甘菊ClHSP70與ClHSP90基因的克隆及表達(dá)分析

羅　昌，陳東亮，程　曦，黃叢林

(北京市農(nóng)林科學(xué)院 北京農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心，北京100097)

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甘菊ClHSP70與ClHSP90基因的克隆及表達(dá)分析

羅昌，陳東亮，程曦，黃叢林*

(北京市農(nóng)林科學(xué)院 北京農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心，北京100097)

該研究以甘菊(Chrysanthemumlavandulifolium)為實(shí)驗(yàn)材料，通過RT-PCR方法從甘菊轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中分離出熱激蛋白合成相關(guān)基因，命名為ClHSP70和ClHSP90。序列分析表明，ClHSP70基因ORF全長(zhǎng)為2 559 bp，編碼852個(gè)氨基酸，蛋白功能區(qū)預(yù)測(cè)表明含有典型的HSP70蛋白NBD和SBD保守結(jié)構(gòu)域；ClHSP90基因ORF全長(zhǎng)為2 094 bp，編碼697個(gè)氨基酸，含有HATPase結(jié)構(gòu)域和HSP90保守結(jié)構(gòu)域。生物信息學(xué)分析表明，甘菊ClHSP70與大豆(Glycinemax)和煙草(Nicotianatomentosiformis)HSP70蛋白有較高的一致性，ClHSP90基因編碼的氨基酸序列與紫莖澤蘭(Ageratinaadenophora)HSP90高度相似；實(shí)時(shí)熒光定量表達(dá)分析表明，在42 ℃處理不同時(shí)間，甘菊葉片中ClHSP70和ClHSP90基因表達(dá)均在0.5 h時(shí)顯著增加，1 h達(dá)到最大值，2 h后緩慢下降；不同組織表達(dá)分析表明，甘菊在42 ℃處理1 h后，ClHSP70在成熟葉中的表達(dá)量顯著高于嫩葉和根等其他組織；ClHSP90在成熟莖中的表達(dá)量最高。研究說明，ClHSP70和ClHSP90基因具有熱激蛋白特征，參與了甘菊熱脅迫應(yīng)答過程，該研究結(jié)果為以后深入研究其基因功能奠定了基礎(chǔ)。

甘菊;ClHSP70;ClHSP90; 熱脅迫

熱激蛋白(heat shock protein, HSPs)是在熱激條件下被誘導(dǎo)且表達(dá)增加的一部分特異蛋白質(zhì)，在植物應(yīng)對(duì)外界環(huán)境壓力，如干旱、鹽、低溫及高溫等時(shí)起著重要的作用[1]。HSPs的積累與生物耐熱性呈正相關(guān)，也就是說，在熱脅迫下HSPs的積累可以提高植株的耐熱性。

HSPs種類存在范圍很廣，根據(jù)其分子量大小，可分為5類：HSP110、HSP90、HSP70、HSP60和‘小HSPs’[2]。在植物熱激蛋白家族中，HSP70最為保守和普遍，HSP70在氨基酸序列上高度相似，含有核酸結(jié)合區(qū)和底物結(jié)合區(qū)2個(gè)功能區(qū)，N-末端具有典型的約45 kD的ATPase區(qū)域。研究表明，HSP70在熱脅迫條件下能夠被顯著誘導(dǎo)，小球藻HSP70B含量在熱脅迫2 h后增加最明顯[3]，花生(ArachishypogaeaLinn.)AhHSP70在高溫脅迫3 h后表達(dá)明顯升高[4]。近年來在擬南芥[5]、煙草[1]、玉米[6]等研究中也證明了HSP70與植物耐熱性相關(guān)。HSP90是一個(gè)受ATP調(diào)節(jié)的二聚體分子伴侶，在分子進(jìn)化上高度保守，每個(gè)單體由ATPase結(jié)構(gòu)域、中間結(jié)構(gòu)域和介導(dǎo)HSP90二聚化的C端結(jié)構(gòu)域組成[7-8]。目前對(duì)于植物中HSP90蛋白的研究相對(duì)較少，擬南芥[9]和水稻[10]中的研究表明受到熱脅迫時(shí)HSP90表達(dá)量顯著增加，HSP90蛋白的積累量明顯提高，但其結(jié)構(gòu)和功能仍待進(jìn)一步探究。另外，有研究證實(shí)HSP90在植物生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)程中起著至關(guān)重要的作用，其功能的缺失會(huì)引起植物形態(tài)和生理特性發(fā)生改變[11-12]。此外，由于熱誘導(dǎo)和組成型表達(dá)的熱激蛋白可定位于細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和多種細(xì)胞器中，包括葉綠體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)[13-14]等，且執(zhí)行著不同的功能，也可在不同的器官中被誘導(dǎo)，可在根、莖、葉、種子以及幼苗中產(chǎn)生，因此高溫脅迫下植物HSPs基因的表達(dá)也呈現(xiàn)出明顯的組織特異性。

