NtMTP1基因過表達對增強煙草Zn脅迫耐受性的研究

冉　巧，吳嬋娟，高永峰，唐運來，黃才芝，劉繼愷*

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NtMTP1基因過表達對增強煙草Zn脅迫耐受性的研究

冉巧，吳嬋娟1, 2，高永峰1，唐運來1, 2，黃才芝1，劉繼愷1, 2*

(1 西南科技大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川綿陽 621010；2 西南科技大學(xué) 核廢物與環(huán)境安全國防重點實驗室，四川綿陽 621010)

該研究采用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)技術(shù)，對煙草金屬耐受蛋白1(MTP1)基因(NtMTP1)在煙草不同組織以及不同質(zhì)量濃度ZnSO4處理下的表達進行了分析；利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，將NtMTP1基因植物過表達載體pBI121-35S∶∶MTP1轉(zhuǎn)化野生型煙草，篩選得到NtMTP1基因過表達的轉(zhuǎn)基因煙草植株，并進行不同質(zhì)量濃度ZnSO4處理，檢測NtMTP1基因過表達對煙草Zn脅迫耐受性的影響。結(jié)果表明：NtMTP1基因在煙草中呈現(xiàn)組織特異性表達，主要在花與葉中表達；NtMTP1基因的表達受到Zn2+誘導(dǎo)，在400 μmol/L ZnSO4處理后，表達量達到最高，為對照組的3.81倍；3株轉(zhuǎn)基因煙草植株中NtMTP1基因表達量分別為野生型的10.42、7.61和11.84倍，與野生型相比，過表達植株對Zn脅迫的耐受性顯著增強。研究結(jié)果為闡明NtMTP1基因在煙草體內(nèi)Zn2+轉(zhuǎn)運過程中的生物學(xué)功能提供了重要依據(jù)。

煙草；金屬耐受蛋白1；鋅；耐受性

Zn是植物必需的微量營養(yǎng)元素之一，是植物細胞內(nèi)300多種酶與2 000多個轉(zhuǎn)錄因子的輔助因子，與植物生長素代謝、膜的完整性和生殖發(fā)育密切相關(guān)。但細胞內(nèi)Zn2+過量積累同樣會對植物產(chǎn)生毒害作用，比如，會引起植物膜脂過氧化作用，丙二醛含量上升，葉綠素含量降低等，從而破壞植物質(zhì)膜的完整性和光合系統(tǒng)[1-4]。為減少Zn2+等重金屬離子的毒害作用，生物體進化出一套以陽離子擴散促進因子(cation diffusion facilitator，CDF)蛋白家族為載體的跨膜轉(zhuǎn)運機制[5]?；趯偶毦?、真細菌和真核生物中具有代表性的CDF成員進行的系統(tǒng)進化和功能分析結(jié)果，人們將CDF家族分為底物特異的3個大組：Zn-CDF、Fe/Zn-CDF和Mn-CDF[6-7]。

