古國(guó)槐葉片溶磷內(nèi)生真菌的篩選及其促生潛力初探

侯姣姣，布芳芳，余仲東，康永祥

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 林學(xué)院，陜西楊陵 712100)

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古國(guó)槐葉片溶磷內(nèi)生真菌的篩選及其促生潛力初探

侯姣姣，布芳芳，余仲東，康永祥*

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 林學(xué)院，陜西楊陵 712100)

該試驗(yàn)從周公廟古國(guó)槐葉片內(nèi)分離、篩選具有溶磷能力的內(nèi)生真菌，采用溶磷圈法和鉬銻抗比色法測(cè)定其溶解無(wú)機(jī)磷的能力，同時(shí)測(cè)定其回接后對(duì)國(guó)槐無(wú)菌苗葉綠素、可溶性蛋白質(zhì)、超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化物酶(POD)活性的影響，探究?jī)?nèi)生真菌的溶磷能力及其促生效應(yīng)。結(jié)果表明：(1)從古國(guó)槐葉片中分離出的55株內(nèi)生真菌中，28株具有溶磷能力，其中溶磷能力較強(qiáng)的活性菌株有12株:ZG-7為擬盤多毛孢(Pestalotiopsissp.)，ZG-9、ZG-23、ZG-32、ZG-36和ZG-53為鐮刀菌(Fusariumsp.)，ZG-15和ZG-34為曲霉(Aspergillussp.)，ZG-39和ZG-51為鏈格孢(Alternariasp.)，ZG-42為木霉(Trichodermasp.)，ZG-48為附球菌(Epicoccumsp.)。(2)曲霉屬真菌ZG-15和ZG-34的溶磷圈直徑(d)及其與菌落直徑(D)的比值d/D均高于其他菌株，對(duì)Ca3(PO4)2的溶解能力最強(qiáng)(1 238.28和941.22 mg·L-1)，并極顯著高于其他菌株(P<0.01)。(3)4株內(nèi)生真菌ZG-7、ZG-9、ZG-15和ZG-48回接至國(guó)槐無(wú)菌苗10 d后，可從苗根組織的皮層細(xì)胞中觀察到內(nèi)生菌絲，其中黑曲霉(Aspergillusniger)ZG-15可顯著提高國(guó)槐無(wú)菌苗的葉綠素含量、可溶性蛋白質(zhì)含量、SOD、POD活性(P<0.05)，從而維持幼苗的正常生長(zhǎng)和提高其抗逆能力，為該試驗(yàn)得到的促生潛力優(yōu)勢(shì)內(nèi)生真菌，可為古國(guó)槐的有效保護(hù)及林木溶磷生物菌肥的生產(chǎn)提供依據(jù)。

古國(guó)槐；內(nèi)生真菌；溶磷真菌；無(wú)菌苗；促生

磷是植物生長(zhǎng)過程中所必需的三大營(yíng)養(yǎng)元素之一，對(duì)促進(jìn)植物的生長(zhǎng)發(fā)育和新陳代謝有重要作用。自然條件下，絕大部分土壤全磷含量很高，可供植物吸收的有效磷含量卻很低，難以滿足植物生長(zhǎng)需要。已有研究表明，自然界中存在著一類溶磷微生物，廣泛存在于土壤、植物根際、磷礦區(qū)等生境中[1-3]，它們可以將土壤中難溶性磷轉(zhuǎn)化為植物能夠吸收利用的可溶性磷，從而促進(jìn)植物對(duì)磷素的吸收利用[4]。溶磷微生物種類繁多，包括真菌、細(xì)菌、放線菌等[5]，一般認(rèn)為溶磷真菌在遺傳穩(wěn)定性和溶磷效率方面明顯優(yōu)于溶磷細(xì)菌和放線菌[6-8]。目前，人們對(duì)植物根際土壤中的溶磷真菌進(jìn)行了溶磷效應(yīng)、溶磷機(jī)制及其應(yīng)用效果等方面的研究[9]，且主要集中在農(nóng)作物方面[10]，樹木溶磷真菌資源的研究也越來(lái)越多[11-12]，但關(guān)于樹木葉片內(nèi)生真菌的溶磷作用研究較少。內(nèi)生真菌不僅具有一定的溶磷作用[13]，也可與宿主植物長(zhǎng)期共存，分泌植物激素等，影響生理代謝，刺激植物生長(zhǎng)以及提高植物的環(huán)境適應(yīng)性[14-15]。

