西蘭花種子中蘿卜硫素酶解浸提工藝研究

謝述瓊，何　珺, 舒　華

(1 貴州理工學(xué)院，貴州　貴陽　550025；2 貴州省生化工程中心，貴州　貴陽　550025;3 貴州城市職業(yè)學(xué)院，貴州　貴陽　550025)

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西蘭花種子中蘿卜硫素酶解浸提工藝研究

謝述瓊1，何珺2, 舒華3

(1 貴州理工學(xué)院，貴州貴陽550025；2 貴州省生化工程中心，貴州貴陽550025;3 貴州城市職業(yè)學(xué)院，貴州貴陽550025)

西蘭花中含有豐富的抗癌物質(zhì)，對大多數(shù)癌癥都有較強(qiáng)的作用。本文研究了從西蘭花種子中酶解浸提蘿卜硫素的工藝，確定其最佳的酶解浸提參數(shù)。通過單因素梯度實(shí)驗(yàn)研究，采用自身芥子苷酶酶解以及密封浸提方式提取西蘭花種子中蘿卜硫素，主要對酶解時(shí)間，酶解料液比，酶解pH，超聲浸提乙醇濃度，超聲浸提時(shí)間，超聲浸提次數(shù)幾種浸提參數(shù)進(jìn)行研究。結(jié)果表明: 西蘭花種子中蘿卜硫素酶解浸提最佳條件為：酶解時(shí)間為8 h以上，酶解料液比為1:2，酶解pH為7，超聲浸提溶劑為80%乙醇，超聲浸提時(shí)間為30 min，超聲浸提的次數(shù)為2次。西蘭花種子中蘿卜硫素的酶解浸提工藝參數(shù)達(dá)到最佳時(shí)，其提取率可以大大的提高。

西蘭花種子；蘿卜硫素；酶解浸提工藝

西蘭花中含有的豐富的抗癌物質(zhì)能夠減低腫瘤的形成，阻止致癌物質(zhì)的活動(dòng)[1]。英國科學(xué)家1997年初的一次抗癌蔬菜研究結(jié)果表明，西蘭花含有十分豐富的葡萄糖異硫代氰酸鹽類的輔助化合物[2]。美國約翰霍普金斯大學(xué)醫(yī)學(xué)院的Brassica Chemooprotection實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)西蘭花含有大量的異硫代氰酸鹽，并且這些異硫代氰酸鹽可激活人體自身的抗癌物質(zhì)Phase Two Enzymes[3]。西蘭花中硫代葡萄糖苷含量非常豐富，其中含量最高的是蘿卜硫素[4]。蘿卜硫素又稱萊菔子素，是活力最強(qiáng)的一類異硫氰酸鹽。它的抗癌作用已在大鼠的乳腺癌治療中得到證實(shí)[5],近5年來，國內(nèi)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)蔬菜中存在的一些化合物具有抗癌活性，尤其是富含胡蘿卜素的蔬菜，如：胡蘿卜、西蘭花、花椰菜和菠菜等[6-8]。

蘿卜硫素的高提取率對蘿卜硫素的進(jìn)一步研究具有重要的意義，本課題以西蘭花種子為原料，研究了蘿卜硫素酶解浸提工藝，初步探明蘿卜硫素的較優(yōu)酶解提取工藝參數(shù)，為蘿卜硫素的酶解浸提研究提供參考。

1　實(shí)　驗(yàn)

1.1儀器

分析型HPLC：Agilent Technology(1100series),US,C18高效液相色譜柱，大連依利特分析儀器有限公司；BSA124S電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；HH.SY21-Ni6電熱恒溫水浴鍋，北京長源實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；SG2200HE超聲波清洗器，上海冠特超聲儀器公司；FW80粉碎機(jī)，天津市泰斯特儀器有限公司；其他為一般常規(guī)儀器。