植物CDF家族成員也稱為金屬耐受蛋白(metal tolerance protein，MTP)，能夠作用于Zn2+、Fe2+、Co2+等金屬離子的轉(zhuǎn)運，共分為7個小組[8-9]。在結(jié)構(gòu)上，第1小組MTP蛋白在跨膜區(qū)Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ、Ⅵ中含有極性帶電殘基，在Ⅳ和Ⅴ之間有一個富含組氨酸的胞質(zhì)環(huán)路，其被認為與轉(zhuǎn)運的特異性相關(guān)，可能作為細胞質(zhì)內(nèi)Zn2+水平的感應(yīng)器[10-12]。MTP1屬于第1小組，主要作用于Zn2+轉(zhuǎn)運，最早在擬南芥(Arabidopsisthaliana)中被發(fā)現(xiàn)，AtMTP1基因主要在幼嫩的葉片中表達，在酵母Zn敏感突變體Δzrc1cot1中異源表達AtMTP1會使突變體酵母表現(xiàn)出對過量Zn2+的耐受性[13]。目前，多種植物的MTP1基因已被克隆。在豆科模式植物蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)中補充Zn2+后，MtMTP1基因在根中的表達量降低，而在莖中的表達量升高，在葉中沒有明顯變化[14]。在重金屬富集植物東南景天(Sedumalfredii)與遏藍菜(Thlaspicaerulescens)中也分離出了MTP1基因，研究發(fā)現(xiàn)MTP1基因在這2種富集植物中存在多個拷貝，暗示MTP1蛋白在植物重金屬吸收和排毒過程中的重要作用[15]。水稻(Oryzasativa)OsMTP1基因是新近發(fā)現(xiàn)的MTP1基因，該基因位于水稻第5號染色體上，它主要在成熟的葉和莖中高度表達，其表達量還受到重金屬如Zn2+、Cd2+、Cu2+和Fe2+的誘導(dǎo)[16-17]。

煙草(Nicotianatabacum)是一種重要的經(jīng)濟作物，隨著環(huán)境的日益惡化，針對其抵抗逆境的能力，特別是對重金屬的耐受性的研究已成為研究人員關(guān)注的熱點。Shingu等從煙草中克隆到NtMTP1基因，該基因的異源表達能夠恢復(fù)酵母Zn敏感突變體Δzrc1對Zn的抗性，并發(fā)現(xiàn)NtMTP1蛋白定位于酵母的液泡膜上，這些結(jié)果暗示NtMTP1蛋白能夠?qū)n2+隔離在液泡中來減輕毒性[18]。但是，這些結(jié)果只揭示了NtMTP1基因在酵母中的功能，其在煙草體內(nèi)的生物學(xué)功能仍然未知。本研究進一步分析了NtMTP1基因的表達模式，同時構(gòu)建了NtMTP1基因過表達載體并將其轉(zhuǎn)化到野生型煙草植株中，通過后期實驗分析了NtMTP1過表達轉(zhuǎn)基因植株對Zn脅迫的耐受能力，為研究煙草對重金屬Zn2+的轉(zhuǎn)運和分布規(guī)律提供了重要的理論和實驗依據(jù)。

1　材料和方法

1.1材料

供試植物材料為煙草‘NC89’，實驗室常規(guī)種植。大腸桿菌菌株DH5α、根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)EHA105和植物表達載體pBI121均由本實驗室保存。

1.2方法

1.2.1總RNA提取和cDNA合成按照Trizol試劑(Invitrogen公司)說明書提取煙草總RNA，用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNAEraser 反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara公司)進行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2煙草NtMTP1基因的組織表達模式利用qRT-PCR方法分析煙草NtMTP1基因(GenBank登錄號AB20124)在不同組織器官中的表達水平，以煙草NtRL2(ribosomic protein L2，GenBank登錄號Z14081)作為內(nèi)參基因，設(shè)計引物NtRL2 rt-F(5′-GTAAGGGAGCGGGTTCAGTCT-3′)和NtRL2 rt-R(5′-AACGGAGCACCCCTACCTG-3′)；NtMTP1 rt-F(5′-TCGAGGTTGTTGGTGGTATTAAA

-3′)和NtMTP1 rt-R(5′-CGATTCTGAAAAACCCATAGGAC-3′)。采用RealMasterMix(SYBR Green I)試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)，在Bio-Rad公司的CFX96Real-Time System進行qRT-PCR擴增。程序為：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，40個循環(huán)，65 ℃延伸5 s，然后以每秒0.5 ℃升至95 ℃，61個循環(huán)。數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt法計算。