國(guó)槐(Sophorajaponica)，為豆科槐屬落葉大喬木，是防風(fēng)固沙、用材及經(jīng)濟(jì)林兼用的樹種，也是城鄉(xiāng)良好的遮蔭樹和行道樹種，對(duì)二氧化硫、氯氣等有毒氣體有較強(qiáng)的抗性。陜西省岐山縣周公廟內(nèi)古國(guó)槐不僅是重要的園林景觀，也是珍貴的自然遺產(chǎn)，對(duì)其進(jìn)行科學(xué)的保護(hù)非常重要。本試驗(yàn)從周公廟古國(guó)槐(1 700 a)葉片中分離、篩選出具有高效溶解無(wú)機(jī)磷能力的菌株，并研究其回接國(guó)槐無(wú)菌苗后的促生效應(yīng)，以期為古國(guó)槐的有效保護(hù)及溶磷菌肥的生產(chǎn)提供依據(jù)。

1　材料和方法

1.1材料

內(nèi)生真菌分離自陜西省岐山縣周公廟古國(guó)槐(1 700 a)的健康葉片，葉片于2014年10月采集后分裝于自封袋中，帶回實(shí)驗(yàn)室，4 ℃冰箱保存，并快速分離。供試培養(yǎng)基包括：PDA培養(yǎng)基[16](馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15 g，自來(lái)水1 000 mL，自然pH)；NBRIP培養(yǎng)基[17](葡萄糖10 g，Ca3(PO4)25 g，MgSO4·7H2O 0.25 g，MgCl2·6H2O 5 g，KCl 0.2 g，(NH4)2SO40.1 g，蒸餾水1 000 mL，瓊脂16 g，pH 6. 5～7. 5，液體培養(yǎng)基不加瓊脂)；MS培養(yǎng)基(MS粉4.74 g，蔗糖30 g，瓊脂7 g，pH 5.8～6.0，蒸餾水1 000 mL)。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1內(nèi)生真菌的分離純化將采集的健康古國(guó)槐葉片在自來(lái)水下沖洗干凈，轉(zhuǎn)移至超凈臺(tái)，進(jìn)行表面消毒滅菌(先用10%次氯酸鈉浸泡2 min，然后用無(wú)菌水漂洗3次，每次1 min)。將滅菌后的葉片接入PDA平板培養(yǎng)基上，置于26 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)7～12 d，根據(jù)菌落形態(tài)的差異進(jìn)行純化，直至得到單一菌落，4 ℃冰箱保存。

1.2.2溶磷內(nèi)生真菌的篩選將分離純化后的內(nèi)生真菌分別接種于NBRIP平板培養(yǎng)基上，26 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)7 d，測(cè)定菌落直徑(D)和溶磷圈直徑(d)，并計(jì)算比值(d/D)；將初篩得到的溶磷能力較強(qiáng)的菌株(d/D≥0.4)接種于PDA培養(yǎng)基，26 ℃擴(kuò)繁培養(yǎng)10 d；無(wú)菌操作取5個(gè)直徑5 mm的菌塊接種至盛有50 mL NBRIP液體培養(yǎng)基的錐形瓶中(錐形瓶規(guī)格：150 mL)，以接種無(wú)菌PDA培養(yǎng)基塊為對(duì)照(CK)，每個(gè)菌株設(shè)5個(gè)重復(fù)，恒溫振蕩儀振蕩培養(yǎng)(7 d，27 ℃，120 r·min-1)，過濾后采用鉬銻抗比色法測(cè)上清液有效磷含量[18]，用UV-1800紫外可見分光光度計(jì)在880 nm處比色并測(cè)定OD值，計(jì)算上清液有效磷含量和溶磷率[19]，來(lái)確定不同菌株對(duì)無(wú)機(jī)磷的溶解能力。

