蓬子菜香葉木苷對大鼠細胞色素P450酶活性影響

崔明宇，王美薇，楊　柳，陳婷婷，孫　爽

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院 哈爾濱 150040)

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蓬子菜香葉木苷對大鼠細胞色素P450酶活性影響

崔明宇，王美薇，楊柳，陳婷婷，孫爽

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院 哈爾濱 150040)

考察香葉木苷對大鼠細胞色素P450酶活性的影響. SD大鼠12只，雌雄各半，隨機分為2組，分別為空白對照組與香葉木苷給藥組(300 mg/kg)，連續(xù)灌胃7 d，于給藥結(jié)束后次日制備肝微粒體，采用CO還原差示光譜法、紫外分光光度法測定大鼠細胞色素P450酶的質(zhì)量濃度.香葉木苷給藥組肝微粒體酶質(zhì)量濃度明顯高于空白對照組，組間差異P<0.05，差異顯著.香葉木苷對大鼠肝微粒體P450酶具有誘導(dǎo)作用.

蓬子菜；香葉木苷；細胞色素P450酶

蓬子菜為茜草科拉拉藤屬植物蓬子菜(Galium verum L.)的干燥全草，民間常作為活血化瘀藥使用.香葉木苷(diosmin)是從蓬子菜中分離得到的黃酮苷類化合物，是蓬子菜活血化瘀作用的主要活性成分.臨床用于肛門常見疾病、下肢慢性靜脈功能不全、手術(shù)后水腫、糖尿病并發(fā)癥、前列腺增生等疾病的治療[1].現(xiàn)代藥理研究表明，香葉木苷具有改善靜脈通透性、增加靜脈張力、改善微循環(huán)及誘導(dǎo)分化肝癌細胞的作用[2]，在靜脈系統(tǒng)疾病及抗腫瘤方面具有很好的開發(fā)價值及應(yīng)用前景.

藥物對代謝酶活性的影響，是新藥研究的重要組成部分，也是保證臨床合理用藥的關(guān)鍵.肝微粒體中細胞色素P450酶是藥物代謝中最重要的酶系，可參與多數(shù)內(nèi)源性物質(zhì)與外源性藥物的代謝，同時藥物對細胞色素P450活性的誘導(dǎo)或抑制作用也是藥物間相互作用的重要原因之一.本研究通過測定給藥后大鼠細胞色素P450酶質(zhì)量濃度的變化，探討香葉木苷對細胞色素P450酶活性的影響，以期為香葉木苷的新藥研究及臨床合理用藥提供參考，確保臨床聯(lián)合用藥的安全與有效.

1　實驗材料

1.1藥品與試劑

香葉木苷對照品(Sigma公司，質(zhì)量分數(shù)≥98%)，三羥甲基氨基甲烷(北京夏斯生物有限公司)，無水氯化鈣(天津光復(fù)精細化工研究所)，磷酸二氫鉀(天津市凱通化學(xué)試劑有限公司)，氫氧化鈉(天津市瑞金特化學(xué)品有限公司)，連二亞硫酸鈉(天津基準化學(xué)試劑有限公司)，甘油(天津基準化學(xué)試劑有限公司)，鹽酸(天津市巴斯夫化工有限公司)，BCA試劑盒(碧云天生物技術(shù)公司)，CO(哈爾濱春林氣體廠).

1.2實驗儀器

低溫高速離心機(BeckMan coulter，Allegra64R)，組織勻漿機(Sigma公司IKA，T10)，酶標儀(SpectraMax Plus384)，紫外分光光度計(ShimadzuUV-260).

1.3實驗動物

SD大鼠(200±20)g，雌雄各半，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，合格證：黑動字第P00101006.

2　方法與結(jié)果

2.1溶液的配制

2.1.1磷酸鹽緩沖液(pH7.4)

取磷酸二氫鉀 1.36 g加 0.1 mol/L 氫氧化鈉溶液79 mL，用水稀釋至200 mL，即得.

2.1.2氯化鈣溶液(88 mmol/L)

精密稱取無水CaCl24.88 g，加入蒸餾水至500 mL定容.