1.2.3煙草NtMTP1基因在Zn脅迫下的誘導(dǎo)表達用1/2 Hoagland營養(yǎng)液[19]培養(yǎng)野生型煙草幼苗30 d后，選取長勢良好，大小一致的幼苗轉(zhuǎn)入分別含0、50、100、200和400 μmol/L ZnSO4的新鮮1/2 Hoagland營養(yǎng)液中，處理48 h后取幼苗樣品，液氮速凍后置于-80 ℃儲存?zhèn)溆?。提取幼苗樣品總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄得到第一鏈cDNA，利用qRT-PCR分析NtMTP1基因的相對表達量。

1.2.4煙草NtMTP1基因植物過表達載體的構(gòu)建根據(jù)NtMTP1基因序列，利用Primer v5.0軟件，設(shè)計巢式PCR引物NtMTP1 F1(5′-ATTTGATGATTTGGGTCGG-3′)和NtMTP1 R1(5′-TGAAACAGATACTGGA ACCG-3′)，以及帶有XbaI和SacI雙酶切位點的特異性引物NtMTP1 F2(5′-TCTAGAATGGAGACGCAGAACCTGG-3′)和NtMTP1 R2(5′-GAGCTCTTACTCTCTTTCTATTTGAATGG-3′)。以野生型煙草cDNA為模板進行PCR擴增，得到NtMTP1基因片段，反應(yīng)程序為94 ℃ 變性15 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸10 s，30個循環(huán)，72 ℃充分延伸5 min。PCR產(chǎn)物與pEASY-Blunt載體(北京全式金生物公司)連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α后提取重組質(zhì)粒，送華大基因科技股份有限公司測序。測序正確后，用XbaI和SacI(Thermo公司)同時雙酶切測序正確的NtMTP1基因片段和植物表達載體pBI121，將NtMTP1基因插入到CaMV35S啟動子的后面，陽性克隆送華大基因科技股份有限公司測序。將重組質(zhì)粒用凍融法[20]轉(zhuǎn)入到農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細胞中。

1.2.5煙草遺傳轉(zhuǎn)化使用葉盤轉(zhuǎn)化法[21]轉(zhuǎn)化野生型煙草。用含有pBI121-35S∶∶MTP1重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌EHA105侵染野生型煙草葉片，隨后將葉片置于MS[22]+3%蔗糖+0.8%瓊脂+200 μmol/L乙酰丁香酮共培養(yǎng)基上，于(24±1)℃、黑暗條件下培養(yǎng)2 d后轉(zhuǎn)移到含50 mg/L硫酸卡那霉素(kanamycinsulfate，Kan)和500 mg/L頭孢曲松鈉(ceftriaxone sodium，Cef)的MS+3.0 %蔗糖+0.8%瓊脂+3.0 mg/L 6-BA+ 0.2 mg/L NAA分化培養(yǎng)基上，每7～15 d更換1次培養(yǎng)基，于上述條件下篩選培養(yǎng)1～2個月。當分化培養(yǎng)基上愈傷組織長出1.5 cm左右的新芽時，切取小芽轉(zhuǎn)移至含50 mg/L Kan的1/2 MS+3.0 %蔗糖+0.5%瓊脂的生根培養(yǎng)基上進行生根培養(yǎng)和篩選，獲取完整的Kan抗性植株[23]。待根系發(fā)達后轉(zhuǎn)移至盆中，在溫室內(nèi)(24±1)℃、光照16 h/d條件下培養(yǎng)。

1.2.6煙草NtMTP1基因過表達植株的篩選以及對Zn脅迫耐受性的檢測參照劉繼愷等鑒定轉(zhuǎn)基因陽性植株的方法[24]，對新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶Ⅱ(neomycin phosphotransferase Ⅱ，NPTⅡ)基因片段進行擴增。隨后，提取篩選到的轉(zhuǎn)基因陽性植株的RNA，反轉(zhuǎn)錄生成cDNA，利用半定量PCR檢測野生型和轉(zhuǎn)基因植株NtMTP1基因的表達量，從而篩選得到在RNA水平過表達的轉(zhuǎn)基因煙草植株，進一步培育篩選得到NtMTP1基因過表達純合體植株。