菊花(Chrysanthemum×morifoliumRamat.)是多年生草本植物，起源于中國(guó)，世界上均有廣泛栽培，在中國(guó)花卉生產(chǎn)中占有重要地位，周年生產(chǎn)鮮花是菊花生產(chǎn)的迫切需求。但是，周年生產(chǎn)過程中菊花在現(xiàn)蕾階段容易受到夏季高溫脅迫，導(dǎo)致花芽早熟或夭折。因此，了解菊花在受到熱脅迫時(shí)的耐熱機(jī)制對(duì)于培育適合周年生產(chǎn)的菊花品種很有必要。甘菊(Chrysanthemumlavandulifolium) 為菊科菊屬二倍體野生種(2n=2x=18)，是菊花原始種之一，生長(zhǎng)于海拔200～2 800 m平原及山坡，有較強(qiáng)抗逆性，其生長(zhǎng)季節(jié)和開花習(xí)性與栽培菊花相似[15-16]。本研究參照甘菊均一化轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)，利用RT-PCR技術(shù)，分離得到ClHSP70和ClHSP90的cDNA全長(zhǎng)序列，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分析了2個(gè)基因在高溫下不同處理時(shí)間和不同組織部位中的表達(dá)特性，為ClHSP70和ClHSP90基因的功能鑒定以及菊花耐熱育種奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1植物材料及處理

從北京農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心組培室中選取15株生長(zhǎng)水平一致的甘菊組培苗為實(shí)驗(yàn)材料。將光照培養(yǎng)箱溫度設(shè)置為42 ℃，每3株作為一個(gè)重復(fù)，分別處理0、0.5、1、2和4 h時(shí)選取上部新鮮葉片置于液氮中冷凍，并放入-80 ℃冰箱中備用；42 ℃處理1 h, 選取植株嫩葉、成熟葉、嫩莖、成熟莖、根置于液氮中冷凍，并放入-80 ℃冰箱中備用。

1.2方法

1.2.1總RNA提取及甘菊ClHSP70和ClHSP90基因克隆用植物RNA小量提取試劑盒(MiniBEST Plant RNA Extraction Kit，TaKaRa公司)提取甘菊葉片總RNA，再用PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa公司)將所提取RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA并檢測(cè)其濃度。

從甘菊均一化轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中篩選ClHSP70和ClHSP90基因序列信息，根據(jù)在NCBI網(wǎng)站上預(yù)測(cè)2個(gè)基因的ORF設(shè)計(jì)引物(表1)。PCR反應(yīng)體系(50 μL)：2 μL cDNA模板(100 mmol/L)，0.5 μL PrimeSTAR HS DNA Polymerase (2.5 U/μL)，10 μL 5×PrimeSTAR Buffer (Mg2+plus)，4 μL dNTP Mixture (各2.5 mmol/L)，正反向引物各2 μL 以及29.5 μL ddH2O。PCR擴(kuò)增條件為98 ℃預(yù)變性5 min；98 ℃變性10 s，58 ℃復(fù)性5 s，72 ℃延伸15 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸6 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，回收純化目的片段后連接到pGEM-T Easy載體上，42 ℃熱激轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行Amp抗性篩選和X-gal/IPTG藍(lán)白斑篩選。挑取白色菌落進(jìn)行PCR檢測(cè)，陽(yáng)性克隆送往上海生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。用Segman序列拼接軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接，分別獲得ClHSP70和ClHSP90的ORF全長(zhǎng)序列。

