肉桂水煎液對肝微粒體細(xì)胞色素P450酶的影響

孟永海，王欣慰，史連宏，康天濟(jì)，陳忠新，李　冀，翟春梅

（1.黑龍江省中藥及天然藥物藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究重點實驗室，哈爾濱150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)北藥基礎(chǔ)與應(yīng)用研究省部共建教育部重點實驗室，哈爾濱150040；3.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，哈爾濱150040）

肉桂水煎液對肝微粒體細(xì)胞色素P450酶的影響

孟永海1，2，王欣慰1，2，史連宏1，2，康天濟(jì)1，陳忠新1，李冀3，翟春梅1，2

（1.黑龍江省中藥及天然藥物藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究重點實驗室，哈爾濱150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)北藥基礎(chǔ)與應(yīng)用研究省部共建教育部重點實驗室，哈爾濱150040；3.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，哈爾濱150040）

考察肉桂水煎液對肝微粒體細(xì)胞色素P450酶CYP1A2和CYP2E1活性的影響.采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）對大鼠肝臟細(xì)胞色素P450酶CYP1A2和CYP2E1進(jìn)行了初步研究.與空白對照組比較，肉桂水煎液對大鼠肝臟中的CYP1A2和CYP2E1含量有增加的趨勢.肉桂水煎液對大鼠肝微粒體CYP1A2和CYP2E1活性有誘導(dǎo)作用，臨床上當(dāng)與經(jīng)過CYP1A2和CYP2E1代謝的藥物合用時應(yīng)該注意藥物間的相互作用.

肉桂；抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法；CYP450酶；CYP1A2；CYP2E1

肉桂，為樟科植物肉桂（Cinnamomum cassia Presl）的干燥樹皮.多于秋季剝?nèi)?，陰?肉桂味辛、甘，性大熱，歸腎、脾、心、肝經(jīng).具有有補(bǔ)火助陽，引火歸元，散寒止痛，溫通經(jīng)脈的功效［1］.主治陽痿宮冷，腰膝冷痛，腎虛作喘，虛陽上浮，眩暈?zāi)砍啵母估渫?，虛寒吐瀉，寒疝腹痛，痛經(jīng)經(jīng)閉等癥.肉桂藥用歷史非常悠久，早在《太平惠民和劑局方》記載含有肉桂的“十全大補(bǔ)湯”、“人參養(yǎng)營湯”、“蘇子降氣湯”及“五積散”等經(jīng)典方劑.肉桂藥理作用很多，主要對消化系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)有抗菌、抗腫瘤及鎮(zhèn)痛等作用.也有報道稱，肉桂有調(diào)節(jié)血壓、抗氧化、解熱、驅(qū)蟲作用.在食品方面常用作香料、保鮮劑等［2］.過去肉桂多集中于中醫(yī)復(fù)方使用，然而現(xiàn)代臨床使用肉桂治療疾病時也經(jīng)常與化學(xué)藥品配合使用，肉桂中的成分與臨床西藥是否產(chǎn)生藥物的相互作用，是否產(chǎn)生毒副作用，目前研究較少，沒有明確的實驗依據(jù).人們公認(rèn)中藥中的化學(xué)成分對人體產(chǎn)生其作用與肝中細(xì)胞色素P450酶具有直接關(guān)系.因此，為了探討肉桂與人體的整體作用機(jī)制和特點，本實驗考察肉桂水煎液對肝微粒體細(xì)胞色素P450酶CYP1A2和CYP2E1活性的影響，為指導(dǎo)肉桂臨床合理用藥和減少毒副作用產(chǎn)生的可能性提供必要的實驗基礎(chǔ).

1　實驗材料

1.1實驗藥材

肉桂購自哈爾濱世一堂藥店，經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院王振月教授鑒定均符合《中國藥典》規(guī)定.

1.2實驗動物

雌性SD大鼠20只，體重（220±20）g，購自黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心，合格證號：SCXK 黑2013004.動物飼養(yǎng)過程中保持室內(nèi)溫度18～22℃，室內(nèi)晝夜自然明暗交替照明，飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)大鼠飼料.

1.3實驗儀器

離心機(jī)（MIKRO 220R，Hettich），-80℃冰箱（900 SERIES，Thermo），酶標(biāo)儀（VICTORTMX3，PerkinElmer）.雙蒸水（Milli-Q），移液槍（DRAGON MED），精密恒溫培養(yǎng)箱（BPH-9162型，上海一恒科技有限公司）.

