肉桂、丁香、連翹揮發(fā)油聯(lián)合抑菌作用研究*

黃涵年，闕　斐

(浙江經(jīng)貿(mào)職業(yè)技術(shù)學(xué)院應(yīng)用工程系，浙江　杭州　310018)

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肉桂、丁香、連翹揮發(fā)油聯(lián)合抑菌作用研究*

黃涵年，闕斐

(浙江經(jīng)貿(mào)職業(yè)技術(shù)學(xué)院應(yīng)用工程系，浙江杭州310018)

水蒸氣蒸餾提取肉桂、丁香、連翹三種香辛料揮發(fā)油，測(cè)定與評(píng)價(jià)三種揮發(fā)油對(duì)大腸桿菌與金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑、最低抑菌濃度(MIC)以及揮發(fā)油兩兩復(fù)配聯(lián)用的抑菌活性。結(jié)果顯示，供試菌對(duì)三種揮發(fā)油均高度敏感，且存在劑量效應(yīng)，隨著揮發(fā)油濃度的降低而降低。另外，肉桂(增效2倍)和丁香(增效2倍)、肉桂(增效2倍)和連翹(增效4倍)揮發(fā)油復(fù)配后對(duì)大腸桿菌表現(xiàn)出相加作用，對(duì)金黃色葡萄球菌表現(xiàn)出協(xié)同作用(均增效4倍)；而丁香和連翹揮發(fā)油復(fù)配后對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌，則表現(xiàn)出無(wú)關(guān)作用。

肉桂；丁香；連翹；揮發(fā)油；抑菌作用

香辛料具有獨(dú)特的刺激性香味，廣泛應(yīng)用于烹飪和食品工業(yè)中，起著調(diào)香、調(diào)味、調(diào)色等作用。目前，世界上已知香辛料多達(dá)500種。美國(guó)香辛料協(xié)會(huì)(American Spice Association)定義，凡是用來(lái)做食品調(diào)味用的植物，均可稱為食用香辛植物，我國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《GB/T 12729.1-2008 香辛料和調(diào)味品名稱》規(guī)定了68種我國(guó)常用香辛料植物性產(chǎn)品。另外，香辛料還具有抑菌、抗氧化及多種生理生化作用[1-2]。其中，香辛料的良好抑菌性能已經(jīng)被諸多研究所證實(shí)[3-6]。因此，從香辛料中提取出安全、高效的有效成分作為食品天然抑菌劑，具有廣闊的應(yīng)用前景。

揮發(fā)油(Volatile Oils)，又稱精油(Essential Oils)或者輕油，是一類具有揮發(fā)性和芳香氣味、可隨水蒸氣蒸餾出來(lái)的非水溶性油狀液體。研究證實(shí)，香辛料揮發(fā)油有明顯的抑菌活性[7-8]。由于香辛料揮發(fā)油作為天然防腐劑具有安全、天然、無(wú)毒等特點(diǎn)，符合人們對(duì)綠色消費(fèi)、健康生活的追求，已經(jīng)成為各國(guó)研究者的新寵。目前，可用于香辛料揮發(fā)油的提取方法有：蒸餾法、溶劑浸提法、吸收法、水?dāng)U散法、冷壓法、冷凍法、超臨界流體萃取法和超聲波萃取法等。

本文選擇肉桂、丁香、連翹三種香辛料，水蒸氣蒸餾提取揮發(fā)油，采用濾紙片法、棋盤稀釋法對(duì)三種香辛料揮發(fā)油、揮發(fā)油兩兩混合物聯(lián)合的抗菌效應(yīng)分別進(jìn)行了研究，以期為香辛料揮發(fā)油作為天然防腐劑的研究開(kāi)發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1　實(shí)　驗(yàn)

1.1材料與試劑

肉桂、丁香、連翹購(gòu)自杭州市江干區(qū)藥房；大腸桿菌(Escherichia coli)AS1.90；金黃色葡萄糖球菌(Staphylococcus aureus)AS1.89，均購(gòu)自中科院微生物所。

營(yíng)養(yǎng)瓊脂(Nutrient Agar，NA)培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)肉湯(Nutrient Broth，NB)培養(yǎng)基，青島海博生物技術(shù)有限公司；吐溫-80(分析純AR)，美國(guó)Sigma公司。本實(shí)驗(yàn)所用其余生化試劑均為分析純。