溶磷率(%)=[(接菌培養(yǎng)基中可溶性磷含量-接培養(yǎng)基的對(duì)照組中可溶性磷含量)/加入無(wú)機(jī)磷源的總磷量]×100%。

1.2.3溶磷內(nèi)生真菌的鑒定根據(jù)菌株的形態(tài)特征和培養(yǎng)特征，對(duì)分離到的內(nèi)生真菌進(jìn)行初步鑒定[20-21]。并對(duì)高效溶磷真菌菌株進(jìn)行分子鑒定：采用CTAB法提取所分離到內(nèi)生真菌的DNA，利用通用引物ITS1和ITS4對(duì)菌株目的基因片段進(jìn)行擴(kuò)增，PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工生物技術(shù)有限公司測(cè)序后，將測(cè)序所得結(jié)果通過Chromas軟件進(jìn)行校對(duì)，校對(duì)后的序列提交GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，并在NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中用Blast程序與數(shù)據(jù)庫(kù)中的所有序列進(jìn)行比較分析。

1.2.4國(guó)槐無(wú)菌苗的快速培育國(guó)槐種子采自陜西楊陵。選取顆粒飽滿均勻、具有光澤的種子，在超凈臺(tái)上用10%次氯酸鈉消毒5 min、無(wú)菌水清洗3次后，浸泡在100 mL、70 ℃無(wú)菌水中，并不斷攪動(dòng)至水溫降至室溫，然后用解剖刀小心剝?nèi)シN皮，保留完整的子葉與胚，無(wú)菌水潤(rùn)洗3次后，接入盛有MS固體培養(yǎng)基的組培瓶中，每瓶1顆，于光照度1 500 lx、光照時(shí)間12 h、溫度26 ℃的環(huán)境下培養(yǎng)。當(dāng)無(wú)菌苗生長(zhǎng)40 d左右，選擇長(zhǎng)勢(shì)良好、大小形態(tài)一致的無(wú)菌苗回接內(nèi)生真菌。

1.2.5溶磷內(nèi)生真菌在國(guó)槐無(wú)菌苗中的回接將待回接的每個(gè)菌株在PDA平板培養(yǎng)基上活化7 d后，取1個(gè)直徑5 mm的菌塊回接至無(wú)菌苗培養(yǎng)基上，設(shè)5個(gè)重復(fù)，以接入無(wú)菌PDA塊為對(duì)照(CK)，共培養(yǎng)10 d后，待菌落長(zhǎng)滿培養(yǎng)基，取上述回接內(nèi)生真菌的國(guó)槐苗根，制作徒手切片，通過棉藍(lán)染色法，在顯微鏡下觀察苗根組織的侵染結(jié)構(gòu)[22]。

1.2.6生理指標(biāo)測(cè)定國(guó)槐苗葉片由液氮迅速研磨后，-20 ℃保存?zhèn)溆?，葉綠素含量測(cè)定采用95%乙醇提取法[23]；制備粗酶液4 ℃保存，并進(jìn)行生理指標(biāo)測(cè)定[24-26]：可溶性蛋白質(zhì)含量測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)G-250法，超氧化物歧化酶(SOD)活性測(cè)定采用氮藍(lán)四唑(NBT)光還原法，過氧化物酶(POD)活性測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚法。

1.3數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用Microsoft Excel 2003和IBM SPSS Statistics 22軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析，LSD法進(jìn)行多重比較，判斷差異顯著性。

