一種天然五環(huán)三萜化合物的合成及抑制活性研究*

王友德，張麗穎

(河北省中藥研究與開發(fā)重點實驗室，承德醫(yī)學院中藥研究所，河北　承德　067000)

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一種天然五環(huán)三萜化合物的合成及抑制活性研究*

王友德，張麗穎

(河北省中藥研究與開發(fā)重點實驗室，承德醫(yī)學院中藥研究所，河北承德067000)

以積雪草酸為原料首次利用化學方法對2α,23-二乙酰氧基積雪草酸進行了化學合成研究，所有化合物均經IR、1H-NMR、13C-NMR和MS測試確認結構。對所有化合物的糖原磷酸化酶抑制活性的研究結果表明，所合成的衍生物顯示出了一定的糖原磷酸化酶抑制活性,其中積雪草酸芐酯5(IC50=3.81μM)的糖原磷酸化酶抑制活性優(yōu)于其先導化合物積雪草酸(IC50=17μM)。

五環(huán)三萜；2α,23-二乙酰氧基積雪草酸；糖原磷酸化酶

乙酰五環(huán)三萜是天然五環(huán)三萜化合物中的一類重要化合物，存在于多種植物中。大量研究表明，該類化合物具有廣泛的生物活性，如降血糖、降血脂、抗腫瘤、抗炎以及機體免疫調節(jié)等[1-4]。如3-O-乙酰基齊墩果酸 (1)是刺枝豆屬植物Eysenhardtia platycarpa樹干的主要活性成分，可以顯著降低鏈脲佐菌素誘導的糖尿病大鼠的血糖[5]。3-O-乙?；?16-羥基白樺酸(2)是古夷蘇木(Fagara tessmannii)中的重要成分，具有顯著的α-糖苷酶的抑制活性[6]。α-乙酰乳香酸(3)是中藥乳香的有效成分，對拓樸異構酶I和II有較強的抑制活性[7]。

1971年，Gupta A S等從龍腦香科植物樹干分泌的樹脂中分離得到的一個天然五環(huán)三萜化合物，2α,23-二乙酰氧基積雪草酸(4)，該化合物也是一個天然乙酰五環(huán)三萜化合物，其化學結構中具有兩個乙酰氧基的結構單元[8]。但是，由于該化合物在自然界中含量很少，只靠提取對其進行制備很難得到足夠的量對其進行相應的藥學研究。因此需要一種有效的合成方法對這類化合物的深入藥學研究提供原料保證。因此，我們以積雪草酸為原料，巧妙的利用轉酯化反應，對2α,23-二乙酰氧基積雪草酸進行了首次化學合成研究，具體合成路線見圖2，并對合成中所涉及到的所有化合物進行了初步的糖原磷酸化酶抑制活性研究。

圖1　天然乙酰五環(huán)三萜的化學結構

圖2　2α,23-二乙酰氧基積雪草酸的合成路線

1　儀器與材料

AVANCE-300MHz型核磁共振儀,德國Bruker；SHIMADZU FTIR-8400S傅里葉變換紅外光譜儀,德國Bruker；HP1100LC/MSD,美國PE；maXis impact-HRMS,德國Bruker；RY-1熔點儀,天津市分析儀器廠；酶標儀,美國BIO-RAD公司。試劑均為化學純或分析純試劑。

2　方法與結果

2.1化合物的合成與表征

2.1.12α,3β-二羥基-23-叔丁基二甲基硅氧基熊果烷-12-烯-28-羧酸芐酯(6)

將3β-羥基齊墩果烷-12-烯-28-羧酸-6-[4-(4-氨基苯甲?；?苯甲酰氧基]己基酯(0.49 g,0.85 mmol)溶于DMF(5mL)中，緩慢加入咪唑(0.13 g,1.91 mmol)，叔丁基二甲基氯硅烷(0.13 g,0.85 mmol)，室溫攪拌過夜，反應液傾入冰水(20mL)中、乙酸乙酯(30mL×3)萃取。然后依次以水和飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥后蒸去溶劑?？焖僦鶎游?石油醚/乙酸乙酯=8/1,V/V)，得淡黃色固體(0.13 g,22%)。IR (KBr,cm-1):3409,2924,1724,1454。1H-NMR (300 MHz):0.06 (6H,s),0.63 (3H,s),0.84 (6H,s),0.86 (3H,s),0.90 (6H,s),0.91,0.94,0.99,1.06 (each 3H,s),2.26(1H,d,J=11.3 Hz),3.31-3.40 (2H,m),3.59 (1H,d,J=9.4 Hz),3.70～3.78 (1H,m),4.97 (1H,dd,J=12.5,34.7 Hz),5.09 (1H,dd,J=12.5,34.7 Hz),5.24 (1H,t),7.29～7.37 (5H,m)。13C-NMR (75 MHz):177.2; 138.1; 136.4; 128.4; 128.1; 127.9; 125.6; 80.5; 71.3; 68.6; 66.0; 52.9; 49.1; 48.1; 47.5; 45.9; 42.2; 42.1; 39.5; 39.1; 38.8; 37.9; 36.6; 32.6; 30.7; 27.9; 25.8; 24.2; 23.4; 23.3; 21.1; 18.4; 17.1; 17.0; 12.9; -5.6; -5.7。ESI-MS:691.5[M-H]-。