1.2儀器與設(shè)備

水蒸氣蒸餾裝置；恒溫恒濕培養(yǎng)箱(LHS-100CL型)，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；分析天平(ATL-224-I)，德國(guó)艾科勒；壓力蒸汽滅菌鍋(GI54DWS)，廈門致微儀器有限公司；普通生物顯微鏡(N-400M)，寧波永新光學(xué)股份有限公司。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1水蒸氣蒸餾提取

揮發(fā)油與水不相混合，因此，含有揮發(fā)油的中草藥可以利用水蒸氣蒸餾法來(lái)提取(《中華人民共和國(guó)藥典》)。分別將肉桂、丁香、連翹三種香辛料進(jìn)行粉碎，取200 g粉末于三口圓底燒瓶中，加入10倍量(m/V)的蒸餾水，室溫浸泡2 h，用電熱套加熱直至沸騰，調(diào)節(jié)溫度，保持料液沸騰狀態(tài)提取6 h，待冷凝管上看不到有油滴出現(xiàn)時(shí)說(shuō)明蒸餾徹底。蒸餾提取過(guò)程中，注意觀察油水分離器中揮發(fā)油提取情況，收集揮發(fā)油。

1.3.2揮發(fā)油脫水處理

將所得產(chǎn)物裝入分液漏斗，加入適量石油醚搖勻，進(jìn)行萃取，取上層。用無(wú)水硫酸鈉吸收多余水分后，得粗制揮發(fā)油。將粗制揮發(fā)油轉(zhuǎn)移至蒸餾燒瓶中，45℃真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，待石油醚蒸發(fā)徹底后，得精制香辛料揮發(fā)油。取出揮發(fā)油，用0.22μM的微孔過(guò)濾器進(jìn)行過(guò)濾除菌后，置于已滅菌的棕色樣品瓶中，于4℃冰箱中儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3藥液與菌懸液制備

藥液制備。將所得肉桂、丁香、連翹三種揮發(fā)油原液，分別用滅菌處理的1.0%吐溫-80蒸餾水溶液依此稀釋配制成100%、80%、60%、40%、20%、10%、5%、2.5%、1.25%、0.625%、0.313%、0.156%等不同濃度的藥液。

菌懸液制備。分別將大腸桿菌、金黃色葡萄球菌接種在營(yíng)養(yǎng)瓊脂上，于37℃培養(yǎng)14 h進(jìn)行活化，挑取活化的細(xì)菌菌落，營(yíng)養(yǎng)瓊脂劃線培養(yǎng)24 h，用無(wú)菌生理鹽水將菌落洗脫下來(lái)，充分振蕩，采用平板培養(yǎng)計(jì)數(shù)法測(cè)定細(xì)菌數(shù)量，再制成106～107CFU/mL的菌懸液，備用。

1.3.4肉桂、丁香、連翹揮發(fā)油體外抑菌實(shí)驗(yàn)

采用濾紙片法。用打孔器制備直徑為6 mm圓形濾紙片，滅菌干燥后，分別浸泡于制備的肉桂、丁香、連翹三種揮發(fā)油藥液(100%、80%、60%、40%、20%、10%)中1 h，晾干備用。制備滅菌營(yíng)養(yǎng)瓊脂平皿，吸取已調(diào)整濃度的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌菌懸液0.1mL，加入營(yíng)養(yǎng)瓊脂平皿。分別取已浸泡三種揮發(fā)油的濾紙片貼于平皿上，每皿3片，濾紙片間保持一定的距離。同時(shí)以1.0%吐溫-80蒸餾水溶液為陰性對(duì)照，以蒸餾水為空白對(duì)照。(36±1)℃下培養(yǎng)24 h后，用十字交叉法測(cè)抑菌圈大小。實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3 次。

