中間錦雞兒轉(zhuǎn)錄因子基因CiNAC1的克隆及功能分析

岳俊燕，岳文冉，楊　杞，于秀敏，楊飛蕓，王光霞，李國(guó)婧，王瑞剛，叢靖宇

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué), 呼和浩特 010018)

?

中間錦雞兒轉(zhuǎn)錄因子基因CiNAC1的克隆及功能分析

岳俊燕，岳文冉，楊杞，于秀敏，楊飛蕓，王光霞，李國(guó)婧，王瑞剛，叢靖宇*

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué), 呼和浩特 010018)

NAC轉(zhuǎn)錄因子家族是植物特有的、最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，在植物應(yīng)答非生物脅迫和生長(zhǎng)發(fā)育過程中有重要的功能。該研究通過PCR技術(shù)，克隆得到了中間錦雞兒CiNAC1基因1 066 bp的cDNA全長(zhǎng)序列。生物信息學(xué)分析顯示，CiNAC1基因的開放閱讀框(ORF)為921 bp，編碼306個(gè)氨基酸，推導(dǎo)的蛋白分子量為34.57 kD，等電點(diǎn)為8.35，是一種親水性蛋白，N端具有保守的NAM結(jié)構(gòu)域，具有26個(gè)磷酸化位點(diǎn)和7個(gè)糖基化位點(diǎn)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)顯示，中間錦雞兒CiNAC1基因表達(dá)受干旱、高鹽、脫水、高pH誘導(dǎo)；亞細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn)CiNAC1定位到細(xì)胞核中，這與它作為轉(zhuǎn)錄因子的功能是一致的；轉(zhuǎn)CiNAC1基因擬南芥株系側(cè)根數(shù)目顯著多于野生型，根長(zhǎng)也明顯比野生型長(zhǎng)。研究認(rèn)為，CiNAC1基因可能與中間錦雞兒響應(yīng)逆境脅迫機(jī)制有關(guān)。

中間錦雞兒；NAC轉(zhuǎn)錄因子；非生物脅迫；功能分析

植物在生長(zhǎng)發(fā)育過程中，會(huì)遭受到一些生物脅迫或非生物脅迫因素的影響，如干旱、高溫、鹽堿、冷、蟲害等。植物在受到這些脅迫以后，細(xì)胞會(huì)受到不同程度的損傷[1]。植物為了更好地適應(yīng)環(huán)境，經(jīng)過長(zhǎng)期的進(jìn)化形成了一些機(jī)制來抵制各種生物和非生物脅迫。當(dāng)植物受到脅迫刺激時(shí)，就會(huì)引發(fā)一系列生理生化反應(yīng)。轉(zhuǎn)錄因子(Transcription factor，TF)在植物響應(yīng)逆境脅迫的分子信號(hào)通路中，具有極為重要的調(diào)控作用。通過調(diào)控相應(yīng)的應(yīng)答基因的表達(dá)，從而使植物產(chǎn)生應(yīng)對(duì)逆境脅迫的能力。

NAC轉(zhuǎn)錄因子是近10年新發(fā)現(xiàn)的最大的一類植物特有的轉(zhuǎn)錄因子[2]。NAC家族的命名源于矮牽牛(Petuniahybrida)的NAM(no apical meristem)和擬南芥(Arabidopsisthaliana)的ATAF1、ATAF2，以及CUC2(cup-shape cotyledon)基因[3-4]。1996年，Souer從矮牽牛中克隆得到了第1個(gè)NAC轉(zhuǎn)錄因子[5]，隨后在擬南芥、水稻、煙草、小麥和大豆等物種中相繼都有發(fā)現(xiàn)。迄今為止，NAC轉(zhuǎn)錄因子已在擬南芥中至少發(fā)現(xiàn)117個(gè)，水稻中有151個(gè)[6]，大豆[7]和煙草[8]中都至少有152個(gè)，楊樹中至少含有163個(gè)[9]。