2.1.22α,3β-二乙酰氧基-23-叔丁基二甲基硅氧基熊果烷-12-烯-28-羧酸芐酯(7)

將科羅索酸(0.10 g,0.14 mmol)溶于吡啶(5mL)，緩慢加入乙酸酐(0.03mL,0.31 mmol)，室溫攪拌過夜。減壓蒸去吡啶，殘留物以乙酸乙酯溶解后依次以1 N鹽酸、飽和碳酸氫鈉溶液和水洗滌，無水硫酸鈉干燥。除去干燥劑，母液蒸去溶劑后快速柱層析(石油醚/乙酸乙酯=8/1，V/V)得白色固體(0.08 g,74%)。m.p.159～161℃。IR (KBr,cm-1):2927,2857,1743,1250。1H-NMR (300 MHz):0.05 (6H,s),0.63,0.74 (each 3H,s),0.91 (15H,s),1.05 (9H,s),1.99,19.6 (each 3H,s),2.26(1H,d,J=11.5 Hz),2.98 (1H,dd,J=10.1 Hz),3.20 (1H,dd,J=10.2 Hz),4.97 (1H,dd,J=12.4,37.1 Hz),5.10 (1H,dd,J=12.4,37.1 Hz),5.13～5.15 (2H,m),5.22 (1H,t),7.29～7.35 (5H,m).13C-NMR (75 MHz):177.2; 171.0; 170.7; 170.1; 169.8; 138.4; 138.2; 136.4; 128.4; 128.4; 128.2; 128.1; 128.0; 125.4; 125.2; 77.7; 74.8; 70.6; 67.4; 66.0; 65.6; 64.2; 53.0; 52.9; 48.2; 48.1; 48.0; 47.5; 46.1; 43.9; 43.2; 42.2; 42.1; 41.8; 39.6; 39.4; 39.1; 38.8; 37.7; 37.6; 36.6; 32.6; 32.3; 30.7; 29.7; 27.9; 25.8; 25.7; 24.2; 23.4; 23.3; 22.7; 22.6; 21.2; 21.1; 20.9; 20.7; 18.0; 17.7; 17.2; 17.1; 17.0; 17.0; 16.9; 16.9; 14.1; 14.0; 14.0; -4.3; -4.8; -5.8; -5.9。ESI-MS:777.5[M+H]+。

2.1.32α,23-二乙酰氧基-3β-羥基熊果烷-12-烯-28-羧酸芐酯(8)

將2α,3β-二乙酰氧基-23-叔丁基二甲基硅氧基熊果烷-12-烯-28-羧酸芐酯(0.1 g,0.13 mmol)溶于四氫呋喃(2mL)中，冰浴下加入四丁基氟化胺(40 mg,0.15 mmol)，室溫攪拌反應過夜。反應液以乙酸乙酯稀釋后，飽和食鹽水洗滌，無水Na2SO4干燥。過濾，濃縮，快速柱層析 (石油醚/乙酸乙酯=1/1,V/V)，得白色固體(48 mg,56%)。m.p.198～200℃。IR(KBr,cm-1):2923,2870,1727,1240。1H-NMR(300 MHz):0.62 (3H,s),0.83 (3H,d,J=5.5 Hz),0.96,1.05,1.06 (each 3H,s),2.06,2.07 (each 3H,s),2.26(1H,d,J=11.4 Hz),3.49 (1H,d,J=10.0 Hz),3.92 (1H,dd,J=11.3,43.3 Hz),4.07 (1H,dd,J=11.3,43.3 Hz),4.92～5.06 (2H,m),5.10 (1H,d,J=12.5 Hz),5.22 (1H,t),7.28～7.37 (5H,m)。13C-NMR (75 MHz):177.2; 171.4; 170.9; 138.3; 128.4; 128.3; 128.0; 125.3; 74.7; 72.8; 66.1; 66.0; 53.0; 48.2; 47.8; 47.6; 43.7; 42.8; 42.1; 39.6; 39.1; 38.9; 38.0; 36.6; 32.6; 30.7; 27.9; 24.2; 23.5; 23.4; 21.3; 21.2; 20.9; 18.1; 17.0; 17.0; 13.1.ESI-MS:685.4[M+Na]+。