選取3個NtMTP1基因過表達純合子株系與野生型煙草株系進行Zn脅迫處理。將4個株系的種子用15% NaClO消毒后，分別播種于含有濃度為0、200、500、1 000和2 000 μmol/L ZnSO4的1/2 MS固體培養(yǎng)基上垂直培養(yǎng)，待種子萌發(fā)后，觀察幼苗的生長發(fā)育情況，在第45天測定幼苗的根長。

1.2.7生物學(xué)重復(fù)和統(tǒng)計學(xué)方法以上實驗均進行3次獨立的生物學(xué)重復(fù)，每個樣本含3株及以上植株，設(shè)置3次技術(shù)重復(fù)進行qRT-PCR。Zn脅迫耐受性分析中，分別測定每個濃度處理下10株以上的幼苗根長進行統(tǒng)計分析。利用DPS v7.05軟件進行單因素試驗統(tǒng)計分析和LSD多重比較檢驗處理間差異程度，采用Excel 2013軟件作圖。

2　結(jié)果與分析

2.1煙草NtMTP1基因的組織表達模式

分別提取野生型煙草根、莖、葉、花和種子的總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到第一鏈cDNA，利用qRT-PCR檢測NtMTP1基因在煙草不同組織中的表達情況。結(jié)果(圖1)顯示，NtMTP1基因主要在煙草的花與葉中表達，分別為根中16.81和7.26倍，而在根、莖和種子中表達量很低。這些結(jié)果表明，煙草NtMTP1基因具有組織特異表達的特征。

2.2Zn2+可誘導(dǎo)NtMTP1基因在煙草中的表達

用不同質(zhì)量濃度ZnSO4處理野生型煙草48 h，利用qRT-PCR對NtMTP1基因的表達量進行分析。結(jié)果如圖2所示，與用0 μmol/L ZnSO4處理的對照組煙草相比，NtMTP1基因的表達量在50 μmol/L ZnSO4處理的煙草中無明顯變化，而當濃度達到100 μmol/L后，其表達量開始升高，在用400 μmol/L ZnSO4處理的煙草中達到最高，為對照組的3.81倍。這些數(shù)據(jù)表明，煙草NtMTP1基因的表達受到Zn2+的誘導(dǎo)。

2.3煙草NtMTP1基因過表達植株的鑒定

圖1　煙草NtMTP1基因在不同組織中的表達Fig. 1　Expression profile of NtMTP1 gene in different tissues of tobacco

不同大寫字母代表各處理間的顯著性差異(P<0.01，LSD檢驗)圖2　煙草NtMTP1基因?qū)nSO4的響應(yīng)Different letters refer to significant differences among the treatments (P<0.01, LSD test)Fig. 2　Expression analysis of NtMTP1 gene in response to ZnSO4 treatment

使用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法轉(zhuǎn)化野生型煙草，共獲得16株組培植株，以提取獲得的組培植株的DNA為模板，NPTII F/R為引物進行PCR驗證陽性植株，預(yù)期擴增長度應(yīng)為857 bp。結(jié)果表明(圖3)，野生型煙草未能擴增出條帶，而抗性植株能夠擴增出預(yù)期大小的條帶，共檢測出12株抗性植株，陽性率為75%。隨后，利用半定量PCR對抗性植株中NtMTP1基因的表達水平進行初步鑒定，篩選出NtMTP1基因表達量最高的3株植株，分別為OE-6、OE-9和OE-10。利用qRT-PCR對NtMTP1基因在野生型和轉(zhuǎn)基因植株中的表達情況進行定量分析。結(jié)果顯示(圖4，A)，NtMTP1基因在3株轉(zhuǎn)基因植株中的表達量顯著高于野生型植株，分別為野生型的10.42、7.61和11.84倍。對NtMTP1基因過表達植株進行表型觀察，發(fā)現(xiàn)在正常生長情況下，轉(zhuǎn)基因植株與野生型相比，并沒有表現(xiàn)出明顯的差異(圖4，B)。