表1　本實(shí)驗(yàn)相關(guān)引物

1.2.2ClHSP70和ClHSP90基因的生物信息學(xué)分析利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中Blast工具對(duì)ClHSP70和ClHSP90基因序列進(jìn)行比對(duì)和同源性分析(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)；運(yùn)用Finder軟件(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/g orf.html)進(jìn)行開放閱讀框分析；在NCBI Conserved Domain Database (http://www.ncbi.nlm. nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)中進(jìn)行蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)；通過ExPASy-ProtParam軟件(http://web.expasy.org/protparam)預(yù)測(cè)蛋白的分子量及等電點(diǎn)；SMART在線軟件對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析預(yù)測(cè)。利用SignalP (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)在線分析蛋白質(zhì)的信號(hào)肽。使用Clustal X軟件進(jìn)行氨基酸序列多重比對(duì)[17]，利用MEGA5.0軟件構(gòu)建進(jìn)化樹(Neighbor- Joining)[18]，并進(jìn)行Boot-strap檢測(cè)。

1.2.3ClHSP70和ClHSP90基因表達(dá)分析用植物RNA小量提取試劑盒(MiniBEST Plant RNA Extraction Kit，TaKaRa公司)提取42 ℃不同時(shí)間(0、0.5、1、2、4 h)處理后的甘菊葉片RNA，已經(jīng)42 ℃處理1 h后不同組織部位(嫩葉、成熟葉、嫩莖、成熟莖、根)的RNA。用PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa公司)將所提取RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)ClHSP70和ClHSP90基因的全長(zhǎng)序列，用Premier 5.0設(shè)計(jì)Real-time PCR引物(表1)，采用Actin基因作為內(nèi)標(biāo)。參照熒光定量試劑盒SYBR?Premix EX TaqTMⅡ(TilRNaseH Plus，TaKaRa)說明書進(jìn)行操作：SYBR Premix EX Taq (2×) 10 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL，ROX Reference Dye (50×) 0.4 μL, cDNA模板 (100 mmol/L) 1 μL, ddH2O 7.8 μL,總體積20 μL。反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火1 min，40個(gè)循環(huán)后作熔解曲線。每個(gè)樣品均重復(fù)3次，在ABIStep-OnePlusTMReal-time PCR儀(美國(guó)ABI公司)上進(jìn)行，采用2-ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

2　結(jié)果與分析

2.1ClHSP70和ClHSP90基因克隆

根據(jù)甘菊轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)Unigene blastx注釋結(jié)果篩選HSP70和HSP90序列，在NCBI中進(jìn)行開放閱讀框分析并設(shè)計(jì)特異性引物，以甘菊葉片cDNA為模板擴(kuò)增到ClHSP70和ClHSP90編碼框序列，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，2個(gè)基因擴(kuò)增條帶長(zhǎng)度分別為2 500 bp和2000 bp左右(圖 1)，片段經(jīng)測(cè)序后正反向拼接得到基因的全長(zhǎng)。分析結(jié)果表明，ClHSP70含有1個(gè)2 559 bp開放閱讀框，編碼852個(gè)氨基酸(圖 2)；ClHSP90含有一個(gè)2 094 bp開放閱讀框，編碼697個(gè)氨基酸(圖 3)。

