抗病毒藥物用于畜禽類[6]。

關(guān)于該類藥物報(bào)道較多的是人血漿和藥物中金剛烷胺類藥物中金剛烷胺類藥物的測(cè)定方法，主要包括氣相色譜法[1]、液相色譜法[7-10]、毛細(xì)管電泳法[11]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[12-14]等。目前發(fā)布的金剛烷胺殘留測(cè)定方法只有兩個(gè)地方標(biāo)準(zhǔn)：DB32/T1163-2007 雞肝中金剛烷胺殘留量的測(cè)定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，DB21/2394-2014 雞肝和雞肉中金剛烷胺 金剛乙胺的檢測(cè) 超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(2015-6-29實(shí)施)，參考標(biāo)準(zhǔn)及多次實(shí)驗(yàn)建立了我們實(shí)驗(yàn)室自己的測(cè)定方法，然而一切測(cè)量結(jié)果都不可避免地具有不確定度。本文依據(jù)法規(guī)CNAS-GL06-2006《化學(xué)分析中不確定度的評(píng)估指南》和JJF1059.1-2012《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》，分析了用LCMSMS方法測(cè)定金剛烷胺測(cè)量結(jié)果的不確定度，從而明確了測(cè)量結(jié)果準(zhǔn)確性的影響因素，為得到更可靠準(zhǔn)確的結(jié)果提供了理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。

1　實(shí)　驗(yàn)

1.1材料與儀器

1.1.1材料與試劑

甲醇(色譜純)，美國(guó)天地；乙腈(色譜純)，美國(guó)天地；乙酸銨(優(yōu)級(jí)純)，上海安譜；甲酸(優(yōu)級(jí)純)，上海安譜；三氯乙酸(分析純)，國(guó)藥集團(tuán)；氨水(分析純),國(guó)藥集團(tuán)；金剛烷胺標(biāo)準(zhǔn)品(純度97.5%)，上海安譜；金剛烷胺-D15標(biāo)準(zhǔn)品(純度98%)，TRC；實(shí)驗(yàn)用水均為Millipore系統(tǒng)產(chǎn)生的超純水。

1.1.2儀器

THERMO液相色譜系統(tǒng)，賽默飛世爾科技公司；三重四極桿質(zhì)譜分析儀(配有電噴霧離子源)，賽默飛世爾科技公司；高速均質(zhì)器，上海標(biāo)本模型廠；渦旋混勻器，上海精科實(shí)業(yè)有限公司；高速冷凍離心機(jī)，上海菲恰爾分析儀器有限公司；氮吹濃縮儀，上海安譜；超聲波儀器，上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司；MS204S電子天平，梅特勒托利多；XS105電子天平，梅特勒托利多。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制

準(zhǔn)確稱量金剛烷胺和金剛烷胺-D15標(biāo)準(zhǔn)品配制成需要且合理濃度的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液和標(biāo)準(zhǔn)中間液體，再由標(biāo)準(zhǔn)中間液配制成金剛烷胺濃度為1.0 ng/mL、2.0 ng/mL、5.0 ng/mL、10.0 ng/mL、20.0 ng/mL，內(nèi)標(biāo)金剛烷胺-d15濃度為25.0 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.2.2樣品制備

稱取2 g(精確到0.01 g)試樣至50 mL離心管中，然后加入100 μL 的0.1 μg/mL金剛烷胺-D15內(nèi)標(biāo)，再加入15 mL乙腈提取液，渦旋振蕩1 min，超聲10 min，4000 r/min冷凍離心15 min，上清液轉(zhuǎn)移至另一50 mL離心管中，重復(fù)上述操作，合并上清液，加入10 mL正己烷輕微振搖3 min，4000 r/min冷凍離心5 min，除去正己烷層，轉(zhuǎn)移提取液到氮吹管，并氮吹至干，用1 mL水復(fù)溶，渦旋超聲溶解殘?jiān)^0.22 μm濾膜，供LC-MS/MS測(cè)定。

2　數(shù)學(xué)模型建立

樣品中金剛烷胺含量計(jì)算公式如下：

式中：X——樣品中金剛烷胺含量，μg/kg

A——樣液中金剛烷胺的峰面積

Ci——樣液中金剛烷胺-D15的濃度，ng/mL

Ais——標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中金剛烷胺-D15的峰面積

Cs——標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中金剛烷胺的濃度，ng/mL

Ai——樣液中金剛烷胺-D15的峰面積

As——標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的峰面積

Cis——標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中金剛烷胺-D15的濃度，ng/mL

V——定容體積，mL

M——樣品質(zhì)量，g

df——稀釋倍數(shù)