2　結(jié)果與分析

2.1古國(guó)槐葉片溶磷內(nèi)生真菌的初篩

溶磷圈是指在溶磷微生物的作用下，無(wú)機(jī)磷固體培養(yǎng)基中的難溶性磷酸鹽被溶解，而在菌落周圍形成的透明圈，溶磷圈直徑(d)和菌落直徑(D)比值越大，溶磷能力越強(qiáng)[10, 27]。本試驗(yàn)結(jié)果(表1)顯示，從供試古國(guó)槐葉片中共分離出55株內(nèi)生真菌，編號(hào)為ZG-1～ZG-55，在以磷酸鈣為唯一磷源的固體平板上，具有溶磷圈的溶磷真菌為28株，其中15株d/D≥0.5，3株d/D介于0.4～0.5之間，10株d/D<0.4；菌株ZG-34和ZG-15的溶磷圈直徑(d)分別為66和60 mm，溶磷圈直徑和菌落直徑的比值(d/D)分別為1.22和1.20，均高于其他菌株，初步判斷其溶磷能力強(qiáng)于其他菌株。

2.2古國(guó)槐葉片溶磷內(nèi)生真菌復(fù)篩及溶磷能力的比較

對(duì)可正常擴(kuò)繁的d/D≥0.4的12株溶磷真菌進(jìn)行NBRIP液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，測(cè)定發(fā)酵液中可溶性磷含量。結(jié)果表明(圖1)，12株溶磷內(nèi)生真菌對(duì)Ca3(PO4)2的溶解能力很強(qiáng)，NBRIP液體培養(yǎng)基上清液中有效磷含量高于對(duì)照，有效磷含量在113.61～1 238.28 mg·L-1之間，各菌株溶磷率為1.20%～23.69%。其中，菌株ZG-15的發(fā)酵液中有效磷含量高達(dá)1238.28 mg·L-1，溶磷率為23.69%；ZG-34的溶磷能力次之，發(fā)酵液中有效磷含量達(dá)到941.22 mg·L-1，溶磷率為17.75%；菌株ZG-15和ZG-34的溶磷能力均極顯著高于其他菌株和對(duì)照(CK)，并達(dá)到極顯著水平(P<0.01)。另外，菌株ZG-53、ZG-51、ZG-48、ZG-32、ZG-42、ZG-9和ZG-23的發(fā)酵液中有效磷含量雖極顯著低于菌株ZG-15和ZG-34，但極顯著高于對(duì)照(P<0.01)。

表1　溶磷內(nèi)生真菌的初篩結(jié)果(d/D≥0.4)

注：d.溶磷圈直徑；D.菌落直徑

Note:d. Diameter of phosphorus solubilizing circle;D. Colony diameter.

2.3古國(guó)槐葉片溶磷內(nèi)生真菌的初步鑒定

將溶磷內(nèi)生真菌的18S rDNA ITS區(qū)序列分別與GenBank中的菌株序列進(jìn)行相似性分析，并結(jié)合形態(tài)學(xué)對(duì)獲得的12株溶磷內(nèi)生真菌進(jìn)行初步鑒定，結(jié)果如下(表2)：ZG-7為擬盤多毛孢(Pestalotiopsissp.)；ZG-9、ZG-23、ZG-32、ZG-36、ZG-53為鐮刀菌(Fusariumsp.)；ZG-15、ZG-34為曲霉(Aspergillussp.)；ZG-39、 ZG-51為鏈格孢(Alternariasp.)；ZG-42為木霉(Trichodermasp.)；ZG-48為附球菌(Epicoccumsp.)。

不同字母表示差異極顯著(P<0.01)圖1　12株溶磷內(nèi)生真菌的溶磷效果Different letters mean significant difference among strains at 0.01 levelFig. 1　The phosphate-solubilizing effect of twelve endophytic fungi strains