2.2ClHSP70和ClHSP90基因生物信息學(xué)分析

經(jīng)Protparatam在線工具(http://web.expasy.org/protparam/)分析，結(jié)果顯示(表 2)ClHSP70蛋白的總平均疏水性為-0.444, ClHSP90蛋白的總平均疏水性為-0.604，均為親水性蛋白；總的帶負(fù)電荷的氨基酸比重均略高于帶正電荷的氨基酸，表現(xiàn)為酸性蛋白；從穩(wěn)定系數(shù)推測(cè)ClHSP70為不穩(wěn)定蛋白，ClHSP90為穩(wěn)定蛋白。通過二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)ClHSP70含有40.73%的α-螺旋，5.87%的β-折疊和36.85%的隨機(jī)卷曲；ClHSP90則含有51.51%的α-螺旋、6.31%的β-折疊和24.82%的隨機(jī)卷曲。SignalP在線分析ClHSP70和ClHSP90均不含信號(hào)肽序列，也無跨膜結(jié)構(gòu)。

M. DL5000; 1. ClHSP70；2. ClHSP90圖1　甘菊ClHSP70和ClHSP90基因擴(kuò)增結(jié)果Fig. 1　PCR amplification results of ClHSP70 and ClHSP90 gene from C. lavandulifolium

下劃線部分為N端NBD結(jié)構(gòu)域(A)和N端保守的ATPase結(jié)構(gòu)域(B)；灰色陰影部分為高度保守的ClHSP90氨基酸序列(B)；黑色陰影部分為C-末端胞質(zhì)亞型特殊信號(hào)的基序(B)；*.表示終止密碼子圖2　甘菊ClHSP70 (A)和ClHSP90 (B)基因的核苷酸序列及其編碼的氨基酸序列Underline represents NBD domain of N-terminus domain(A)and the ATP binding domain of N-terminus domain (B); shaded gray represents highly conserved amino acid ClHSP90 signature sequence motifs characteristic (B); shaded black represents the C-terminus cytosolic isoform specific signature motif (MEEVD) (B); *. Stop codonFig. 2　The nucleotide and deduced amino acid sequences of ClHSP70 (A) and ClHSP90 (B) in C. lavandulifolium

NtHSP70-15.煙草 (XP009624163.1)；GmHSP70-14.大豆(XP 003546366.1)；AtHSP70. 擬南芥(NP 850984.4)；BoHSP70-14.甘藍(lán)(XP 013591718.1)圖3　甘菊ClHSP70與其他物種HSPs多序列比對(duì)NtHSP70-15.Nicotiana tomentosiformis (XP 009624163.1)；GmHSP70-14. Glycine max(XP 003546366.1)；AtHSP70. Arabidopsis thaliana (NP 850984.4)；BoHSP70-14. Brassica oleracea var.oleracea (XP 01591718.1).Fig. 3　Multiple alignment of ClHSP70 with HSPs from other plant species

蛋白性質(zhì)ProteincharacterClHSP70ClHSP90總氨基酸數(shù)目Numberofaminoacids/aa852697蛋白分子質(zhì)量Molecularweight/kD94.179.9理論等電點(diǎn)pI5.104.98蛋白分子式FormulaC4133H6584N1136O1302S34C3544H5649N917O1124S26總帶負(fù)電荷的殘基數(shù)Totalnumberofnegativelychargedresidues(Asp+Glu)135138總帶正電荷的殘基數(shù)Totalnumberofpositivelychargedresidues(Arg+Lys)103106脂肪族指數(shù)Aliphaticindex78.9182.50不穩(wěn)定系數(shù)Instabilityindex43.08,不穩(wěn)定Unstable37.55,穩(wěn)定Stable總平均疏水性Grandaverageofhydropathicity-0.444-0.604