1.2樣品與試劑

樣品：西蘭花種子，購自上海市閔行區(qū)，采集于2011年3-5月。

試藥：蘿卜硫素對照品(S-4441；純度≥90%)，sigma公司；甲醇、乙醇、丙酮(AR)，天津科密歐化學(xué)試劑廠；純化水，貴州省生化工程中心制備。

1.3蘿卜硫素測定

1.3.1色譜條件

色譜柱: Hypersil C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流速：0.8 mL/min；檢測器：紫外檢測儀；波長：201 nm；靈敏度：0.04 AUFS；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣體積：10 μL；流動(dòng)相：甲醇-水(20:80)。

1.3.2對照品溶液制備

準(zhǔn)確稱取蘿卜硫素5 mg于25 mL量瓶中，加入甲醇超聲溶解,并定容至刻度，備用。

1.4蘿卜硫素含量測定公式

蘿卜硫素含量(mg/g)=0.2(mg/mL)×90%×A樣×

樣品體積(mL)/[A標(biāo)×樣品質(zhì)量(g)]

式中：A樣——樣品峰面積

A標(biāo)——標(biāo)樣峰面積

2　結(jié)果與討論

2.1酶解與不酶解對蘿卜硫素含量的影響

分別精密稱取1 g西蘭花種子6份，平行取樣3次，利用粉碎機(jī)粉碎成均勻粒度大小適中的粉末，置于試管中，酶解：用2 mL純化水溶液潤濕，分別置于35 ℃水浴酶解8 h，再加乙醇定容至10 mL，超聲提取30 min(2次)；不酶解：直接加乙醇10 mL超聲提取30 min(2次),微濾，所得濾液采用HPLC測定，按照1.4的公式計(jì)算浸提液中蘿卜硫素的含量。結(jié)果見表1。

表1　西蘭花種子酶解與不酶解條件下蘿卜硫素 含量結(jié)果(n=3)Table 1　Sulforaphane Content of broccoli seeds with enzyme and not- enzyme (n=3)

從表1可知，酶解對于蘿卜硫素的提取非常重要，在不酶解的情況下，蘿卜硫素的含量幾乎為0，所以蘿卜硫素的提取前必須先酶解，于是對其酶解條件進(jìn)行了以下的研究。

2.2酶解時(shí)間選擇

圖1　酶解時(shí)間對蘿卜硫素含量的影響Fig.1　The influence of sulforaphane content with enzymolysis time

分別精密稱取1 g西蘭花種子15份，平行取樣3次，粉碎機(jī)粉碎成均勻粒度大小適中的粉末，置于試管中，用2 mL 純化水溶液潤濕，分別置于35 ℃水浴酶解2、4、6、8、10、12 h，再加乙醇定容至10 mL，超聲0.5 h(10 min/次，分3次超聲)提取，微濾，所得濾液采用HPLC測定，按照1.4的公式計(jì)算浸提液中蘿卜硫素的含量。結(jié)果見圖1。

從圖1可知，隨著酶解時(shí)間的加長，蘿卜硫素的含量逐漸在增加，到酶解8 h時(shí)，蘿卜硫素的含量達(dá)到最大為6.682 mg/g，之后再增加酶解時(shí)間對蘿卜硫素的含量影響不大，因此，確定最佳浸提時(shí)間為8 h。

2.3酶解料液比選擇

分別精密稱取1g西蘭花種子15份，平行取樣3次，粉碎機(jī)粉碎成均勻粒度大小適中的粉末，置于試管中，分別用1，2，3，4，5 mL(料液比分別為1:1，1:2，1:3，1:4，1:5)的純化水，于35 ℃下水浴酶解8 h，再分別加4、8、12、16、20 mL乙醇使得乙醇濃度保持在80%，超聲0.5 h(10 min/次，分3次超聲)提取，微濾，所得濾液采用HPLC測定，按照1.4的公式計(jì)算浸提液中蘿卜硫素的含量。結(jié)果見圖2。

圖2　酶解料液比對蘿卜硫素含量的影響Fig.2　The influence of sulforaphane content with enzymolysis liquid ratio

從圖2可知，西蘭花種子中蘿卜硫素的含量在酶解料液比為1:1時(shí)最低，為1:2時(shí)最高，隨著料液比的增大，蘿卜硫素的含量略有降低，影響不明顯。綜合考慮成本，后續(xù)濃縮操作等，確定酶解時(shí)的最佳料液比為1:2。

