新型齊墩果酸煙酸衍生物的合成及其活性研究*

燕志衛(wèi)，張麗穎

(河北省中藥研究與開發(fā)重點實驗室，承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所，河北　承德　067000)

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新型齊墩果酸煙酸衍生物的合成及其活性研究*

燕志衛(wèi)，張麗穎

(河北省中藥研究與開發(fā)重點實驗室，承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所，河北承德067000)

以五環(huán)三萜化合物齊墩果酸以及煙酸為原料，經(jīng)取代、酯化、?；?、還原等反應(yīng)合成了2個新型齊墩果酸煙酸衍生物，并對兩個化合物進行了糖原磷酸化酶抑制活性測試。結(jié)果表明兩個化合物均顯示出了一定的糖原磷酸化酶抑制活性。此外，實驗過程中，對齊墩果酸芐酯的酯化反應(yīng)進行了優(yōu)化。中間體及目標(biāo)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)均經(jīng)NMR、IR和MS確證。

齊墩果酸；合成；煙酸；糖原磷酸化酶抑制劑

糖尿病是一種常見多發(fā)的慢性代謝性疾病，其臨床表現(xiàn)主要為高血糖和糖尿。持續(xù)的高血糖會導(dǎo)致許多并發(fā)癥的發(fā)生，特別是高脂血癥是導(dǎo)致脂肪肝、動脈粥樣硬化等的重要危險因素，嚴(yán)重威脅人們的健康和生命[1]。過去認為，糖尿病脂代謝異常是繼發(fā)于糖代謝的紊亂，但在2001 年ADA大會上,得到了重新認識，糖尿病不僅僅是高血糖的問題。McGarry提出了脂代謝異常是2型糖尿病及其并發(fā)癥的原發(fā)性病理生理過程，糖尿病可稱為糖脂病 (diabetesmellipidus)[2]。

國際上目前對糖尿病合并脂代謝紊亂尚無良好的根治藥物，治療多以西藥為主，但存在低血糖癥、胃腸道反應(yīng)等副作用，同時隨著治療時間的延長，降糖效果呈降低趨勢。因此，尋找抗糖尿病新藥，特別是從天然中草藥中篩選有效、安全、方便使用的降糖藥物，日益為世界各國醫(yī)藥工作者所關(guān)注，成為當(dāng)前研究的熱點。

齊墩果酸是中藥青葉膽全草或女貞子的果實中分離得到的一種五環(huán)三萜化合物，已被證實具有顯著的降血糖活性，可作為潛在的降糖藥物[3-6]。但由于齊墩果酸的水溶性較差、活性較弱、且對糖尿病高血脂并發(fā)癥無顯著作用，使其臨床應(yīng)用受到限制。煙酸具有較好的水溶性，臨床上常用于調(diào)節(jié)血脂異常。但是，由于煙酸游離羧基的存在，會導(dǎo)致用藥者出現(xiàn)面部潮紅、瘙癢、胃腸道不適等副作用[7]。因此，我們綜合利用齊墩果酸和煙酸各自的特點，應(yīng)用拼合原理，合成齊墩果酸煙酸衍生物。以期獲得水溶性增加、生物利用度高、具有協(xié)同降糖降脂類新藥，以便工業(yè)化生產(chǎn)和臨床應(yīng)用。

圖1　齊墩果酸煙酸衍生物的合成路線

1　實　驗

1.1儀器與試劑

AVANCE-300MHz型核磁共振儀，德國Bruker；SHIMADZU FTIR-8400S傅里葉變換紅外光譜儀，德國Bruker；HP1100LC/MSD，美國PE；maXis impact-HRMS，德國Bruker；RY-1熔點儀，天津市分析儀器廠；酶標(biāo)儀，美國BIO-RAD公司；數(shù)顯示水浴鍋，國華電器有限公司；電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海?，攲嶒炘O(shè)備有限公司；臺式離心機，上海手術(shù)器械廠；高壓滅菌鍋，上海醫(yī)用核子儀器廠；752分光光度計；96孔板，美國COSTAR公司。

糖原磷酸化酶、葡萄糖-1-磷酸、糖原、孔雀綠，美國SIGMA公司；咖啡因，上海試劑二廠；Hepes、EGTA、EDTA，南京生興生物技術(shù)有限公司；四水合鉬酸銨，合肥工業(yè)大學(xué)化學(xué)試劑廠。其余試劑均為化學(xué)純或分析純試劑。

1.2合成實驗

1.2.1煙酸-2-丙炔酯(3)