2　材料與方法

2.1肉桂水煎液的制備

按臨床常用方法對藥物進(jìn)行處理.稱取定量的上述藥材，加入10倍量水，浸泡60 min，快速加熱至沸騰，煎煮60 min，傾出藥液，殘渣再加入8倍水，煎煮提取60 min.合并2次藥液，過濾，石膏濃縮至含生藥量為21.6 g/mL中藥水提液，4℃儲存?zhèn)溆?

2.2實驗動物分組及給藥

將大鼠隨機(jī)分為2組，空白對照組、肉桂水煎液組，大鼠適應(yīng)7 d后，每天分別按給藥容積為20 mL/kg體重灌胃給予含5%羧甲基纖維素鈉的肉桂水煎液.連續(xù)15 d，各組飼養(yǎng)過程中保持溫度、光照、濕度等環(huán)境條件均衡，自由進(jìn)食飲水.

2.3肝指數(shù)的測定

各給藥組大鼠連續(xù)給藥15 d后，大鼠末次給藥后開始禁食，12 h后處死，取出肝臟，稱量各組大鼠的體重及肝臟質(zhì)量，計算肝指數(shù)=大鼠肝臟質(zhì)量/大鼠體重×100%.

2.4肝臟微粒體的制備

肝臟微粒體的制備采用超速離心法制備，大鼠末次給藥后開始禁食，12 h后將大鼠斷頭處死，剖開腹部，將肝臟上的血液清洗干凈后取出肝臟，在用生理鹽水洗凈，將水分用濾紙吸干，切割標(biāo)本后，稱取重量.加入一定量的PBS（pH=7.4），用勻漿器將標(biāo)本勻漿充分.3 000 r/min離心30 min.取上清液，分裝后放入-80℃冰箱保存?zhèn)溆茫?-5］.

2.5雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）

ELISA雙抗體夾心法是將純化的抗體結(jié)合到固相載體上形成固相抗體，其能和待檢樣品中的相應(yīng)抗原結(jié)合形成免疫復(fù)合物，在徹底洗滌后加入酶標(biāo)記抗體，與免疫復(fù)合物中抗原結(jié)合形成酶標(biāo)抗體-抗原-固相抗體復(fù)合物，加底物顯色，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品，計算抗原的量.

1）標(biāo)準(zhǔn)品的制備：先取出酶標(biāo)包被板，設(shè)置5個孔，在第一孔中加100μL的標(biāo)準(zhǔn)品和50μL的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，充分混勻，然后從第一孔取100μL加到第二孔，加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μL，混勻；從第二個孔中取50μL棄掉，再取50μL加到第三個孔中，加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μL，混勻；混勻后從第三個孔中取50μL加到第四個孔中，加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μL，混勻后從第四孔中取50μL加到第五孔中，加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μL，混勻后從第五孔中各取50 μL棄掉.CYP1A2稀釋后各孔濃度分別為30、20、10、5pmol/L、2.5 pmol/L.CYP2E1稀釋后各孔濃度分別為30、20、10、5、2.5 u/L.

2）加樣：加樣時應(yīng)將所加物加在酶標(biāo)包被板上板孔的底部，避免加在孔壁上面，不可濺出和產(chǎn)生氣泡.設(shè)置空白孔，待測樣品孔.在待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μL，然后再加待測樣品10μL，輕輕晃動混勻.

3）溫育：用封板膜封板后置 恒溫37℃溫育30 min.

4）配液：濃縮洗滌液用蒸餾水稀釋.

5）洗滌：除掉封板膜，倒掉液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 s后倒掉液體，實驗重復(fù)5次，最后拍干.

6）加酶：處空白孔每孔加入50μL的酶標(biāo)試劑.

7）溫育：操作同3）.

8）洗滌：操作同5）.

9）顯色：加入50μL的顯色劑 A，然后加50 μL的顯色劑B，輕輕震蕩混勻，避光，37℃顯色15 min.

10）終止：每孔加終止液50μL，終止反應(yīng).

11）測定：酶標(biāo)儀使用前先預(yù)熱儀器30 min. 450 nm波長測量各孔的吸光度.測定時間應(yīng)在加終止液后15 min.

3　實驗結(jié)果

3.1肉桂水煎液對大鼠肝臟指數(shù)的影響

肉桂水煎液對大鼠肝臟指數(shù)結(jié)果表明（見表1）連續(xù)給藥15 d后，給藥組的臟器指數(shù)發(fā)生較為明顯的改變，表明長時間給予肉桂水煎液對大鼠肝臟指數(shù)改變不明顯.