NAC轉(zhuǎn)錄因子包含一個(gè)N端高度保守的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和C端高度變異的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域。N端高度保守，由大約160個(gè)氨基酸殘基組成，可分為A、B、C、D和E等5個(gè)亞結(jié)構(gòu)域。其中，B和E亞結(jié)構(gòu)域的保守性不強(qiáng)，而A、C、D亞結(jié)構(gòu)域則高度保守，并且C、D亞結(jié)構(gòu)域中包含有核定位信號(hào)[10]。N端是DNA結(jié)合域，主要負(fù)責(zé)與DNA及其他蛋白的結(jié)合；C端是高度變異和具有轉(zhuǎn)錄激活功能的調(diào)控區(qū)，為轉(zhuǎn)錄激活域[11]，此區(qū)域的特點(diǎn)是頻繁的出現(xiàn)簡(jiǎn)單氨基酸的重復(fù)序列，如絲氨酸、蘇氨酸、脯氨酸和谷氨酸，或酸性殘基[12-13]。

NAC轉(zhuǎn)錄因子在植物的生長(zhǎng)發(fā)育過程中具有重要的作用，它主要參與的過程有：植物細(xì)胞次生壁的生成，如ANAC012既能增加木質(zhì)部導(dǎo)管的細(xì)胞壁增厚，又能抑制擬南芥木纖維細(xì)胞中次生壁的生成[14]；植物頂端分生組織形成，如CUC1、CUC2與植物頂端分生組織的形成有關(guān)，在擬南芥CUC1和CUC2的雙突變體中，子葉、雄蕊和萼片融合，難以形成頂端分生組織[15]；植物側(cè)根發(fā)育，如AtNAC2過表達(dá)促進(jìn)側(cè)根發(fā)育，乙烯前體ACC能夠誘導(dǎo)AtNAC2表達(dá)[16]，此外，AtNAC1在TIR1下游為側(cè)根的發(fā)育轉(zhuǎn)導(dǎo)生長(zhǎng)素信號(hào)[17]；細(xì)胞分裂，如當(dāng)擬南芥NTM1的突變體中組蛋白H4的合成受到抑制時(shí)，細(xì)胞分裂就會(huì)受到抑制，植物生長(zhǎng)就會(huì)變緩慢[18]；種胚的發(fā)育，如當(dāng)降低擬南芥中AtNAC102基因的表達(dá)，種子的萌發(fā)率顯著降低[19]，蕪菁BcNAC2基因在嫩角果和胚珠中的表達(dá)量較高，這與種子或胚的形成有關(guān)[20]；果實(shí)的成熟與衰老，如番茄SiNAC3基因通過延遲果實(shí)軟化和改變類胡蘿卜素的合成來調(diào)控果實(shí)采摘后的成熟[21]，MaNACs通過與乙烯信號(hào)元件的相互作用來正調(diào)控香蕉果實(shí)采后的成熟[22]，擬南芥AtNAP基因促進(jìn)植物衰老[23]。

中間錦雞兒(Caraganaintermedia)主要分布于干旱半干旱的荒漠地區(qū)，是一種多年生豆科灌木[24]，具有良好的防風(fēng)固沙和保持水土功能[25]，同時(shí)也是優(yōu)質(zhì)的飼料資源，具有較高的飼用價(jià)值[26]。本研究從本實(shí)驗(yàn)室建立的中間錦雞兒干旱轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得一條CiNAC1基因序列，進(jìn)一步研究克隆得到該基因的cDNA全長(zhǎng)，初步研究發(fā)現(xiàn)CiNAC1基因受干旱、脫水、高鹽、高pH的誘導(dǎo)。

1　材料和方法

1.1材料

本實(shí)驗(yàn)所用中間錦雞兒種子采自于內(nèi)蒙古四子王旗；擬南芥野生型(Col-0)由本實(shí)驗(yàn)保存；克隆載體pEASY-Blunt simple購(gòu)自TransGen；表達(dá)載體pCanG-HA由中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育研究所謝旗研究員惠贈(zèng)；表達(dá)載體pCAMBIA1302、大腸桿菌感受態(tài)、農(nóng)桿菌GV3101均由本實(shí)驗(yàn)室提供；T4DNA 連接酶和限制性內(nèi)切酶等購(gòu)自Thermo公司。