將煙酸(0.39 g,3.16 mmol)和K2CO3(0.87 g,6.32 mmol)置于無水DMF(10mL)中，緩慢加入溴丙炔(0.42 g,3.48 mmol)，室溫攪拌過夜。過濾除去碳酸鉀，母液傾倒入水中，乙酸乙酯萃取，依次以1 N鹽酸水溶液、飽和碳酸氫鈉水溶液和飽和食鹽水洗滌，無水Na2SO4干燥，蒸去溶劑得到壬酸丙炔酯粗品，此粗品無需純化可直接用于下一步反應(yīng)。

1.2.23β-羥基齊墩果烷-12-烯-28-羧酸芐酯(4)

將齊墩果酸(100 g，0.22 mol)和K2CO3(61 g,0.44 mol)置于DMF(800mL) 中，在50～55℃下于20 min內(nèi)滴加氯芐(33mL,0.29 mol)，滴畢維持此溫度攪拌4 h。將反應(yīng)混合物冷至室溫后過濾，濾餅以DMF (50mL×3)洗滌，得到的母液傾入倒入冰水(3000mL)中，邊倒邊攪拌使析出的固體分散，靜置使固體顆粒變大(必要時可向其中加入食鹽并用冰水浴冷卻)，抽濾收集固體，以水充分洗滌。干燥后得白色的齊墩果酸芐酯(115 g,96%)。產(chǎn)品無需進一步純化可直接用于下一步反應(yīng)。分析用純品經(jīng)快速硅膠柱層析制得。m.p.190～192℃。IR(KBr,cm-1):3354,2943,2865,1724,1461,1386,1261,1158,1122,1030,749,696。1H-NMR(300 MHz,CDCl3):0.62,0.78,0.88,0.90,0.92,0.98,1.13 (each 3H,s),2.91 (1H,dd,J=4.4,13.9),3.20 (1H,dd,J=4.5,11.2),5.06 (1H,d,J=12.5),5.08 (1H,d,J=12.5),5.28 (1H,t,J=3.6),7.33 (5H,m)。ESI-MS:569[M+Na]+。

1.2.33β-氯乙酰氧基齊墩果烷-12-烯-28-羧酸芐酯(5)

方法一：將齊墩果酸芐酯(0.5 g,0.92 mmol)溶于吡啶(50mL)，緩慢加入氯乙酸酐10.9mL，室溫攪拌過夜。減壓蒸去吡啶，殘留物以乙酸乙酯溶解后依次以1 N鹽酸、飽和碳酸氫鈉溶液和水洗滌，無水硫酸鈉干燥。除去干燥劑，母液蒸去溶劑后快速柱層析(石油醚/乙酸乙酯=200/1，V/V)得白色固體(0.26 g,46%)。m.p.174～176℃。IR(KBr,cm-1):2947,2876,1727,1462。1H-NMR (300 MHz,CDCl3):0.61,0.87,0.88,0.90,0.91,0.92,1.12 (each 3H,s),2.92 (1H,dd,J=4.2,14.1 Hz),4.04 (2H,s),4.57(1H,t),5.04 (1H,d,J=12.3 Hz),5.10 (1H,d,J=12.3 Hz),5.28 (1H,t),7.29-7.36 (5H,m)。ESI-MS:645.2[M+Na]+。

方法二：將齊墩果酸芐酯(0.5 g,0.92 mmol)溶于干燥二氯甲烷(10mL)中,加入三乙胺 (0.55mL,3.7 mmol)，冷卻至0℃。冰浴下，將氯乙酰氯(0.32mL,3.7 mmol)于30 min內(nèi)緩慢滴加至此溶液中，然后室溫攪拌24 h。減壓蒸除溶劑，殘余物用乙酸乙酯稀釋，然后依次以飽和碳酸氫鈉溶液和飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥后蒸去溶劑?？焖僦鶎游?石油醚/乙酸乙酯=200/1,V/V)，得淡黃色固體(0.32 g,55%)。

方法三：將齊墩果酸芐酯(0.5 g,0.92 mmol)溶于干燥的CH2Cl2(10mL)中,加入K2CO3(0.25 g,1.84 mmol)和催化量的DMAP，冷卻至0℃。將氯乙酰氯(0.32 g,2.76 mmol)于30 min內(nèi)緩慢滴加至此溶液中，然后室溫攪拌24 h。過濾，減壓蒸除溶劑，殘渣用乙酸乙酯稀釋，以飽和食鹽水洗滌，無水Na2SO4干燥后蒸去溶劑?？焖僦鶎游?石油醚/乙酸乙酯=200/1,V/V)，得白色固體(0.5 g，89%)。