氨基酸序列比對(duì)結(jié)果顯示，甘菊ClHSP70與大豆(Glycinemax)和煙草(Nicotianatomentosiformis) HSP70蛋白有較高的一致性，分別為78%和76%, 其次是與擬南芥(Arabidopsisthaliana)、甘藍(lán)(Brassicaoleraceavar.oleracea)同為74%(圖 3)；甘菊ClHSP90與紫莖澤蘭(Ageratinaadenophora)HSP90有顯著的一致性，高達(dá)93%，其次是與煙草為92%，與番茄(Solanumlycopersicum)、擬南芥一致性分別為91%和90%(圖 4)。說明ClHSP70和ClHSP90具有熱激蛋白家族高度保守的特征。保守域預(yù)測(cè)結(jié)果(圖 5)表明ClHSP70蛋白C端3～691aa為HSP70蛋白家族保守區(qū)域，782～818 aa為一段低復(fù)雜性區(qū)段(low-complexity region，LCR)。N端9～381aa是核酸結(jié)合區(qū)(nucleotide binding domain, NBD)(圖 2,A)，該結(jié)合區(qū)氨基酸序列高度保守，具有結(jié)合并水解ATP的活性中心，它與ATP的結(jié)合-水解過程調(diào)控著它對(duì)多肽的親和力，34～219aa為底物結(jié)合區(qū)(substrate binding domain, SBD)。

ClHSP90蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中含有N端高度保守的ATPase結(jié)構(gòu)域29～178aa(圖 5)，具有ATPase活性，ClHSP90蛋白質(zhì)184～697aa。另外，ClHSP90氨

NtHSP80-like.煙草 (XP 009594054.1)；AaHSP90.紫莖澤蘭 (ABX76302.1); SlHSP90-1.番茄 (NP 001234436.1)；AtHSP81-2.擬南芥 (NP 200414.1)圖4　甘菊ClHSP90與其他物種HSPs多序列比對(duì)NtHSP80-like. Nicotiana tomentosiformis (XP 009594054.1)；AaHSP90. Ageratina adenophora (ABX76302.1); SlHSP90-1. Solanum lycopersicum (NP 001234436.1)；AtHSP81-2. Arabidopsis thaliana (NP 200414.1)；GmHSP90-2. Glycine max (NP 001236599.1)Fig. 4　Multiple alignment of ClHSP90 with HSPs from other plant species

基酸序列中還包括HSP90家族5個(gè)特征標(biāo)記序列：NKEIFL RELISNSSDALDKIR、LGTIARSGT、MIGQFGVGF YSAYLVA、IKLYVRRVFI、GIVDSEDLPLNIS RE，C端末尾基序?yàn)镸EEVD，推測(cè)該蛋白為細(xì)胞質(zhì)熱激蛋白(圖 2,B)。

系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，ClHSP70基因與擬南芥AtHSP70 (NP-850984.4)、甘藍(lán)BoHSP70-14 (XP-013591718.1)的關(guān)系較近，處于同一分支(圖6，A)。ClHSP90與同為菊科的紫莖澤蘭的AaHSP90(ABX76302.1)關(guān)系最近，紫莖澤蘭HSP90已驗(yàn)證參與脅迫應(yīng)答，其次是煙草、番茄，與小麥、擬南芥、甘藍(lán)等的HSP90類基因關(guān)系較遠(yuǎn) (圖6,B)。

2.3ClHSP70和ClHSP90基因表達(dá)分析

實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析結(jié)果表明，甘菊在42 ℃不同時(shí)間處理?xiàng)l件下，葉片中ClHSP70和ClHSP90基因表達(dá)量均有顯著增加，其中ClHSP70和ClHSP90在處理0.5 h時(shí)表達(dá)量都開始明顯升高，分別為對(duì)照的5.8和5.1倍，1 h時(shí)表達(dá)量達(dá)到最高，分別為對(duì)照的12.2和9.7倍，2和4 h后ClHSP70和ClHSP90基因表達(dá)量有所下降(圖7)。說明ClHSP70和ClHSP90屬于熱誘導(dǎo)型表達(dá)的熱激蛋白，當(dāng)甘菊受到高溫脅迫時(shí)，在很短時(shí)間內(nèi)就能夠參與熱脅迫響應(yīng)進(jìn)行大量表達(dá)，增加植株體內(nèi)HSPs的積累，增強(qiáng)植株的耐熱性。