1.3.5肉桂、丁香、連翹揮發(fā)油最低抑菌濃度(MIC)測(cè)定

最小抑菌濃度(Minimal Inhibitory Concentration，MIC)是指能抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的最低濃度，常被用來(lái)比較不同抑菌物質(zhì)的抑菌性能，是用來(lái)判斷藥物抑菌活性的最重要測(cè)定指標(biāo)[9]。分別取制備的三種揮發(fā)油藥液(10%、5%、2.5%、1.25%、0.625%、0.313%、0.156%、0.078%)2mL加入到無(wú)菌平皿，傾入55℃左右滅菌營(yíng)養(yǎng)瓊脂18mL，充分混勻(培養(yǎng)基中揮發(fā)油濃度為1%、0.5%、0.25%、0.125%、0.0625%、0.0313%、0.0156%、0.0078%)。待培養(yǎng)基凝固后，吸取菌懸液0.1mL于含不同濃度揮發(fā)油的培養(yǎng)基上涂布均勻。取2mL 1.0%吐溫-80蒸餾水溶液加入平皿，混勻18mL營(yíng)養(yǎng)瓊脂，涂布0.1mL為陰性對(duì)照，同時(shí)設(shè)置蒸餾水空白對(duì)照。(36±1)℃下培養(yǎng)24 h后，以完全無(wú)菌生長(zhǎng)的最低精油稀釋濃度為揮發(fā)油對(duì)某供試菌的最低抑菌濃度(MIC)。實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3 次。

1.3.6復(fù)配聯(lián)用揮發(fā)油的抑菌活性測(cè)定與評(píng)價(jià)

采用棋盤稀釋法(Checkerboard Method)，兩種供試菌均按照橫排5管+縱裂5管排布，試管內(nèi)加入9mL培養(yǎng)基。用1.0%吐溫-80蒸餾水溶液分別將A揮發(fā)油和B揮發(fā)油稀釋成10、5、2.5、1.25、0.625 MIC系列揮發(fā)油稀釋液。兩種揮發(fā)油不同濃度各0.5mL混勻，并分別按橫排從上至下和縱裂從右往左加入到試管中(圖1)，則試管中兩種揮發(fā)油濃度依此為0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125MIC。置于(36±1)℃培養(yǎng)24 h。采用測(cè)定MIC的方法對(duì)各試管內(nèi)的菌體生長(zhǎng)情況進(jìn)行檢驗(yàn)。以1.0%吐溫-80蒸餾水溶液為對(duì)照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

圖1　棋盤稀釋法示意圖

用分級(jí)抑制濃度指數(shù)(Factional inhibitory concentration indices，F(xiàn)ICI)評(píng)價(jià)兩種揮發(fā)油聯(lián)合抑菌效果[10-11]，其計(jì)算公式為：

FICI=FICA+FICB=(MICA聯(lián)合時(shí)/MICA單獨(dú)時(shí))+(MICB聯(lián)合時(shí)/MICB單獨(dú)時(shí))

FICI的判斷標(biāo)準(zhǔn)為：FICI≤0.5，為協(xié)同作用;0.52時(shí)為拮抗作用。

1.3.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)都以均值的標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)表示，所有數(shù)據(jù)分析使用SPSS 17.0計(jì)算，圖形由GraphPad Prism 5.0軟件處理。

2　結(jié)果與討論

2.1肉桂、丁香、連翹揮發(fā)油提取

香辛料植物均含有一定的揮發(fā)油，但是不同的香辛料揮發(fā)油含量差異較大，顏色也不同，肉桂、丁香、連翹三種揮發(fā)油提取結(jié)果見(jiàn)表1。

表1　肉桂、丁香、連翹三種揮發(fā)油提取結(jié)果

其中，肉桂和丁香揮發(fā)油均大于1，連翹揮發(fā)油密度小于1；丁香揮發(fā)油提取得率最高(12.0%～14.0%)，其次為肉桂揮發(fā)油提取得率(2.0%～2.5%)，連翹揮發(fā)油提取得率最低(1.5%～2.0%)。