2.4煙草NtMTP1基因過表達植株對Zn脅迫的耐受性分析

土壤中過量的重金屬會對植物根的生長產(chǎn)生抑制作用，因此，植物根的長短常作為反映植物對重金屬耐受性的一個重要指標。將野生型和3個NtMTP1基因過表達純合體株系種子滅菌后，分別置于含有不同質(zhì)量濃度ZnSO4的1/2 MS培養(yǎng)基上生長，觀察幼苗生長的情況。結(jié)果顯示(圖5)，生長在含有0 μmol/L ZnSO4的1/2 MS培養(yǎng)基上的野生型和轉(zhuǎn)基因植株沒有明顯差異；在200 μmol/L ZnSO4處理下，野生型煙草根的生長表現(xiàn)出部分抑制，過表達植株的根系相比野生型要長大約3 cm；在500和1 000 μmol/L ZnSO4處理下，雖然野生型和過表達植株的生長都受到了一定程度的抑制，但過表達植株的根系仍然比野生型長；在2 000 μmol/L ZnSO4處理下，野生型和轉(zhuǎn)基因煙草植株都已不能正常生長，根的生長受到嚴重抑制。由此可見，隨著培養(yǎng)基中ZnSO4濃度的升高，野生型和轉(zhuǎn)基因煙草

M. DL2000；1～16. 轉(zhuǎn)基因植株；WT-1、WT-2. 野生型植株圖3　轉(zhuǎn)基因植株NTPTII基因的PCR檢測M. DL2000；1～16. Transgenic plants；WT-1 and WT-2. Wild typeFig. 3　PCR analysis for NPTII gene in transgenic plants

幼苗的生長都受到一定程度的抑制，但在200、500和1 000 μmol/L ZnSO4處理下，NtMTP1基因過表達植株幼苗的根始終都比野生型煙草幼苗的長，表明NtMTP1基因的過表達增強了煙草對Zn脅迫的耐受性。

A. 轉(zhuǎn)基因植株NtMTP1表達的qRT-PCR檢測；B. NtMTP1基因過表達植株的表型；WT. 野生型植株；OE-6、OE-9、OE-10. 轉(zhuǎn)基因煙草株系；下同圖4　NtMTP1基因過表達植株的鑒定及表型A. qRT-PCR analysis for NtMTP1 relative expression level in transgenic plants；B. The phenotype of NtMTP1 gene overexpression lines；WT. Wild type；OE-6, OE-9 and OE-10. Transgenic plants；The same as belowFig. 4　Identification and the phenotype of NtMTP1 gene overexpression lines

3　討　論

植物MTP蛋白的主要功能是將胞質(zhì)中的Zn2+等重金屬離子轉(zhuǎn)入液泡等細胞器中進行區(qū)域隔離或者排出胞外從而提高植物對重金屬的耐受性。目前，已從擬南芥等多個物種中克隆得到MTP1的同源基因，并對這些基因的功能開展了深入研究，但對煙草NtMTP1基因的研究還僅局限于酵母體內(nèi)，對其在煙草體內(nèi)的生物學(xué)功能的研究還未見報道。本試驗對NtMTP1基因的表達特性及其對煙草Zn脅迫耐受性的影響進行了研究。