2.1.42α,23-二乙酰氧基-3β-羥基熊果烷-12-烯-28-羧酸 (2α,23-二乙酰氧基積雪草酸)(4)

將3β-棕櫚?；R墩果烷-12-烯-28-羧酸芐酯(0.30 g,0.45 mmol)溶于四氫呋喃(10mL)中，加入催化量的10%Pd/C，室溫常壓氫化24 h。常壓過濾除去Pd/C，濾液蒸干得到粘稠狀液體。柱層析(石油醚/乙酸乙酯=20:1,V/V)分離，得到白色固體(0.21 g,82%)。m.p.160～162℃。IR (KBr,cm-1):2924,2870,1729,1240。1H-NMR (300 MHz):0.77 (3H,s),0.83 (3H,d,J=4.9 Hz),0.95 (3H,s),1.08 (9H,s),2.07,2.08 (each 3H,s),2.19 (1H,d,J=11.2 Hz),3.49 (1H,d,J=10.1 Hz),3.93 (1H,d,J=11.4 Hz),4.09 (1H,d,J=11.4 Hz),5.00～5.06 (1H，m),5.24 (1H,t)。13C-NMR (75 MHz):182.9; 171.4; 170.9; 138.1; 125.4; 76.6; 72.7; 66.1; 52.6; 48.0; 47.7; 47.6; 43.7; 42.8; 42.0; 39.6; 39.1; 38.8; 38.0; 36.7; 32.6; 30.6; 29.7; 28.0; 24.1; 23.5; 23.4; 21.3; 21.2; 20.9; 18.1; 17.1; 16.9; 13.1。ESI-MS:595.5[M+Na]+。

2.2化合物對糖原磷酸化酶的抑制活性測試

參照文獻[9]方法，對本文合成的4個化合物，以咖啡因為陽性對照，進行了抑制兔肌肉糖原磷酸化酶(RMGPa)活性測試。操作流程如下：在微孔板中加入反應緩沖液，加入待測化合物及RMGPa，室溫溫孵20 min，加入顯色液(鉬酸銨和孔雀綠)，用BIORAD多功能酶標儀測定(檢測波長：655 nm)。

2.3糖原磷酸化酶抑制活性結果與討論

表1　4個新化合物對RMGPa的抑制活性

a每個結果都是三組實驗的平均值;bNI 為無抑制活性;c以咖啡因為陽性對照。

本文測定了4個新化合物對RMGPa的抑制活性，結果見表1。結果顯示：所合成的衍生物顯示出了一定的糖原磷酸化酶抑制活性，其中積雪草酸芐酯(5)(IC50=3.81μM)的抑制活性優(yōu)于其先導化合物積雪草酸(IC50=17μM)。遺憾的是，所合成的天然產物2α,23-二乙酰氧基積雪草酸(4)并未顯示出GP抑制活性，這點之前文獻報道的三乙酰氧基積雪草酸活性類似，提示3位羥基應為GP抑制活性必須基團。關于該天然產物的其他藥理活性正在進一步研究中。

3　結　論

以積雪草酸為母核，共合成3個新的未見文獻報道的積雪草酸衍生物，對實驗中涉及到的米而文芳基化反應條件進行了摸索及討論，使得反應副產物相對減少，提高了產率。對所合成的3個衍生物進行了糖原磷酸化酶抑制活性測試?；钚詼y試結果顯示3個化合物均顯示出一定的糖原磷酸化酶抑制活性。后續(xù)工作中，我們將繼續(xù)系統(tǒng)的開展不同取代基類別對酶抑制活性的構效關系研究。

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Synthesis and Evaluation of Natural Compounds of Pentacyclic Triterterpenes as Inhibitors of Glycogen Phosphorylase*

WANG You-de,ZHANG Li-ying

(Key Laboratory of Research and Exploiture for New Drugs of Chinese Materia Medicine,Institute of Chinese Materia Medica,Chengde Medical College,Hebei Chengde 067000,China)

For the first time,we did research into 2α,23-diacetoxy asiatic acid by chemical process from asiatic acid and all compounds were confirmed by IR,1H-NMR,13C-NMR and MS.They also have been tested biological inhibitory activity of all compounds by using glycogen phosphorylase.The research results indicated that asiatic acid benzyl ester 7 showed optimal inhibition with the IC50of 3.81μM.

Pentacyclic Triterterpenes; 2α,23-diacetoxy asiatic acid; Glycogen Phosphorylase

河北省教育廳資助項目(No.Y2012026)。

張麗穎(1981-)，女，副教授，主要從事藥物設計與合成研究。

R914.5

A

1001-9677(2016)011-0059-03