2.4古國(guó)槐葉片溶磷內(nèi)生真菌在無(wú)菌苗中的定殖

挑選不同溶磷效果、不同屬的內(nèi)生真菌ZG-7(Pestalotiopsissp.)、ZG-9(Fusariumsp.)，ZG-15(Aspergillussp.)和ZG-48(Epicoccumsp.)，分別接入國(guó)槐無(wú)菌苗，10 d后菌落長(zhǎng)滿培養(yǎng)基表面，國(guó)槐苗生長(zhǎng)正常。接種內(nèi)生真菌的國(guó)槐苗根部橫切組織中可觀察到內(nèi)生真菌菌絲(圖2)，其主要侵染部位為皮層細(xì)胞，在中柱鞘細(xì)胞和凱氏帶細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)有不同程度的侵染，表明接種的內(nèi)生真菌和國(guó)槐無(wú)菌苗根系建立了良好的共生關(guān)系。

2.5溶磷內(nèi)生真菌對(duì)國(guó)槐無(wú)菌苗生理特征的影響

2.5.1葉綠素含量葉綠素(Chl)是植物光合作用最主要的色素，且其含量與葉色呈正相關(guān)，能大致反映出植物的營(yíng)養(yǎng)狀況，影響植物的光合速率[28]。4株溶磷內(nèi)生真菌對(duì)國(guó)槐無(wú)菌苗葉綠素含量的影響差異明顯(表3)：菌株ZG-15處理的國(guó)槐幼苗Chl a、Chl b、Chl (a+b)含量均高于其他菌株處理，且分別比CK增加35.8%、23.8%和10.0%，差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)；菌株ZG-7處理次之，除了Chl b與CK差異不顯著外，其Chl a和Chl (a+b)均顯著高于CK(P<0.05)；菌株ZG-9和ZG-48處理的葉綠素含量與CK無(wú)顯著差異。另外，從Chl a/b比值來(lái)看，僅接種菌株ZG-9的國(guó)槐幼苗Chl a/b比值顯著高于CK(P<0.05)，接種其他菌株對(duì)Chl a/b比值的作用效果不明顯。本試驗(yàn)中溶磷內(nèi)生真菌菌株ZG-7和ZG-15可能通過提高國(guó)槐無(wú)菌苗的葉綠素含量來(lái)增強(qiáng)其光合作用。

2.5.2可溶性蛋白質(zhì)含量可溶性蛋白質(zhì)是植物體內(nèi)多種參與調(diào)節(jié)代謝的酶組成成分，直接影響植物體的呼吸作用分解糖類供能、構(gòu)成細(xì)胞、催化各種化學(xué)反應(yīng)等，具有重要的生理作用[29]。4株內(nèi)生真菌對(duì)國(guó)槐無(wú)菌苗可溶性蛋白質(zhì)含量影響不同(表3)。其中，接種菌株ZG-15和ZG-48的國(guó)槐幼苗可溶性蛋白質(zhì)含量顯著高于CK(P< 0.05)，且分別比對(duì)照增加了13.72%和28.16%；而接種菌株ZG-7和ZG-9的國(guó)槐幼苗可溶性蛋白質(zhì)含量與CK相比無(wú)明顯變化，說(shuō)明接種菌株ZG-15和ZG-48可有效提高國(guó)槐無(wú)菌苗的可溶性蛋白質(zhì)含量，促進(jìn)無(wú)菌苗的正常生理代謝。

表2　12株溶磷內(nèi)生真菌的初步鑒定

圖2　溶磷內(nèi)生真菌菌絲體(箭頭所指)在國(guó)槐中的定殖A. ZG-7(Pestalotiopsis sp.); B. ZG-9(Fusarium sp.); C. ZG-15(Aspergillus sp.); D. ZG-48(Epicoccum sp.)Fig. 2　Colonization of mycelium of endophytic fungi in S. japonica