2.4酶解液pH選擇

分別精密稱取1 g西蘭花種15份，平行取樣3次，粉碎機(jī)粉碎成均勻粒度大小適中的粉末，置于試管中，用2 mL pH依次為3，5，7，9，11的純化水溶解，于35 ℃水浴酶解8 h，再加乙醇定容至10 mL，超聲半個(gè)小時(shí)(10 min/次，分3次超聲)提取，微濾，所得濾液采用HPLC進(jìn)行測定，按照1.4的公式計(jì)算浸提液中蘿卜硫素的含量。結(jié)果見圖3。

圖3　酶解pH對蘿卜硫素含量的影響Fig.3　The influence of sulforaphane content with enzymolysis pH

從圖3可知，西蘭花種子中蘿卜硫素的含量在pH=7時(shí)最高。pH偏高或者偏低都會對西蘭花種子中蘿卜硫素的含量有明顯的影響，隨著pH的增大，蘿卜硫素含量在逐漸升高，至pH=7時(shí)達(dá)到最大，之后隨著pH的增大蘿卜硫素的含量反而降低，可能是因?yàn)樵谒峄蛘邏A性條件下影響酶的活性原因。因此，確定最佳酶解pH=7。

2.5超聲浸提乙醇濃度選擇

分別精密稱取1 g西蘭花種子15份，平行取樣3次，粉碎機(jī)粉碎成均勻粒度大小適中的粉末，置于試管中，分別加入10 mL(料液比1:10)20%，40%，60%，80%，100%的乙醇溶液，分別置于35 ℃水浴酶解8 h，再加乙醇定容至10 mL，超聲0.5 h(10 min/次，分3次超聲)提取，微濾，所得濾液采用HPLC測定，按照1.4的公式計(jì)算浸提液中蘿卜硫素的含量。結(jié)果見圖4。

圖4　浸提乙醇濃度對蘿卜硫素含量的影響Fig.4　The influence of sulforaphane content with Extraction ethanol concentration

從圖4可知，乙醇-水溶液浸提效果明顯好于水，在80%以下濃度時(shí)乙醇濃度對浸提率的影響呈線性上升，80%乙醇提時(shí)提取最好，但當(dāng)浸提溶劑醇濃度大于80%后蘿卜硫素浸提稍減小，可能是因?yàn)闇囟雀弋a(chǎn)生的影響。綜合成本和提取率考慮，確定最佳浸提乙醇濃度為80%。

2.6超聲浸提時(shí)間選擇

分別精密稱取1 g西蘭花種子15份，平行取樣3次，粉碎機(jī)粉碎成均勻粒度大小適中的粉末，置于試管中，用2 mL純化水溶液潤濕，分別置于35 ℃水浴酶解8 h，再加乙醇定容至10 mL，分別超聲10、20、30、40、50 min提取，微濾，所得濾液采用HPLC測定，按照1.4的公式計(jì)算浸提液中蘿卜硫素的含量。結(jié)果見圖5。

圖5　浸提時(shí)間對蘿卜硫素含量的影響Fig.5　The influence of sulforaphane content with Extraction time

從圖5可以看出，在30 min前蘿卜硫素含量隨時(shí)間升高而升高，而后隨時(shí)間的升高，蘿卜硫素含量有所降低。綜合考慮各方面因素，最佳浸提時(shí)間為30 min。

2.7超聲浸提次數(shù)選擇

精密稱取1 g西蘭花種子3份，平行取樣3次，利用粉碎機(jī)粉碎成均勻粒度大小適中的粉末，置于試管中，用2 mL純化水溶液潤濕，分別置于35 ℃水浴酶解8 h，再加乙醇定容至10 mL，超聲提取30 min，微濾，將濾渣繼續(xù)加10 mL 80%乙醇提取30 min,微濾，重復(fù)上述操作3次，分別將所得濾液采用HPLC測定，按照1.4的公式計(jì)算浸提液中蘿卜硫素的含量。結(jié)果見圖6。

圖6　浸提次數(shù)對蘿卜硫素含量的影響Fig.6　The influence of sulforaphane content with Extraction times