1.2方法

1.2.1材料處理選取顆粒飽滿的中間錦雞兒種子種植于蛭石和營(yíng)養(yǎng)土(2∶1)中，在23 ℃長(zhǎng)日照的溫室中培養(yǎng)(16 h光照/8 h黑暗)，30 d后選取長(zhǎng)勢(shì)基本一致的中間錦雞兒幼苗進(jìn)行處理，檢測(cè)不同非生物脅迫下CiNAC1基因的表達(dá)量。

(1) NaCl處理：將正常生長(zhǎng)30 d的中間錦雞兒幼苗的根部全部浸泡在200 mL濃度為300 mmol·L-1NaCl的液體MS培養(yǎng)基中，分別浸泡0、1、3、6、12、24和48 h后取樣。

(2) 高pH處理：將正常生長(zhǎng)30 d的中間錦雞兒幼苗的根部全部浸泡在200 mL濃度為200 mmol·L-1NaHCO3的液體MS培養(yǎng)基中，分別浸泡0、1、3、6、12、24和48 h后取樣。

(3) 脫水處理：將正常生長(zhǎng)30 d的中間錦雞兒幼苗小心從土壤中取出，洗凈根部以后，置于干凈的濾紙上，分別在0、1、3、6、12、24和48 h后取樣。

(4) 干旱處理：正常生長(zhǎng)29 d的中間錦雞兒最后一次澆水24 h后，即苗齡30 d時(shí)為對(duì)照，之后停止?jié)菜?，? d取1次樣，干旱16 d后復(fù)水，復(fù)水48 h后再取樣，取樣時(shí)間分別為0、4、8、12、16 和18 d。

1.2.2中間錦雞兒總RNA的提取與反轉(zhuǎn)錄采取生長(zhǎng)30 d的中間錦雞兒幼苗，使用Trizol試劑進(jìn)行總RNA提取，用超微量紫外分光光度計(jì)和瓊脂糖凝膠電泳來檢測(cè)提取的RNA質(zhì)量，選取質(zhì)量較好的RNA用M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA第一鏈。

1.2.3中間錦雞兒CiNAC1基因cDNA全長(zhǎng)的克隆根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室干旱轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中NAC1序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增CiNAC1基因cDNA全長(zhǎng)引物PCiNAC1-F(5′-GCGTCGACATGAGCAACATAAGCATGGTAG-3′)和PCiNAC1-R(5′-GCGAGCTCAAGAAAGCTTAAAGAGGAGTGAA-3′)，以反轉(zhuǎn)錄中間錦雞兒cDNA為模板，利用高保真酶Primer STAR(TaKaRa公司)進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)程序?yàn)?8 ℃預(yù)變性3 min，98 ℃變性30 s，55 ℃退火10 s，72 ℃延伸1.5 min，72 ℃補(bǔ)充延伸5 min，30個(gè)循環(huán)。

1.2.4不同非生物脅迫處理下CiNAC1基因表達(dá)分析中間錦雞兒幼苗分別用NaCl、高pH、脫水、干旱處理后，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，用實(shí)時(shí)定量熒光PCR(qRT-PCR)進(jìn)行基因表達(dá)分析。根據(jù)CiNAC1 cDNA全長(zhǎng)序列設(shè)計(jì)CiNAC1熒光定量表達(dá)引物qCiNAC1-F(5′-TCAAAACCAAACCAACCCAATC-3′)和qCiNAC1-R(5′-TCGGTGCTCCTCCAAATGTAG-3′)，qRT-PCR采用SYBR GreenⅠ熒光染料法檢測(cè)，反應(yīng)體系為10 μL SYBR Primix Ex TaqTM，引物各0.4 μL(10 μmol·L-1)，稀釋的cDNA模板5 μL，DEPC水4.2 μL，總體系20 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性1 min，95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸10 s，95 ℃補(bǔ)充延伸1 min，40個(gè)循環(huán)。