表1　各組大鼠的肝臟指數(shù)（±S，n=8）

表1　各組大鼠的肝臟指數(shù)（±S，n=8）

注：同空白對照組比較*P＜0.05

/%空白對照組組別　劑量/（g·kg-1）　肝臟指數(shù)3.13±0.30肉桂組　21.6　2.26±0.60 -*

3.2肉桂水煎液對大鼠肝微粒體細(xì)胞色素CYP1A2量的影響

3.2.1CYP1A2酶標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定

以X軸（橫坐標(biāo)）表示CYP1A2的濃度，Y軸（縱坐標(biāo)）表示吸光值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.用Excel制作標(biāo)準(zhǔn)曲線.每個測定的樣本做3個平行反應(yīng)，結(jié)果見表2和圖1.

表2　CYP1A2標(biāo)準(zhǔn)品的吸光值

圖1　CYP1A2酶標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的吸光值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品CYP1A2的實際濃度.

3.2.2肉桂水煎液對大鼠肝微粒體CYP1A2酶的測定結(jié)果

如表3所示，肉桂水煎液對大鼠肝微粒體CYP1A2酶實驗結(jié)果顯示肉桂可明顯升高（P＜0. 05）CYP1A2酶的活性，表明實驗大鼠肝臟細(xì)胞微粒體中CYP1A2酶的活性受到長期給予的肉桂水煎液影響，這種影響是否是產(chǎn)生藥效或毒副作用的相關(guān)研究有待于進(jìn)一步探討.

表3　肉桂水煎液對大鼠的CYP1A2活性結(jié)果（±S，n=8）

表3　肉桂水煎液對大鼠的CYP1A2活性結(jié)果（±S，n=8）

注：同空白對照組比較*P＜0.05

組　別　劑量/（mg·kg-1）　CYP1A2活性/（pmol·L-1）對照組　—33.835±3.356肉桂組　21.6　40.256±2.351*

3.3肉桂水煎液對大鼠肝微粒體細(xì)胞色素CYP2E1量的影響

3.3.1CYP2E1酶標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定

以CYP2E1的濃度為X軸（橫坐標(biāo)），吸光值為Y軸（縱坐標(biāo)）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.用Excel制作標(biāo)準(zhǔn)曲線.每個測定的樣本做3個平行反應(yīng)，結(jié)果見表4和圖2.

表4　CYP2E1標(biāo)準(zhǔn)品的吸光值

圖2　CYP2E1酶標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的吸光值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品CYP2E1的實際濃度.

3.3.2肉桂水煎液對大鼠肝微粒體細(xì)胞色素CYP2E1的測定結(jié)果

如表5所示，肉桂水煎液對大鼠肝微粒體CYP2E1酶實驗結(jié)果顯示與對照組相比，肉桂組對（P＜0.05）CYP2E1酶的活性具有顯著性差異，從數(shù)據(jù)來看肉桂可明顯促進(jìn)大鼠肝微粒體CYP2E1酶的活性.表明長期給予肉桂水煎液對大鼠肝臟細(xì)胞微粒體中CYP2E1酶產(chǎn)生較大影響，但這種影響是否對其產(chǎn)生藥效或毒副作用的相關(guān)研究也有待于進(jìn)一步探討.

表5　各組大鼠的CYP2E1活性（±S，n=8）

表5　各組大鼠的CYP2E1活性（±S，n=8）

注：同空白對照組比較升高*P＜0.05

組　別　劑量/（mg·kg-1）　CYP1A2活性/（pmol·L-1）對照組　—38.510±2.152肉桂組　21.6　45.443±3.154*

4　討論

近年大量研究和臨床報道發(fā)現(xiàn)，藥物相互作用是臨床上產(chǎn)生嚴(yán)重不良反應(yīng)甚至死亡的主要原因之一.當(dāng)幾種藥物聯(lián)合應(yīng)用時，不同藥物之間相互作用而使藥效減弱或增強(qiáng)，甚至產(chǎn)生預(yù)想不到的不良反應(yīng)或毒副作用.目前人們公認(rèn)與藥物代謝相關(guān)的CYP450酶系（主要包括CYP1、CYP2、CYP3三個家族），其中CYP1A2、CYP3A、CYP2E1酶亞家族主存在肝臟中，占體內(nèi)CYP450酶總量的13%，其中5%-10%的常規(guī)藥物包括中藥成分主要經(jīng)CYP1A2的代謝，因此很多藥物的療效或毒性與CYP1A2酶的活性有關(guān)，因此，考察中藥對CYP450酶的影響對于闡明中藥的作用機(jī)理和探討其可能產(chǎn)生的毒副作用，具有重要的藥理學(xué)和毒理學(xué)意義［6-7］.CYP2E1酶在體內(nèi)負(fù)責(zé)很多化學(xué)物質(zhì)的代謝，大部分代謝為前毒物和前致癌物.一些藥物可誘導(dǎo)或抑制CYP2E1和CYP1A2的活性，當(dāng)與這些藥物合用時就會導(dǎo)致藥物間的相互作用［8-9］.