香辛料揮發(fā)油存在于香辛料植物表皮組織的腺毛、油室、分泌細(xì)胞和樹(shù)脂道中，多數(shù)呈油滴狀存在，也有些與樹(shù)脂、粘液質(zhì)共同存在[12]。使用水蒸氣蒸餾法行香辛料揮發(fā)油提取，為了提高得率和提取速度，在提取揮發(fā)油前對(duì)肉桂、丁香、連翹進(jìn)行粉碎和浸泡處理后，水蒸氣蒸餾，收集揮發(fā)油。三種香辛料揮發(fā)油提取過(guò)程可以看出，蒸餾初始時(shí)揮發(fā)油大量餾出，3 h內(nèi)90%以上的揮發(fā)油已經(jīng)提取出來(lái)，3 h后，料液中油類組分減少，油水比降低，共沸點(diǎn)升高，揮發(fā)油餾出量減少(圖2)。

圖2　肉桂、丁香、連翹揮發(fā)油提取率測(cè)定

根據(jù)抑菌圈實(shí)驗(yàn)結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)[13]：抑菌圈直徑>15 mm為高度敏感；抑菌圈直徑10～15 mm為中度敏感；抑菌圈直徑為7～9 mm為低度敏感；抑菌圈直徑<7 mm為不敏感；直徑越大抗菌活性越強(qiáng)。結(jié)果顯示，三種香辛料揮發(fā)油原液及中、高濃度稀釋液(>40%)對(duì)供試菌(大腸桿菌、金黃色葡萄球菌)均屬于高度敏感。肉桂、丁香、連翹三種揮發(fā)油對(duì)大腸桿菌的抑菌圈直徑測(cè)定結(jié)果如圖3所示：肉桂、丁香、連翹揮發(fā)油對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)的抑制能力均隨著濃度的降低而降低，存在劑量效應(yīng)；各濃度丁香揮發(fā)油對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)的抑菌能力強(qiáng)于肉桂與連翹揮發(fā)油抑菌能力。

圖3　肉桂、丁香、連翹揮發(fā)油對(duì)大腸桿菌的抑菌圈直徑

2.2肉桂、丁香、連翹揮發(fā)油抑菌實(shí)驗(yàn)

對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑測(cè)定結(jié)果如圖4所示：肉桂、丁香、連翹揮發(fā)油對(duì)金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)的抑制能力均隨著濃度的降低而降低，存在劑量效應(yīng)；各濃度肉桂揮發(fā)油對(duì)金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)的抑菌能力強(qiáng)于丁香與連翹揮發(fā)油抑菌能力。

圖4　肉桂、丁香、連翹揮發(fā)油對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑

2.3肉桂、丁香、連翹揮發(fā)油最低抑菌濃度(MIC)測(cè)定結(jié)果

肉桂、丁香、連翹三種揮發(fā)油最低抑菌濃度(MIC)測(cè)定結(jié)果如表2所示。

表2　肉桂、丁香、連翹揮發(fā)油對(duì)供試菌MIC

由表2可以看出，肉桂揮發(fā)油對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的MIC均為0.0625%；丁香揮發(fā)油對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的MIC均為0.125%；連翹揮發(fā)油對(duì)大腸桿菌的MIC為0.125%，對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC為0.25%。肉桂、丁香、連翹三種揮發(fā)油均表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑菌作用。

2.4肉桂、丁香、連翹揮發(fā)油兩兩復(fù)配抑菌活性測(cè)定與評(píng)價(jià)

肉桂、丁香、連翹三種香辛料揮發(fā)油兩兩復(fù)配后對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌進(jìn)行體外抗菌試驗(yàn)，聯(lián)合抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

肉桂揮發(fā)油和丁香揮發(fā)油復(fù)配后對(duì)大腸桿菌，MIC聯(lián)用值均為MIC單用的0.5倍時(shí)，兩者FICI值最小(=1)，因此，肉桂揮發(fā)油和丁香揮發(fā)油聯(lián)合使用后，對(duì)大腸桿菌表現(xiàn)出相加作用，增效2倍；對(duì)于金黃色葡萄球菌，兩者的MIC聯(lián)用值均為MIC單用的0.25倍時(shí)，F(xiàn)ICI值最小(=0.5)，表現(xiàn)出協(xié)同作用，增效4倍。