根據(jù)內(nèi)標(biāo)法的計(jì)算特點(diǎn)，可以知道樣液中金剛烷胺與其內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)量濃度比C是由A,Ci,Ais,Cs,Ai,As,Cis各分量計(jì)算而來，因此由這幾個(gè)分量產(chǎn)生的不確定度，可以歸入C中，而又因?yàn)殡S機(jī)影響的重復(fù)性系數(shù)frep值為1，則上面的計(jì)算公式可簡(jiǎn)化為：

3　分析不確定度的來源[15-18]

通過測(cè)試過程步驟以及數(shù)學(xué)模型，可以確定不確定度的主要來源有：回收率產(chǎn)生的不確定度，液質(zhì)聯(lián)用儀器定量校準(zhǔn)產(chǎn)生的不確定度，樣品稱量產(chǎn)生的不確定度，校準(zhǔn)曲線擬合過程產(chǎn)生的不確定度，制備樣液過程中的定容體積產(chǎn)生的不確定度，儀器定量重復(fù)性產(chǎn)生的不確定度，配制標(biāo)準(zhǔn)曲線過程產(chǎn)生的不確定度。

4　不確定度各分量的計(jì)算

4.1試樣測(cè)試過程中由重復(fù)性引入的不確定度

在金剛烷胺樣品中加標(biāo)，重復(fù)測(cè)定6次，表1為測(cè)定結(jié)果。

表1　重復(fù)測(cè)定加標(biāo)樣品的結(jié)果Table 1　Results of spiked sample determination

單次測(cè)量的試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)偏差：

因此，由測(cè)量重復(fù)性引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

4.2試樣稱量時(shí)產(chǎn)生的不確定度

準(zhǔn)確稱量樣品2.0000g，所用天平校準(zhǔn)允許的最大誤差為±0.0001g，按均勻分布考慮，則稱量試樣產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

4.3試樣制備過程中定容體積引入的不確定度

4.4液質(zhì)聯(lián)用儀器定量校準(zhǔn)引入的不確定度

測(cè)試所用儀器外校證報(bào)告給出擴(kuò)展不確定度urel=6.8%，K=2，由此，液質(zhì)聯(lián)用儀器產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

urel(LCMSMS)=0.068/2=0.034

4.5標(biāo)準(zhǔn)曲線配制過程產(chǎn)生的不確定度

4.5.1配制標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(C1)

(1)金剛烷胺和金剛烷胺-d15標(biāo)準(zhǔn)品證書給出純度分別為98%和97.5%，由標(biāo)準(zhǔn)品純度引入的不確定度為：

(2)天平允許的最大誤差為±0.01 mg，稱取標(biāo)品金剛烷胺和金剛烷胺-d15分別是1.00 mg和10.00 mg，取矩形分布，產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

(4)合成得到標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(C1)

4.5.2中間標(biāo)準(zhǔn)溶液配制所產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(C2)

=0.00930

4.5.3由標(biāo)準(zhǔn)中間液稀釋配制標(biāo)準(zhǔn)工作液產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(C3)

配制標(biāo)準(zhǔn)工作液過程中主要是由玻璃量器帶入的不確定度，根據(jù)規(guī)程JJG196-2006[19]的要求，并按三角分布考慮，則標(biāo)準(zhǔn)曲線配制過程中由玻璃量器所產(chǎn)生的不確定度見表2。

表2　標(biāo)準(zhǔn)曲線配制過程中玻璃量器所產(chǎn)生的不確定度Table 2　The uncertainty of the process of glass volume calibrationproduces standard working solution preparation

由于0.1 mL移液管在配制過程中使用了4次，0.25 mL移液管在配制過程中使用了5次，10 mL單標(biāo)線容量瓶使用了5次，因此標(biāo)準(zhǔn)工作液配制過程玻璃量器產(chǎn)生的合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

=0.0148

古詩文中理的第二個(gè)層次是對(duì)生命啟迪。曾經(jīng)滄海難為水,除卻巫山不是云。這句也是情理相融的經(jīng)典代表詩句。為什么會(huì)這么說呢？據(jù)說寫這首詩的作者，深深愛著他的家人，后來在他的家人離開他之后，他深深的懷念著。然后就寫下了這兩句詩“曾經(jīng)滄海難為水，除卻巫山不是云?！痹谧髡咂拮与x開他之后，他看到生活中各種各樣的人和事物，都已經(jīng)無法動(dòng)心了。“曾經(jīng)滄海難為水”意思就是說，看到過很多很多的河水，直到見識(shí)過了滄海。從此以后，再看普通的水，就已經(jīng)沒有感覺了。“除卻巫山不是云”意思是指巫山的云變化綺麗，所以見識(shí)過巫山的云之后，平平常常的云，再也無法激發(fā)起他心中的熱情。作者以此來表示他對(duì)妻子的深深地懷念。