菌株StrainsNo.葉綠素含量及比值Chlorophyllcontentandtheirratio/(mg·g-1)ChlaChlbChl(a+b)Chla/b可溶性蛋白含量Solubleproteincontent/(mg·g-1)SOD活性SODactivity/(U·g-1·min-1)POD活性PODactivity/(U·g-1·min-1)CK2.32±0.10c1.22±0.07b3.54±0.17c1.90±0.03b6.01±0.39c275.87±27.69cd1050.62±123.82cZG-72.76±0.05b1.33±0.07ab4.09±0.12b2.09±0.08ab5.34±0.15c303.95±40.77bc1206.64±63.85cZG-92.56±0.05bc1.17±0.02b3.74±0.07bc2.19±0.02a5.93±0.31c231.13±34.77d1487.92±143.10abZG-153.15±0.10a1.51±0.05a4.66±0.15a2.09±0.05ab6.84±0.59b381.34±10.77a1430.60±36.76bZG-482.38±0.08c1.15±0.09b3.53±0.17c2.08±0.11ab7.71±0.25a341.03±25.92ab1693.39±160.41a

注：同列不同字母表示在0.05水平存在顯著性差異

Note: Different letters in the same column mean significant difference at 0.05 level

2.5.3SOD和POD活性 抗氧化酶SOD、POD可有效地控制植物體內(nèi)活性氧的積累，維持植物的正常生長(zhǎng)和抵抗逆境的能力[30]。接種不同溶磷內(nèi)生真菌對(duì)國(guó)槐幼苗SOD和POD活性影響程度不同，且同一種內(nèi)生真菌處理下SOD和POD活性的變化趨勢(shì)也有差異(表3)。其中，接種菌株ZG-7的國(guó)槐幼苗SOD、POD活性與對(duì)照相比均變化不明顯；接種菌株ZG-9的國(guó)槐幼苗SOD活性無(wú)明顯變化，其POD活性則顯著高于CK(P<0.05)；接種菌株ZG-15和ZG-48的國(guó)槐幼苗SOD、POD活性均顯著高于CK(P<0.05)，它們的SOD活性分別比對(duì)照提高38.23%和23.62%，POD活性分別比CK提高36.17%和61.18%。可見，在4個(gè)供試菌株中，ZG-15和ZG-48為可提高國(guó)槐無(wú)菌苗SOD和POD活性的高效菌。

2.6溶磷內(nèi)生真菌ZG-15的系統(tǒng)鑒定

從以上4個(gè)溶磷內(nèi)生真菌回接國(guó)槐無(wú)菌苗的綜合表現(xiàn)來(lái)看，菌株ZG-15表現(xiàn)最為突出，為本試驗(yàn)得到的促生潛力優(yōu)勢(shì)菌。ZG-15的 ITS rDNA 經(jīng)PCR擴(kuò)增后，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為514 bp，在GenBank中的序列登記號(hào)為KT192384.1，將菌株序列與模式菌株序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其與黑曲霉(Aspergillusniger)同源性達(dá)100%，采用MEGA6.0軟件構(gòu)建該菌的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(圖3)，結(jié)合該菌的形態(tài)特征與培養(yǎng)特性，鑒定菌株ZG-15為黑曲霉(Aspergillusniger)。

圖3　菌株ZG-15的ITS系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 3　Phylogenetic tree of strain ZG-15 and related trees based on ITS sequence