根據(jù)ClHSP70和ClHSP90高溫處理不同時(shí)間的表達(dá)情況，將甘菊植株42 ℃處理1 h, 分別取植株的嫩葉、成熟葉、嫩莖、成熟莖、根提取RNA，實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析結(jié)果表明，ClHSP70基因在成熟葉中的表達(dá)量顯著高于其他部位，其次是嫩葉、根、成熟莖、嫩莖。ClHSP90基因在成熟莖中的表達(dá)量顯著高于其他部位，嫩莖中表達(dá)最低，嫩葉、成熟葉、根之間的表達(dá)差異不明顯(圖7)。說明在高溫誘導(dǎo)下ClHSP70和ClHSP90的表達(dá)存在明顯的組織器官特異性，同時(shí)ClHSP70與ClHSP90之間表達(dá)水平最高的部位也不相同，推測(cè)上述2類熱激蛋白在植株中的定位和執(zhí)行功能有所不同。

圖5　甘菊ClHSP70和ClHSP90保守域分析結(jié)果Fig. 5　Prediction of conserver domain of ClHSP70 and ClHSP90 from C. lavandulifolium

節(jié)點(diǎn)數(shù)字表示Bootstrap驗(yàn)證中基于1 000次重復(fù)的可信度；括號(hào)內(nèi)編號(hào)為氨基酸登錄號(hào)圖6　熱激蛋白HSP70(A)和HSP90(B)基因編碼的氨基酸系統(tǒng)進(jìn)化樹Bootstrap values are shown at nodes based on 1 000 replications; The accession No. is given in bracketsFig. 6　Phylogenetic tree for HSP70 (A) and HSP90 (B) based on alignment of amino acid sequences from other species

不同小寫字母表示同一基因不同處理時(shí)間和在不同組織中的差異顯著，P<0.05圖7　甘菊葉片中ClHSP70和ClHSP90 42 ℃高溫處理不同時(shí)間和在不同組織中的表達(dá)Different letters represent significant difference among different treatment times and different tissues under 42 ℃ (P<0.05)Fig. 7　Relative expression level of ClHSP70 and ClHSP90 gene in different treatment times and different tissues under 42 ℃ high temperature stress.

3　討　論

高溫是植物生命活動(dòng)中常會(huì)遭遇的非生物逆境，熱激蛋白(HSPs)是細(xì)胞受到高溫環(huán)境或其他脅迫環(huán)境誘導(dǎo)時(shí)產(chǎn)生的一類功能型蛋白質(zhì)，可以作為分子伴侶參與細(xì)胞內(nèi)新合成蛋白質(zhì)的折疊、加工、轉(zhuǎn)運(yùn)以及蛋白質(zhì)變性后的復(fù)性[19]，增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)脅迫環(huán)境的忍耐力從而提高細(xì)胞的適應(yīng)能力[20]。菊花是中國(guó)十大名花，世界四大切花(菊花、月季、康乃馨、唐菖蒲)之一，產(chǎn)量居首，隨著國(guó)內(nèi)菊花市場(chǎng)規(guī)模的發(fā)展，其栽培面積在不斷擴(kuò)大，但夏季高溫影響了其產(chǎn)量和品質(zhì)。因此，研究熱激蛋白HSPs基因的結(jié)構(gòu)和功能，對(duì)于提高菊花耐熱性，培育耐高溫品種有長(zhǎng)遠(yuǎn)意義。