2.1.3100 mmolTris-HCl緩沖液

0.2 mol/LTris溶液250 mL加入0.2 mol/L HCl10 mL 再加5.59 gKCl粉末加水至500 mL定容.

2.2分組及給藥

取SD大鼠隨機分為2組，分別為空白對照組及香葉木苷給藥組，于實驗室適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，香葉木苷給藥組每天灌胃給予香葉木苷(300 mg/kg)，空白對照組灌胃給予等劑量的CMC-Na溶液，連續(xù)灌胃給藥7 d，最后一次給藥后禁食12 h.

2.3大鼠肝微粒體的制備

將連續(xù)給藥7 d并禁食12 h后的大鼠斷頭處死，迅速剖開大鼠腹部，進行肝門靜脈插管，以預(yù)冷的生理鹽水灌流肝臟，清除肝中淤血直至變?yōu)橄烖S色為止，取出肝臟，置冰浴冷卻的生理鹽水中，除去肝臟表面血漬，并以濾紙吸干水分.將洗凈的肝臟以Tris-HCl緩沖液反復(fù)清洗后，將大鼠肝組織剪成碎片，以4倍肝組織重量的Tris-HCl緩沖液在冰浴中制成勻漿，將得到的勻漿液轉(zhuǎn)移至離心管中，于冷凍離心機中離心20 min后棄去沉淀(4 ℃，14 000 r/m)，取上清液，上清液即為線粒體后上清液(S9)[3-4].取線粒體后上清液以每毫升加入0.1倍體積氯化鈣溶液 (88 mmol/L)的比例混合，置冰浴中5 min，期間輕輕振搖幾次，然后在4 ℃、27 000 r/m下離心20 min，去除上清液，剩余下層沉淀物再用Tris-HCl緩沖液混合，于27 000 r/m離心20 min(4 ℃)，得到的下層懸浮物即是大鼠肝微粒體懸液，-70 ℃低溫保存.

2.4肝微粒體總蛋白質(zhì)量濃度的測定

2.4.1血清蛋白標準曲線制備

取0.8 mL蛋白標準配制液加入蛋白標準(20 mg BSA)中，充分溶解后得到25 mg/mL的蛋白標準溶液.取適量25 mg/mL蛋白標準溶液，稀釋至終質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL.按50體積BCA試劑A加1體積BCA試劑B(50∶1)配制適量BCA工作液，充分混勻.將標準蛋白液用生理鹽水稀釋得一系列質(zhì)量濃度的標準蛋白儲備液，于562 nm處測吸光度，以吸光度對蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度進行線性回歸，制備牛血清白蛋白標準曲線.

2.4.2肝微粒體總蛋白質(zhì)量濃度的測定

將大鼠肝微粒體混懸液稀釋一定的倍數(shù)，取稀釋后的混懸液20 μL加200 μL BCA工作液混勻，室溫放置2 h后在562 nm處測定吸光度，根據(jù)標準曲線及稀釋倍數(shù)計算肝微粒體混懸液中總蛋白質(zhì)量濃度[4-5].

2.5肝微粒體CYP450酶質(zhì)量濃度的測定

利用Omura法測定肝微粒體CYP450酶質(zhì)量濃度，將已知蛋白質(zhì)量濃度的肝微粒體樣品以KCl-磷酸緩沖溶液稀釋至0.5 mg/mL，分別取2.0 mL置于樣品池和參比池，在400～500 nm全波段掃描；另取少量連二亞硫酸鈉，輕微攪拌，2 min后等分到樣品池和參比池中，緩慢向樣品池中通入CO 1 min，室溫下放置3 min后放入檢測區(qū)域，測定450、490 nm處的吸光度值(n=6).

3　實驗結(jié)果

3.1牛血清蛋白標準曲線

以蛋白質(zhì)量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線，得線性回歸方程為：A= 0.688 9C+ 0.110 1(R2= 0.996 6)，結(jié)果表明牛血清白蛋白在 0～0.5 mg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，符合大鼠肝微粒體質(zhì)量濃度測定的要求.

3.2肝微粒體CYP450酶質(zhì)量濃度測定結(jié)果

酶質(zhì)量濃度測量正常對照組平均為0.193±0.00 6，香葉木苷給藥組平均為0.324 7±0.062 4，組間差異檢驗P=0.023<0.05，差異顯著，說明香葉木苷給藥組酶質(zhì)量濃度高于正常對照組.