1.2.43β-疊氮乙酰氧基齊墩果烷-12-烯-28-羧酸芐酯(6)

將3β-氯乙?；R墩果烷-12-烯-28-羧酸芐酯(0.18 g,0.29 mmol)溶于DMF(8mL)中,加入NaN3(0.11 g,0.45 mmol)，然后在75℃下攪拌3.5 h。反應(yīng)液傾入冰水中，乙酸乙酯萃取，有機相以飽和食鹽水洗滌，無水Na2SO4干燥，過濾，濃縮，快速柱層析(石油醚/乙酸乙酯=50:1,V/V)，得白色固體(0.17 g,92%)。m.p.135～137℃。IR(KBr,cm-1):2947,2876,2106,1730,1462。1H-NMR (300 MHz,CDCl3):0.61,0.88,0.89,0.90,0.92,1.13,1.55 (each 3H,s),2.90 (1H,dd,J=4.3,13.8 Hz),3.85 (2H,s),4.61 (1H,t),5.04 (1H,d,J=12.6 Hz),5.09 (1H,d,J=12.6 Hz),5.29 (1H,t),7.29～7.36 (5H,m)。ESI-MS:652.3[M+Na]+。

1.2.53β-[4-煙酰氧甲基-(1-氫-1,2,3-三氮唑-1-基)]乙酰氧基齊墩果烷-12-烯-28-羧酸芐酯(7)

將3β-疊氮乙酰氧基齊墩果烷-12-烯-28-羧酸芐酯(0.2 g,0.32 mmol)和煙酸-2-丙炔基酯(51 mg,0.32 mmol)溶于CH2Cl2(1.5mL)和H2O (1.5mL)的混合溶劑中，加入CuSO4。5H2O (28 mg,0.11 mmol)和Vc-Na (45 mg,0.23 mmol)，室溫攪拌過夜。減壓蒸除溶劑，殘渣以乙酸乙酯稀釋，水洗，無水Na2SO4干燥，濃縮，快速柱層析(石油醚/乙酸乙酯=5:1,V/V)分離，得到白色固體(0.21 g,83%)。m.p.130～132℃。IR(KBr,cm-1):2947,1728,1463,1279。1H-NMR (300 MHz,CDCl3):0.52,0.61,0.73,0.78,0.82,0.84,1.04 (each 3H,s),2.83 (1H,d,J=9.93 Hz),4.46～4.52 (1H,m),4.99 (2H,dd,J=12.5,16.8 Hz),5.09 (2H,s),5.20 (1H,t),5.46 (2H,s),7.26 (5H,m),7.30～7.34 (1H,m),7.76 (1H,s),8.23 (1H,d,J=7.98 Hz),8.71 (1H,d,J=3.54 Hz),9.15 (1H,s)。13C-NMR (75 MHz):177.4; 165.7; 153.3; 150.8; 143.8; 142.8; 137.5; 136.5; 128.4; 128.0; 127.9; 125.5; 123.4; 122.3; 84.0; 65.9; 58.4; 55.2; 51.2; 47.5; 46.7; 45.9; 41.7; 41.4; 39.3; 38.0; 37.7; 36.8; 33.9; 33.1; 32.6; 32.4; 30.7; 28.1; 27.6; 25.8; 23.6; 23.4; 23.1; 18.1; 16.9; 16.5; 15.3。ESI-MS:829.0[M+K]+。

1.2.63β-[4-煙酰氧甲基-(1-氫-1,2,3-三氮唑-1-基)]乙酰氧基齊墩果烷-12-烯-28-羧酸(8)

將3β-棕櫚?；R墩果烷-12-烯-28-羧酸芐酯(180 mg,0.23 mmol)溶于四氫呋喃(10mL)中，加入催化量的10%Pd/C，室溫常壓氫化24 h。常壓過濾除去Pd/C，濾液蒸干得到粘稠狀液體。柱層析(石油醚/乙酸乙酯=20:1,V/V)分離，得到白色固體(0.16 g,89%)。m.p.187～189℃.IR(KBr,cm-1):2945,2873,1740,1691。1H-NMR (300 MHz,CDCl3):0.65,0.69,0.75,0.84,0.85,0.86,1.06 (each 3H,s),2.17 (1H,d,J=15.9 Hz),2.75 (1H,d,J=10.2 Hz),4.01 (2H,s),4.47～4.52 (1H,m),4.99 (2H,s),5.20 (3H,s),7.32～7.45 (4H,m),7.70～7.87 (3H,m)。13C-NMR (75 MHz):183.0; 171.4; 165.7; 143.7; 143.2; 133.9; 132.1; 130.2; 128.7; 128.2; 128.1; 126.4; 125.8; 125.5; 125.1; 123.7; 122.4; 83.9; 58.1; 55.2; 51.1; 47.6; 46.5; 45.9; 41.6; 41.0; 39.3; 38.9; 38.0; 37.8; 37.0; 33.8; 33.0; 32.5; 32.5; 30.7; 28.1; 27.7; 25.9; 23.6; 23.4; 22.9; 18.2; 17.1; 16.5; 15.3。ESI-MS:764.7[M+H]+。