4.5.4金剛烷胺標(biāo)準(zhǔn)曲線配制過程所產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(C)

4.6金剛烷胺標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合過程所產(chǎn)生的不確定度

標(biāo)準(zhǔn)曲線一共由5個(gè)濃度點(diǎn)組成，每個(gè)濃度水平測(cè)定一次，根據(jù)所得到的相應(yīng)的峰面積，用最小二乘法擬合，可得曲線方程Y=aC+b，以及相關(guān)系數(shù)R，y為金剛烷胺與內(nèi)標(biāo)物濃度的比值，x為金剛烷胺與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比值，見表3。

表3　曲線各濃度點(diǎn)測(cè)定結(jié)果及擬合方程Table 3　The results of the determination of theconcentration point of the curve and fitting equation

注：a=0.10372，b=-0.01357，R=0.9995

對(duì)于同一試樣，測(cè)定7次，由上述校準(zhǔn)曲線計(jì)算所得結(jié)果見表4。

表4　試樣溶液測(cè)定結(jié)果Table 4　Results of sample solution measurement

則校準(zhǔn)曲線擬合引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(C0)可由下式計(jì)算得到：

式中：a——校準(zhǔn)曲線的斜率

p——試樣測(cè)定次數(shù)

m——標(biāo)準(zhǔn)曲線各濃度點(diǎn)重復(fù)測(cè)定次數(shù)

Sy/c——標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)偏差

Sc/c——標(biāo)準(zhǔn)曲線各個(gè)濃度點(diǎn)的離均差平方和

Yij——標(biāo)準(zhǔn)曲線各個(gè)濃度點(diǎn)的響應(yīng)值

Yi——由線性方程計(jì)算所得的響應(yīng)值

Ci——標(biāo)準(zhǔn)曲線各濃度點(diǎn)濃度值

C0——試樣溶液的平均濃度

由上述公式計(jì)算得到的結(jié)果見表5。

表5　標(biāo)準(zhǔn)曲線用最小二乘法擬合時(shí)產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(C0)Table 5　The uncertainty urel(C0) of least square curve fitting

5　各個(gè)過程產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度的合成與擴(kuò)展

由前面的試驗(yàn)結(jié)果可知，試樣中金剛烷胺殘留量為 2.5μg/kg，因此其標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

u(X)=urel(X)2.5=0.120

取包含因子k=2，則金剛烷胺擴(kuò)展不確定度為：

U=K×u(X)=2×0.120 =0.24

6　結(jié)　論

由本試驗(yàn)得出，當(dāng)k=2(95%置信度)時(shí)，金剛烷胺的測(cè)定結(jié)果可表示為(2.5±0.24)μg/kg，并且根據(jù)文中各個(gè)不確定度分量的計(jì)算，可知本方法測(cè)定金剛烷胺，不確定度的主要來源為所用儀器，其次是標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制過程和校準(zhǔn)曲線的擬合，因此平時(shí)測(cè)試工作中，應(yīng)按規(guī)程定期的做好儀器的維護(hù)及校準(zhǔn)，在配制標(biāo)準(zhǔn)溶液時(shí)，操作要規(guī)范，養(yǎng)成良好正確的習(xí)慣，使得測(cè)試結(jié)果更為可靠。

[1]ANTOINES,FRANCOISEP.Gaschromatographicdeterminationofamantadinehydrochloride(symmetrel)inhumanplasmaandurine[J].JChromatogrB:BiomedSciandAppl, 1980,183(1):33-39.

[2]李士敏,王瑋.液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定大鼠血漿中鹽酸金剛烷胺濃度及體內(nèi)藥動(dòng)力學(xué)研究[J].藥物分析雜志,2007,37(1):66-68.

[3]WILLSRJ,FAROLINODA,CHOMAN,etal.Rimantadinepharmacokineticsaftersingleandmultipledoses[J].AntimicrobialAgents&Chemotherapy,1987,31(5):826-828.

[4]TOMINACKRL,WILLSRJ,GUSTAVSONLE,etal.Multiple-dosepharmacokineticsofrimantadineinelderlyadults[J].AntimicrobialAgents&Chemotherapy, 1988,32(12):1813-1 819.