Zn是植物必需的微量營養(yǎng)元素，其在花、莖、葉中的含量很高，這可能與植物生長生殖對營養(yǎng)金屬離子的需求有關(guān)[25]。研究顯示，擬南芥AtMTP1基因和苜蓿MtMTP1基因主要在幼嫩的葉中表達[13-14]，而水稻OsMTP1基因主要在成熟老葉和莖中表達[16]。本研究中，qRT-PCR結(jié)果顯示NtMTP1基因主要在煙草的花與葉中積累，而在根、莖和種子中表達量很低。這些結(jié)果表明：一方面，MTP1基因在植物地上部的轉(zhuǎn)錄水平普遍高于地下部，但是其在各個物種的不同組織中的表達模式又有所差異；另一方面，也暗示MTP1基因提高植物對重金屬的耐受性主要是通過地上組織細胞的區(qū)域化隔離和外排來實現(xiàn)的，可能并不涉及到對重金屬離子的吸收。前人研究表明，Zn2+能夠分別提高苜蓿MtMTP1和水稻OsMTP1基因在莖和葉中的表達水平[14,16]，本研究中煙草NtMTP1基因的表達量隨ZnSO4處理濃度的升高而升高，與上述結(jié)論相一致，表明NtMTP1基因能夠參與煙草植株體內(nèi)Zn2+的應(yīng)答。

Shingu等的研究表明，NtMTP1基因的異源表達能夠恢復(fù)酵母Zn敏感突變體Δzrc1對Zn的抗性[18]，本研究將NtMTP1基因在煙草中過表達，結(jié)果顯示與野生型相比，轉(zhuǎn)基因煙草植株表現(xiàn)出對Zn脅迫的耐受性顯著增強，揭示了NtMTP1蛋白在提高植物對重金屬Zn的耐受性的重要作用。以上結(jié)果為今后采用基因工程的方法來提高煙草抗重金屬脅迫的能力和遺傳改良提供了重要的基因資源和理論依據(jù)。

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(編輯:宋亞珍)

Overexpression ofNtMTP1 Gene fromNicotianatabacumImproved Zinc Tolerance of Tobacco

RAN Qiao1, WU Chanjuan1, 2, GAO Yongfeng1, TANG Yunlai1, 2,

HUANG Caizhi1, LIU Jikai1, 2*

(1 School of Life Science and Engineering, Southwest University of Science and Technology, Mianyang, Sichuan 621010, China; 2 Fundamental Science on Nuclear Wastes and Environmental Safety Laboratory, Southwest University of Science and Technology, Mianyang, Sichuan 621010,China)

In this study, the relative expression ofNtMTP1 was determined by quantitative real-time PCR (qRT-PCR). The results showed thatNtMTP1 gene was highly expressed in flowers and leaves. After treatment of 400 μmol/L ZnSO4for 48 h, the expression ofNtMTP1 increased to the maximum, which was 3.81 folds of the control. Plant-expression vector pBI121-35S∶∶MTP1 was constructed, and the recombinant plasmid was introduced intoNicotianatabacumL. cv NC89 by means ofAgrobacterium-tumefaciensmediated transformation. The qRT-PCR revealed a distinct increase of endogenousNtMTP1 expression level in the overexpressing transgenic lines, which were 10.42, 7.61 and 11.84 folds of that of wild plants, respectively. Seeds of wild type and transgenic plants were treated with different concentrations of ZnSO4. The results showed that overexpression ofNtMTP1 conferred enhanced zinc tolerance. These results provide an important basis to illuminate the function ofNtMTP1 gene in Zn2 +transport in tobacco.

Nicotianatabacum; metal tolerance protein 1; zinc; tolerance

1000-4025(2016)07-1308-07

10.7606/j.issn.1000-4025.2016.07.1308

2016-04-15;修改稿收到日期:2016-06-07

國家自然科學(xué)基金(31500205)；西南科技大學(xué)博士研究基金(14zx7153)；西南科技大學(xué)校長機動費特殊資助(14zx1104)；四川省生物質(zhì)資源利用與改性工程中心項目(13zxsk02)

冉巧(1994-)，女，在讀本科生，主要從事植物分子生物學(xué)研究。E-mail：ranarang_april@163.com

劉繼愷，博士，講師，主要從事植物分子生物學(xué)研究。E-mail：kateryan@163.com

Q785; Q786

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