3　結(jié)論與討論

本研究利用溶磷圈法和鉬銻抗比色法對(duì)古國(guó)槐葉片內(nèi)生真菌溶磷特性進(jìn)行了測(cè)定，發(fā)現(xiàn)采用溶磷圈觀察法測(cè)定菌株的溶磷圈直徑(d)、溶磷圈直徑與菌落直徑比值(d/D)和溶磷量差別的變化趨勢(shì)相同，在菌株的初步篩選過程中，可將d、d/D值作為菌株溶磷能力初步篩選的定性判斷標(biāo)準(zhǔn)值，這與朱穎等[31]的研究結(jié)果表現(xiàn)一致。菌株能溶解的難溶磷源越多，則其溶磷特性越好[32]。本試驗(yàn)從古國(guó)槐葉片中分離出了具有溶磷作用的內(nèi)生真菌28株，其中溶磷能力較強(qiáng)的有12株，且曲霉屬內(nèi)生真菌(Aspergillussp.)在不同溶磷真菌中的溶磷活性最高，這與Narsian等[33]的研究結(jié)果一致。梁艷瓊等[34]從熱帶作物根際篩選到的黑曲霉PSFM溶解Ca3(PO4)2的能力為511.28 mg·L-1；史發(fā)超[35]從農(nóng)田土壤中篩選到的黑曲霉P43溶解Ca3(PO4)2的能力為818.71 mg·L-1，溶磷率為36.55%；劉文干等[36]從紅壤花生根際發(fā)現(xiàn)的黑曲霉B1-A溶解Ca3(PO4)2的能力為418.7 mg·L-1；魏偉等[11]從馬尾松根際篩選出的泡盛曲霉JP-NJ1溶解Ca3(PO4)2的能力為1 051.69 mg·L-1，溶磷率為19.3%。本試驗(yàn)得到的溶磷能力最強(qiáng)的是菌株ZG-15(Aspergillusniger)和ZG-34(Aspergillussp.)，對(duì)Ca3(PO4)2的溶解能力分別為1 238.28和941.22 mg·L-1，溶磷率分別為23.69%和17.75%，具有較強(qiáng)的溶磷優(yōu)勢(shì)。目前，大量報(bào)道認(rèn)為，溶磷真菌的溶磷作用與微生物產(chǎn)生有機(jī)酸有關(guān)，一方面有機(jī)酸可使土壤pH值局部降低，使難溶態(tài)磷酸鹽在酸性條件下溶解；另一方面，這些有機(jī)酸能與鋁、鐵、鈣、鎂等金屬離子結(jié)合，從而使磷酸根釋放出來(lái)，發(fā)揮溶磷作用[37]。本研究篩選的高效溶磷內(nèi)生真菌的溶磷機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

溶磷內(nèi)生真菌不僅具有溶磷特性，也可與宿主在長(zhǎng)期共處中形成互利共生關(guān)系，直接或誘導(dǎo)植物產(chǎn)生毒素或抗生素物質(zhì)而提高其抗病蟲害能力，也可通過影響宿主植物體內(nèi)的物質(zhì)代謝、產(chǎn)生生理活性的物質(zhì)(如生長(zhǎng)素、赤霉素以及其它活性物質(zhì))來(lái)促進(jìn)宿主植物的生長(zhǎng)，提高其對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性[38-39]。研究表明，分離自楊樹的球毛殼ND35菌株可侵染宿主，定殖在楊樹幼根，促進(jìn)生長(zhǎng)，并提高防御酶活性，增強(qiáng)植物抗逆性[40-41]。葉綠素(Chl)是植物光合作用最主要的色素，且其含量越高，越有利于植物的光合速率[28]；可溶性蛋白質(zhì)直接影響植物體的呼吸作用，并分解糖類供能、構(gòu)成細(xì)胞、催化各種化學(xué)反應(yīng)等[29]；而抗氧化酶SOD、POD可有效地控制植物體內(nèi)活性氧的積累，維持植物的正常生長(zhǎng)和提高抵抗逆境的能力[30]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，4株溶磷內(nèi)生真菌ZG-7、ZG-9、ZG-15和ZG-48回接至國(guó)槐無(wú)菌苗，均可侵染宿主根部組織，建立共生關(guān)系，并可影響宿主的葉綠素含量、可溶性蛋白質(zhì)含量、相關(guān)防御酶活性等。其中，菌株ZG-15(Aspergillusniger)可有效提高國(guó)槐無(wú)菌苗的葉綠素含量，增強(qiáng)光合作用，也可顯著提高國(guó)槐無(wú)菌苗體內(nèi)可溶性蛋白含量和SOD、POD活性，維持幼苗的正常生長(zhǎng)和適應(yīng)環(huán)境的能力，為本試驗(yàn)得到的促生潛力優(yōu)勢(shì)菌，可為古國(guó)槐的有效保護(hù)及溶磷菌肥的生產(chǎn)提供依據(jù), 值得進(jìn)一步研究。