肉桂揮發(fā)油和連翹揮發(fā)油復(fù)配后對(duì)大腸桿菌，MIC肉桂-聯(lián)用值為MIC肉桂-單用的0.5倍，MIC連翹-聯(lián)用值為MIC連翹-單用的0.25倍時(shí)，F(xiàn)ICI值最小(=0.75)，表現(xiàn)出相加作用，肉桂揮發(fā)油增效2倍，連翹揮發(fā)油增效4倍；對(duì)于金黃色葡萄球菌，兩者的MIC聯(lián)用值均為MIC單用的0.25倍時(shí)，F(xiàn)ICI值最小(=0.5)，表現(xiàn)出協(xié)同作用，均增效4倍。

丁香揮發(fā)油和連翹揮發(fā)油復(fù)配后對(duì)大腸桿，MIC丁香-聯(lián)用值為MIC丁香-單用的0.125倍，MIC連翹-聯(lián)用值與MIC連翹-單用值相等時(shí)，F(xiàn)ICI值最小(=1.125)，表現(xiàn)出無(wú)關(guān)作用；對(duì)于金黃色葡萄球菌，同樣，當(dāng)MIC丁香-聯(lián)用值為MIC丁香-單用的0.125倍，MIC連翹-聯(lián)用值與MIC連翹-單用值相等時(shí)，F(xiàn)ICI值最小(=1.125)，表現(xiàn)出無(wú)關(guān)作用。

表3　肉桂、丁香、連翹揮發(fā)油聯(lián)合抑菌試驗(yàn)與效果評(píng)價(jià)

3　結(jié)　論

本研究采用水蒸氣蒸餾提取肉桂、丁香、連翹三種揮發(fā)油，濾紙片法、棋盤稀釋法測(cè)定了三種揮發(fā)油單用及兩兩聯(lián)用的抑菌作用。結(jié)果顯示，(1)肉桂、丁香、連翹三種揮發(fā)油對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)的抑制能力較強(qiáng)，且存在劑量效應(yīng)，均隨著濃度的降低而降低；(2)丁香揮發(fā)油對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)的抑菌能力強(qiáng)于肉桂與連翹揮發(fā)油，而對(duì)于金黃色葡萄球菌，肉桂揮發(fā)油的抑菌能力強(qiáng)于丁香與連翹揮發(fā)油；(3)肉桂和丁香揮發(fā)油復(fù)配后對(duì)大腸桿菌表現(xiàn)出相加作用，均增效2倍，對(duì)金黃色葡萄球菌表現(xiàn)出協(xié)同作用，均增效4倍；(4)肉桂和連翹揮發(fā)油復(fù)配后對(duì)大腸桿菌亦表現(xiàn)出相加作用，分別增效2倍與4倍，對(duì)金黃色葡萄球菌表現(xiàn)出協(xié)同作用增，均增效4倍；(5)丁香和連翹揮發(fā)油復(fù)配后對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌，均表現(xiàn)出無(wú)關(guān)作用。

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Study on Combined Antiseptic Effects of Cinnamon,Cloves and Forsythia Suspense Volatile Oils*

HUANG Han-nian,QUE Fei

(Department of Applied Engineering,Zhejiang Economic & Trade Polytechnic,Zhejiang Hangzhou 310018,China)

Spices volatile oils of cinnamon,cloves and forsythia suspense were extracted by steam distillation.The inhibition zone diameters,minimum inhibition concentrations (MICs) and the antimicrobial activities of two volatile oils compound on Escherichia coli and Staphylococcus aureus were determined and evaluated.The results showed that the tested microorganisms were highly sensitive to three kinds of volatile oils,all with a dose effect.The antimicrobial activities were decreased with the decrease of concentration of the volatile oils.The combined use of cinnamon (2 times efficiency) and cloves volatile oils (2 times efficiency),cinnamon (2 times efficiency) and forsythia suspense (4 times efficiency) volatile oils both had additive effects on Escherichia coli,and synergic effects on Staphylococcus aureus(all 4 times efficiency),and the combined use of cloves and forsythia suspense volatile oils showed indifferent effects on Escherichia coli and Staphylococcus aureus.

cinnamon; cloves; forsythia suspense; volatile oil; antimicrobial activity

浙江經(jīng)貿(mào)職業(yè)技術(shù)學(xué)院2015年院級(jí)科研課題(No:15QN02)。

黃涵年(1988-)，男，助教，主要從事農(nóng)產(chǎn)品與食品微生物檢驗(yàn)。

TS201.3

A

1001-9677(2016)011-0095-04