[5]中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部.農(nóng)業(yè)部560號(hào)公告獸藥地方標(biāo)準(zhǔn)廢止目錄[EB/OL].http://www.moa.gov.vn/zwllm/tzgg/gg/200511/t20051117_496523.

[6]USFDA.FDAprohibitsuseofantiviraldrugsinpoultrytohelpkeepdrugseffectiveforhumans[EB/OL].http://www.fda.gov/NewsEvents/Newsroom/PressAnnouncements/2006/ucm108620.htm.

[7]修虹,黃榕珍,付梅春.HPLC-ELSD法測(cè)定復(fù)方氨酚烷胺膠囊中鹽酸金剛烷胺及對(duì)乙酰氨基酚的含量[J].中國(guó)藥品標(biāo)準(zhǔn),2006(1):23-25.

[8]HIGASHIY,UEMORII,FUJIIY.SimultaneousdeterminationofamantadineandRimantadinebyHPLCinratplasmawithpre-columnderivatizationandfluorescencedetectionforpharmacokineticstudies[J].BiomedChromatogr,2005,19(9):655-662.

[9]HIGASHIY,FUJIIY.Simultaneousdeterminationofthebindingofamantadineanditsanaloguestosyntheticmelaninbyliquidchromatographyafterprecolumnderivatizationwithdansylchloride[J].JChromatogrSci,2005,43(4):213-217.

[10]CUI SJ,FENG F,LIU H,et al.New method for high-performance liquid chromatographic determination of amantadine and its analogues in rat plasma[J].J Pharm Biomed Anal,2007,44(5):1100-1105.

[11]REVILLA A L,HAMACEKJ,LUBAL P,et al.Determination of rimantadine in pharmaceutical preparations by capillary zone electrophoresis with indirect detection or after derivatization[J].Chromatogr,1998,47(7/8):433-439.

[12]TORSTEN A,BRUNHILDE G,AXEL H,et al.Determination of serum amantadine by liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J].Clin Chim Acta,2005,359(1/2):125-131.

[13]WANG P,LIANG Y Z,CHEN B M,et al.Quantitative determination of amantadine in human plasma by liquid chromatography-mass spectrometry and the application in a bioequivalence study[J].J Pharm Biomed Anal,2007,43(4):1519-1525.

[14]云環(huán),張朝暉,羅生亮,等.固相萃取/LC-MS/MS法檢測(cè)動(dòng)物源性食品中的金剛烷胺[J].現(xiàn)代儀器,2009,15(6):42-45.

[15]國(guó)家質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局.JJF 1059-1999 測(cè)量不確定度評(píng)定與表示[S].北京:中國(guó)計(jì)量出版社,1999.

[16]嚴(yán)鳳,張文剛,李丹妮，等.液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定動(dòng)物源食品中氯霉素殘留量不確定度分析[J].上海畜牧獸醫(yī)通訊,2008(5):32-33.

[17]顏斌,曹軍,陳勇，等.高效液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定水產(chǎn)品中環(huán)丙沙星的不確定度[J].檢驗(yàn)檢疫學(xué)刊,2011(2):40-42.

[18]任雪冬,劉成雁,林雪征，等.液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定畜禽肉中十種磺胺類獸藥殘留的不確定度評(píng)定[J].中國(guó)獸藥雜志,2011,45(5):20-25.

[19]國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局.JJG 196-2006 常用玻璃量器檢定規(guī)程[S].北京:中國(guó)計(jì)量出版社,2006.

Uncertainty Evaluation for the Determination of Amantadine Residues in Animal Derived Food by LC-MS-MS

YINLi-li

(Shanghai Intertek Testing Services Co., Ltd., Shanghai 200233, China)

A LC-MS-MS method was set up to detect amantadine residues in animal derived food and evaluated the uncertainty of this method. According to the principle and method in CNAS-GL06-Guidance on evluating the Uncertainty in Chemical Analysis and JJF1059.1-2012 Evaluation and Expression of Uncertainty in Measurement, the main influence factors of the uncertainty were analyzed, a mathematic model was established, and the report of the detect method’s uncertainty was created. The results showed that the major factors of uncertainty in measurement were the instrument, preparation of standard solution and fitting of calibration curve.

LC-MS-MS; animal derived food; amantadine; uncertainty

尹麗麗(1980-)，女，碩士研究生，主要從事食品檢測(cè)與分析。

TS207.7

A

1001-9677(2016)015-0137-04