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(編輯:裴阿衛(wèi))

Screening of Phosphate-Solubilizing Endophytic Fungi from AncientSophorajaponicaLeaves and Their Potential for Plant Growth-Promoting

HOU Jiaojiao, BU Fangfang, YU Zhongdong, KANG Yongxiang*

(College of Forestry, Northwest A&F University, Yangling,Shaanxi 712100, China)

To explore the phosphate-solubilizing ability of endophytic fungi and their plant growth-promoting potential, we evaluated the phosphate-solubilizing capability of endophytic fungi from ancientSophorajaponicaleaves in Zhougongmiao by the method of dissolved phosphorus cycle and molybdenum-bule, and detected the effects of inoculated sterile host plantlet on chlorophyll, soluble protein contents, SOD and POD activities. The results showed that, there were 28 out of 55 fungi strains from ancientS.japonicaleaves with phosphate-solubilizing capability, and twelve strains among twenty-eight endophytic fungi displayed strong capability of dissolving phosphate of Ca3(PO4)2by a test of phosphate-solubilizing capability, they werePestalotiopsissp.(ZG-7),Fusariumsp.(ZG-9, ZG-23, ZG-32, ZG-36 and ZG-53),Aspergillussp.(ZG-15 and ZG-34),Alternariasp.(ZG-39 and ZG-51),Trichodermasp.(ZG-42) andEpicoccumsp.(ZG-48). Two strains with strong phosphate-solubilizing capability were then picked up, ZG-15 and ZG-34, belonged toAspergillusspp..Their diameter of phosphorus solubilizing circle (d) andd/D(D, colony diameter) were both higher than that of others，and their solubilization of Ca3(PO4)2accounted for 1 238.28 mg·L-1and 941.22 mg·L-1, respectively, which were significantly higher than that of others and control (P<0.01). Four strains (ZG-7, ZG-9, ZG-15 and ZG-48) from different genera were inoculated into asepticS.japonicaseedlings bottle to ensure their contact upon with each other. Mycelium was observed infecting into the cortex cells and around the surface epidemical cells of root tissue; under the treatment byAspergillusnigerZG-15,S.japonicaseedlings’ chorophyll content, soluble protein content, SOD and POD net activities were all obviously higher than that of control (P<0.05), so, ZG-15 could maintain healthy seedling growth and improve seedling resilience, which showed a great potential for ancientS.japonicaprotection and a potential application as an organism-fertilizer for forest tree.

ancientSophorajaponica; endophytic fungi; phosphate-solubilizing fungi; aseptic seedling; growth promoting.

1000-4025(2016)07-1456-08

10.7606/j.issn.1000-4025.2016.07.1456

2016-03-14;修改稿收到日期:2016-06-20

國(guó)家林業(yè)公益性行業(yè)科研專項(xiàng)(201404302)；西北農(nóng)林科技大學(xué)校重點(diǎn)科研專項(xiàng)(Z109021310)

侯姣姣(1989-)，女，在讀碩士研究生，主要從事古樹名木保護(hù)相關(guān)研究。E-mail: 985755362@qq.com

康永祥，男，教授，博士，主要從事樹木學(xué)及古樹名木保護(hù)技術(shù)研究。E-mail: yxkang@nwsuaf.edu.cn

Q93-331; S718. 81

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