1.3化合物對糖原磷酸化酶的抑制活性測試

參照文獻方法[8]，對本文合成的2個目標(biāo)化合物，以咖啡因為陽性對照，進行了抑制兔肌肉糖原磷酸化酶(RMGPa)活性測試。操作流程如下：在微孔板中加入反應(yīng)緩沖液，加入待測化合物及RMGPa，室溫溫孵20 min，加入顯色液(鉬酸銨和孔雀綠)，用BIORAD多功能酶標(biāo)儀測定(檢測波長：655 nm)。

2　結(jié)果與討論

2.1關(guān)于合成中涉及到齊墩果酸芐酯的酯化反應(yīng)方法的討論

羥基的酯化通常是一種簡單的反應(yīng)，但齊墩果酸芐酯結(jié)構(gòu)鋼性，位阻大，羥基活性差，酯化反應(yīng)較難進行，尤其是與酸的直接酯化非常困難。所以我們嘗試了多種方法進行齊墩果酸芐酯3位羥基的酯化：首先采用酸酐法，以吡啶既做堿又做溶劑，反應(yīng)結(jié)果不理想，產(chǎn)率很低。改用CH2Cl2為溶劑，三乙胺為除酸劑，結(jié)果雖有所改善，但仍不理想，副產(chǎn)物較多，延長反應(yīng)時間有利于提高收率，但通過實驗研究發(fā)現(xiàn)，延長反應(yīng)時間也會增加副產(chǎn)物的種類和含量。因此，本文采用CH2Cl2為溶劑，K2CO3作除酸劑，DMAP為催化劑，既提高了收率，也縮短了反應(yīng)歷程，后處理簡單。

2.2糖原磷酸化酶抑制活性結(jié)果與討論

本文測定了2個新化合物對RMGPa的抑制活性，結(jié)果見表1。

表1　化合物7～8對糖原磷酸化酶的抑制活性

a每個結(jié)果都是三組實驗的平均值；b以咖啡因為陽性對照。

表1結(jié)果顯示：所合成的齊墩果酸煙酸衍生物顯示出一定的糖原磷酸化酶抑制活性，但是化合物均低優(yōu)于其先導(dǎo)化合物齊墩果酸 (IC50=66μM)。受化合物數(shù)量所限，未得出明顯的構(gòu)效關(guān)系，深入的構(gòu)效關(guān)系尚待進一步研究。

3　結(jié)　論

以齊墩果酸及煙酸為母核，應(yīng)用拼合原理共合成4個中間體化合物以及2個新的未見文獻報道的齊墩果酸煙酸衍生物，對實驗中涉及到的齊墩果酸芐酯的酯化反應(yīng)方法進行了摸索及討論，提高了產(chǎn)率。對所合成的2個目標(biāo)化合物進行了糖原磷酸化酶抑制活性測試?；钚詼y試結(jié)果顯示2個目標(biāo)化合物均顯示出一定的糖原磷酸化酶抑制活性。

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Study on the Conjugates of Oleanolic Acid-nicotinic Acid as Glycogen Phosphorylase Inhibitor*

YAN Zhi-wei,ZHANG Li-ying

(Key Laboratory of Research and Exploiture for New Drugs of Chinese Materia Medicine,Institute of Chinese Materia Medica,Chengde Medical College,Hebei Chengde 067000,China)

Two novel conjugates of oleanolic acid-nicotinic acid were synthesized by alkyl substitution,esterification,acylation and reduction reactions,etc.The results indicated that two derivatives exhibited some activities against glycogen phosphorylase.In addition,the esterification reaction at C-3 position of oleanolic acid benzyl ester was optimized during the experimental process.The structure of intermediates and target product were identified by IR,NMR and MS.

oleanolic acid; synthesis; nicotinic acid; glycogen phosphorylase

河北省教育廳資助項目(No.Y2012026)。

張麗穎(1981-)，女，副教授，主要從事藥物設(shè)計與合成研究。

R914.5

A

1001-9677(2016)011-0062-03