本研究利用甘菊均一化轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，從甘菊葉片中克隆得到ClHSP70和ClHSP90基因，本實(shí)驗(yàn)中保守區(qū)預(yù)測(cè)分析表明，ClHSP70含有典型的NBD結(jié)構(gòu)域和SBD結(jié)構(gòu)域，其在HSP70與ATP結(jié)合-水解和發(fā)揮分子伴侶功能時(shí)起著重要作用。據(jù)報(bào)道，HSP90多肽N端結(jié)構(gòu)域包含1個(gè)ATP結(jié)合區(qū)域，在HSP90執(zhí)行生物功能時(shí)起著重要作用，真核生物細(xì)胞質(zhì)HSP90的C端含有保守的MEEVD基序[21]，能夠與TPR(tetratricopeptide repeat)結(jié)構(gòu)域的蛋白識(shí)別并結(jié)合，從而使HSP90發(fā)揮不同的作用。本研究中ClHSP90 N端結(jié)構(gòu)域包含ATPase結(jié)合位點(diǎn)，C端含有MEEVD基序，與萵苣[22]、番茄[23]和擬南芥[24]中的研究一致，是細(xì)胞質(zhì)HSP90。氨基酸序列比對(duì)分析表明：ClHSP70與大豆和煙草HSP70蛋白有較高的同源性，ClHSP90與紫莖澤蘭、煙草、番茄等植物HSP90有著很高的同源性。從系統(tǒng)進(jìn)化樹可以得出，ClHSP70與擬南芥、甘藍(lán)HSP70聚成一類，ClHSP90與同屬于菊科植物的紫莖澤蘭聚為一組，并與煙草、番茄HSP90聚成一大分支。因此，ClHSP70和ClHSP90分別屬于植物HSP70基因家族和HSP90基因家族成員。

高溫脅迫下，熱激蛋白受到誘導(dǎo)且表達(dá)量明顯增加，同時(shí)在正常的環(huán)境下為維持細(xì)胞的正常運(yùn)轉(zhuǎn)HSP70和HSP90可以組成型表達(dá)。本研究中，ClHSP70和ClHSP90在25 ℃時(shí)均有表達(dá)，且表達(dá)相對(duì)穩(wěn)定。研究表明，多數(shù)HSPs在受高溫脅迫后短時(shí)間內(nèi)就能誘導(dǎo)合成，熱激處理3～5 min內(nèi)，HSPs mRNA的量增加，20 min時(shí)可檢測(cè)到新合成的HSPs, 隨著熱激時(shí)間的延長(zhǎng)，HSP的合成能夠持續(xù)數(shù)小時(shí)。本研究中，甘菊ClHSP70和ClHSP90在42 ℃處理時(shí)其合成主要在1 h內(nèi)完成并達(dá)到最高，2 h后開始下降，4 h急劇下降。這與擬南芥中HSP70家族[25]和萵苣LsHsp90[22]在受到熱激處理時(shí)的表達(dá)模式類似。隨著熱激時(shí)間增加相對(duì)表達(dá)量下降的原因可能是因?yàn)闊峒せ虻拈L(zhǎng)時(shí)間表達(dá)對(duì)生物體不利，植物適應(yīng)高溫環(huán)境后將其表達(dá)下調(diào)[26]。根據(jù)亞細(xì)胞定位，植物HSP70主要分為四大類，分別為位于細(xì)胞質(zhì)HSP70、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)HSP70、線粒體HSP70和葉綠體HSP70。HSP90主要定位于細(xì)胞質(zhì)，也有少部分存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體和葉綠體等亞細(xì)胞中。研究表明，HSPs在熱脅迫下的表達(dá)與其定位以及執(zhí)行的功能有一定關(guān)系，即高溫脅迫下植物HSPs基因的表達(dá)有明顯的組織器官特異性。本實(shí)驗(yàn)中，42 ℃熱脅迫1 h，ClHSP70和ClHSP90在植株各個(gè)部位均有表達(dá)，但表達(dá)量具有顯著差異性。其中ClHSP70在成熟葉中的表達(dá)量最高，與臘梅E-CpHSP70-1基因[27]、玉米熱激蛋白70[28]在各個(gè)組織器官中的表達(dá)分析一致，推測(cè)可能與其亞細(xì)胞定位主要分布在葉片中有關(guān)，相對(duì)于嫩葉和其他組織部位，成熟葉細(xì)胞中葉綠體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器含量更多。另外，當(dāng)植株受到高溫脅迫時(shí)，首先會(huì)引起葉片萎蔫、葉色失綠等表型特征，ClHSP70在成熟葉片中的高表達(dá)表明其在植物響應(yīng)高溫脅迫和緩解植物體受到的熱損傷過程中起重要作用。ClHSP90在成熟莖中的表達(dá)量最高，在葉片中表達(dá)量較低，與劉云飛等在番茄中的研究結(jié)果類似[23]，說明HSP90在植株受到熱脅迫后能在多個(gè)組織部位參與植物高溫脅迫的應(yīng)答。此外，HSP90除了參與高溫脅迫的應(yīng)答之外，其在植物生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)程中起著至關(guān)重要的作用，模式植物擬南芥[29-31]中的研究表明HSP90廣泛參與了植物的生長(zhǎng)發(fā)育過程。本實(shí)驗(yàn)中ClHSP90在成熟莖和嫩莖中的表達(dá)差異最為明顯，推測(cè)該基因可能參與莖尖分生組織相關(guān)調(diào)控活動(dòng)。甘菊熱激蛋白基因?qū)Ω邷孛{迫的表達(dá)模式研究為菊花耐熱性研究提供了分子基礎(chǔ)，并為利用基因工程提高菊花耐熱性和耐熱種質(zhì)資源創(chuàng)新與應(yīng)用提供理論依據(jù)。關(guān)于ClHSP70和ClHSP90在菊花中如何行使其功能我們今后將做進(jìn)一步研究。