表1香葉木苷給藥組、空白對照組P450酶質(zhì)量濃度與蛋白質(zhì)量濃度

測量指標正常對照組(n=6)香葉木苷給藥組(n=6)PP4500.193±0.00760.3247±0.06240.023*蛋白質(zhì)量濃度2.8696±0.12612.1255±0.47280.047

注：*P<0.05

圖1　香葉木苷給藥組和正常對照組P450酶質(zhì)量濃度差異

4　討　論

細胞色素P450是肝微粒體中最重要的混合功

能氧化酶，可參與激素、脂肪酸等內(nèi)源性物質(zhì)及藥物、前致癌物、前毒物等外源性物質(zhì)的代謝過程，其催化活性取決于酶的質(zhì)量濃度水平，故可從酶質(zhì)量濃度的變化推斷酶活性被誘導(dǎo)或抑制.本研究初步考察了香葉木苷對大鼠肝微粒體CYP 450 酶系的影響，通過觀察連續(xù)給藥七天后，香葉木苷給藥組和空白對照組酶質(zhì)量濃度的變化，判斷香葉木苷對P450酶活性的影響.結(jié)果表明，香葉木苷給藥組可明顯提高大鼠肝微粒體總CYP450酶的質(zhì)量濃度，說明香葉木苷對大鼠肝微粒體CYP450酶活性有誘導(dǎo)作用，同時對臨床聯(lián)合用藥可能存在潛在的影響.在此實驗基礎(chǔ)上，可進一步采用cocktail法探討香葉木苷對CYP1A2、CYP3A4、CYP2A9等與藥物代謝密切相關(guān)酶的影響，對提高臨床聯(lián)合用藥水平及闡明在代謝環(huán)節(jié)上發(fā)生的藥物相互作用具有重要意義.

[1]陳偉蘭, 鐘惠青, 盧秋桃. 地奧司明的臨床研究進展[J]. 基層醫(yī)學(xué)論壇, 2012, 16(2): 515-516.

[2]馬英麗, 馬超. 香葉木苷在大鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)研究[J].中國中藥雜志, 2007, 32(5): 418-420.

[3]胡東華, 王宇光, 陳志武, 等. 復(fù)方丹參滴丸對大鼠肝細胞色素P450酶的影響[J]. 中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志, 2013, 7(4): 1340-1341.

[4]朱曼, 王睿, 張永青, 等. 大鼠肝微粒體細胞色素P450酶系檢測方法學(xué)研究[J]. 中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué), 2004, 9(5): 500-503.

[5]簡暾煜, 徐帆, 廖春龍, 等. 三種方法測定大鼠蛋白含量比較[J]. 中國藥師, 2011, 14(3): 342-344.

Effect of diosmin from Galium verum L. on activity of cytochrome P450 enzymes in rat liver microsomes

CUI Ming-yu, WANG Mei-wei, YANG Liu, CHEN Ting-ting, SUN Shuang

(School of Pharmacy, Heilongjiang University of Chinese Medicine, Harbin 150040, China)

To study the effect of diosmin on the activity in rat cytochrome P450 enzyme twelve SD rats were randomly divided into two groups, half male and half female. The blank control group and diosmin administration group (300 mg/kg) were administered by intragastric for seven days in a row. The extracts of the liver tissues of rats were in preparation of microsomes. The activity of total CYP450 was determined by the reduction of CO difference spectroscopy and spectrophotometer method. Results indicated that compared with blank control group, contents of CYP450 enzyme were increasing obeviously in diosmin group (P<0.05). Diosmin could induce the CYP450 enzyme in the liver tissues of rats.

Galium verum L; diosmin; cytochrome P450 enzymes

2015-09-02.

黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項目(12531625)；黑龍江省自然科學(xué)基金面上項目(H2015044);黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)研究生創(chuàng)新科研項目(2015)

崔明宇(1971-)，女，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：中藥活性成分及其藥物動力學(xué)研究.

R285

A

1672-0946(2016)04-0406-03