隨著科學(xué)技術(shù)和醫(yī)療事業(yè)的快速發(fā)展，在多數(shù)的研究中，特別是藥物治療學(xué)研究中，藥物間的相互作用逐漸引起人們的重視，人們普遍認(rèn)為，中藥藥性平和、安全，副作用少.然而，中藥中成分極為復(fù)雜，在臨床上由于中藥和西藥間的相互作用通常也會引起很多的不良反應(yīng).顯然，中藥與西藥、中藥和中藥聯(lián)合用藥可能產(chǎn)生藥物的相互作用，而各種成分主要通過肝臟代謝，藥物成分在體內(nèi)的代謝速度增強(qiáng)或減慢，使藥物的作用減弱或增強(qiáng).因此，藥物的基礎(chǔ)研究及臨床上應(yīng)給予足夠的重視［10-12］，肉桂在中藥和臨床中被廣泛應(yīng)用，本實驗以肉桂水煎液為研究對象，考察其對大鼠 CYP1A2和CYP2E1的作用，推測在聯(lián)合用藥中可能發(fā)生的藥物的相互作用.結(jié)果表明肉桂水煎液對大鼠肝微粒體中CYP1A2和CYP2E1的活性有誘導(dǎo)作用，本實驗為指導(dǎo)肉桂臨床合理用藥和減少毒副作用產(chǎn)生的可能性提供了必要的實驗基礎(chǔ).

［1］梁曉艷，郭占京，羅佩卓，等.肉桂的藥理作用研究概況［J］.現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2013，29（10）：1501-1503.

［2］劉亞靜，張仲.藥肉桂的藥理作用研究進(jìn)展［J］.現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2011，20（23）：2989-2990.

［3］林梅，奇錦峰，韓堅，等.三種茶飲料對小鼠腸道首過效應(yīng)及肝臟Cyp3a、Cyp2e1的影響［J］.中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2011，16（1）：5-11.

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［5］吳黎艷，陳芝蕓，嚴(yán)茂祥，等.三七對酒精性肝病大鼠肝組織CYP2E1表達(dá)的影響［J］.中華中醫(yī)藥雜志，2011，26 （6）：1395-1398.

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Influence of cinnamon decoction on cytochrome P450 CYP1A2 and CYP2E1

MENG Yong-hai1，2，WANG Xin-wei1，2，SHILian-hong1，2，KANG Tian-ji1，CHEN Zhong-xin1，LIJi3，ZHAIChun-mei1，2
（1.Key Laboratory of Chinese Materia Medica，Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin 150040，China；2.Ministry of Education，Heilongjiang Key Laboratory of TCM Pharmacodynamic Material Base，Harbin 150040，China；3.School of Basic Medicine，Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin 150040，China）

To study the influence of Cinnamon decoction on the activity of the livermicrosomal cytochrome P450 CYP1A2 and CYP2E1.A preliminary research was studied with double antibody sandwich enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）for cytochrome P450 CYP1A2 and CYP2E1.Compared with the blank control group，cinnamon decoction could increase the content of CY1A2 and CYP2E1 of rats showing an induced effect on activities of CY1A2 and CYP2E1.The attention should be paid to drug interactions when cinnamon decoction was used together with medicinemetabolized by CY1A2 and CYP2E1 clinically.

cinnamon；antibody sandwich enzyme-linked immunosorbentmethod；CYP450；CYP1A2；CYP2E1

R285

A

1672-0946（2016）02-0161-04

2015-04-10.

黑龍江省青年科學(xué)基金項目（QC2012C064）；黑龍江省自然科學(xué)基金面上項目（H201473）；黑龍江省教育廳科研課題（12531622）；黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)優(yōu)秀青年教師支持計劃項目（2012RCQ16）

孟永海（1978-），男，博士，研究方向：中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究

翟春梅（1978-），女，博士，高級實驗師，研究方向：中藥新藥及藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究.