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(編輯:宋亞珍)

Cloning and Expression ofClHSP70 andClHSP90 Gene fromChrysanthemumlavandulifolium

LUO Chang, CHEN Dongliang, CHENG Xi, HUANG Conglin*

(Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences, Beijing Agricultural Biotechnology Research Center, Beijing 100097, China)

Based onChrysanthemumlavandulifoliumRNA-seq data, we obtained two code DNA sequences namedClHSP70 andClHSP90 using RT-PCR. Sequence analysis showed the predicted open reading frame (ORF) ofClHSP70 is 2 559 bp, encoding a protein of 852 amino acids. The conserver domain search exhibited that N-teminar contains typical NBD domain which belongs to HSP70 family. The predicted ORF ofClHSP90 is 2 094 bp, encoding a protein of 697 amino acids. The conserver domain search showed that N-teminar contains ATPase-superfamily and HSP90 superfamily conservative structure. Bioinformatics showed that the amino acid sequences of ClHSP70 had high consistency withGlycinemaxandNicotianatomentosiformisHSP70, while ClHSP90 had high consistency withAgeratinaadenophoraHSP90. Real-time PCR demonstrated the expression patterns ofClHSP70 andClHSP90 in leaves at 42 ℃. The expression of these two genes were both significantly up-regulated after 0.5 h, reached the highest level after 1 h. Then the expression of both two genes decreased after 2 h, and remained at a relatively lower level after 4 h. In different plant tissues (root, stem, leaf) after 1 h at 42 ℃,ClHSP70 was highly expressed in mature leaves, lower in young, leaves, root, mature stems, young stems, andClHSP90 was the highest in mature stems. The results showed thatClHSP70 andClHSP90 participated the process of heat tolerance inChrysanthemumlavandulifoliumand laid a foundation for analyzingClHSP70 andClHSP90 gene function.

Chrysanthemumlavandulifolium;ClHSP70;ClHSP90; heat stress

1000-4025(2016)07-1321-10

10.7606/j.issn.1000-4025.2016.07.1321

2016-03-28;修改稿收到日期:2016-05-17

北京市農(nóng)林科學(xué)院科技創(chuàng)新能力建設(shè)專項(xiàng)(KJCX20140109)

羅昌(1982-)，男，碩士，助理研究員，主要從事菊花遺傳育種研究。E-mail: changluo1983@126.com.

黃叢林，研究員，主要從事菊花遺傳育種研究。E-mail: conglinh@126.com

Q785;Q786

A