從圖6可以看出，第1、2次超聲浸提的蘿卜硫素含量較高，第3次開始含量很低了，考慮成本的需要，建議采取超聲提取2次。

3　結(jié)　論

(1)本實(shí)驗(yàn)通過單因素梯度實(shí)驗(yàn)研究西蘭花種子中蘿卜硫素的提取工藝參數(shù)，主要對蘿卜硫素提取時(shí)的是否酶解，酶解時(shí)間，酶解料液比，酶解液pH，超聲浸提乙醇濃度，超聲浸提時(shí)間、超聲浸提次數(shù)幾種酶解浸提參數(shù)進(jìn)行研究，結(jié)果表明，西蘭花種子中蘿卜硫素最佳酶解浸提條件為：蘿卜硫素的提取必須進(jìn)行酶解，酶解時(shí)間為8 h，此時(shí)蘿卜硫素的含量達(dá)到最大為6.682 mg/g，再增加酶解時(shí)間對蘿卜硫素的含量影響不大；酶解料液比為1:2，此時(shí)含量最高，隨著料液比的增大，蘿卜硫素的含量略有降低；酶解浸提pH為7，pH偏高或者偏低都會對西蘭花種子中蘿卜硫素的含量有明顯的影響；超聲浸提溶劑為80%乙醇最好；超聲浸提時(shí)間為30 min，在30 min 前蘿卜硫素含量隨時(shí)間升高而升高，而后隨時(shí)間的升高含量有所降低；超聲浸提的次數(shù)為2次。

(2)本實(shí)驗(yàn)對西蘭花種子中蘿卜硫素的酶解及其超聲浸提參數(shù)進(jìn)行了篩選,但是因蘿卜硫素對溫度穩(wěn)定性不好,在浸提后的溶液貯存及其加工過程中一定要冷凍存放,且對超聲浸提溶劑選擇乙醇是因大生產(chǎn)中該溶劑相比丙酮更易采購,且在生產(chǎn)中比甲醇更無毒更安全，因此研究結(jié)果對提取西蘭花中子中蘿卜硫素提取提供參考,并為開發(fā)利用西蘭花種子中蘿卜硫素打下一定基礎(chǔ)。

(3)本實(shí)驗(yàn)最為重要的一點(diǎn)是西蘭花種子中蘿卜硫素的提取必須要先經(jīng)過酶解的過程，也有研究者添加其他酶讓其酶解，但是成本較高，經(jīng)過本實(shí)驗(yàn)的探索，其實(shí)其自身的酶足以讓其酶解，所以可以采取自身酶來酶解，以降低成本。

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Leaching Process Research of Sulforaphane with Broccoli Seeds

XIEShu-qiong1,HEJun2，SHUHua3

(1 Guizhou Normal College, Guizhou Guiyang 550025;2 Guizhou Institute of Technology, Guizhou Guiyang 550025;3 Zuizhou City Vocational College, Guizhou Guiyang 550025, China)

Broccoli contains abundant anti-cancer substances, for most cancer it has a stronger effect. This experiment studied Enzyme solution leaching process of sulforaphane in broccoli seeds, determining the optimum enzymic extraction parameters. Through the single factor gradient experiment research, using own mustard glucoside enzyme digestion and seal extraction method to extract sulforaphane in broccoli seeds, enzymatic hydrolysis time, solid-liquid ratio, acidity leaching, extraction of ethanol concentration, extraction time and ultrasonic extraction times were mainly studied. Results showed that the optimum leaching conditions were as follows: enzymolysis time of 8 h, solid-liquid ratio of 1:2, leaching pH of 7, extraction solvent of 80% ethanol, extraction time for 30 min,the number of ultrasonic extraction of 2 times. The extraction parameter of sulforaphane gets to the best, its extraction efficiency can be greatly improved.

broccoli seeds; sulforaphane; enzyme solution leaching process

謝述瓊，女，碩士，實(shí)驗(yàn)師。

何珺,女,副教授，碩士生導(dǎo)師。

O62

A

1001-9677(2016)08-0073-04