中間錦雞兒的內(nèi)參引物為qCiEF1α-F(5′-CAAAAAGTCCCCTCGTTGTCTC-3′)和qCiEF1α-R(5′-AGCAATCGTTCTTCCTAATGATCTAA-3′)，擬南芥內(nèi)參引物為qAtEF1αF(5′-AGAAGGGTGCCAAATGATGAG-3′)和qAtEF1αR(5′-GGAGGGAGAGAGAAAGTCACAGA-3′)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用2-ΔΔCt法計(jì)算。

1.2.5中間錦雞兒CiNAC1基因的生物信息學(xué)分析利用DNAMAN 軟件進(jìn)行氨基酸序列多重比對(duì)；利用ExPasy在線工具ProParam和 ProtScale 分析蛋白的各種氨基酸含量，理論分子量和等電點(diǎn)等理化參數(shù)；NCBI CDD數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)預(yù)測(cè)蛋白的功能結(jié)構(gòu)域；NetPhos(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)和NetGlycate(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetGly-cate/)預(yù)測(cè)蛋白的磷酸化位點(diǎn)和糖基化位點(diǎn)；SOPMA(http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_opma.html)預(yù)測(cè)蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)；MEGA6軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析。

1.2.6構(gòu)建表達(dá)載體pCanG-CiNAC1和pCAMBIA1302-CiNAC1用SacⅠ和SalⅠ限制性內(nèi)切酶對(duì)CiNAC1和pCanG-HA進(jìn)行雙酶切，從凝膠中回收目的片段，使用T4DNA 連接酶連接，構(gòu)建pCanG-CiNAC1過表達(dá)載體；用BglⅡ和SpelⅠ限制性內(nèi)切酶對(duì)CiNAC1和pCAMBIA1302-GFP進(jìn)行雙酶切，回收目的片段，使用T4DNA 連接酶連接，構(gòu)建pCAMBIA1302-CiNAC1過表達(dá)載體。將表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)，用于擬南芥轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。

1.2.7擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化將轉(zhuǎn)化有表達(dá)載體pCanG-CiNAC1的農(nóng)桿菌浸染野生型擬南芥，收取種子，種植在含有25 mg·L-1卡那霉素的1/2 MS培養(yǎng)基上，根據(jù)孟德爾遺傳定律，篩選T3代純合體。

1.2.8CiNAC1在原生質(zhì)體中的亞細(xì)胞定位選取在23 ℃、16 h光照/8 h黑暗的溫室中生長(zhǎng)3～4周齡的擬南芥幼苗葉片，用PEG介導(dǎo)法制備擬南芥葉肉原生質(zhì)體。提取pCAMBIA1302-CiNAC1-GFP和空載體pCAMBIA1302-35S-GFP質(zhì)粒各約30 μg，然后將其分別轉(zhuǎn)化到擬南芥葉肉原生質(zhì)體中，在六孔板中室溫孵育16 h，用熒光顯微鏡觀察GFP熒光信號(hào)。

1.2.9轉(zhuǎn)CiNAC1基因擬南芥?zhèn)雀治鲆吧秃瓦^表達(dá)擬南芥種子(OE-5、OE-42和OE-60)經(jīng)過75%乙醇滅菌10 min，用含有0.05% Tween-20的100%乙醇滅菌10 min ，待種子晾干后種在1/2 MS培養(yǎng)基上，4 ℃同步化處理3 d，將平板取出置于23 ℃，16 h光照/8 h黑暗條件下培養(yǎng)36～40 h，選取長(zhǎng)勢(shì)一致的50棵幼苗，并移到新的1/2 MS培養(yǎng)基上豎直培養(yǎng)12 d，統(tǒng)計(jì)側(cè)根數(shù)，并測(cè)量根長(zhǎng)。

2　結(jié)果與分析

2.1中間錦雞兒 CiNAC1基因的克隆與分析

從干旱轉(zhuǎn)錄組得到CiNAC1基因的一段序列，通過NCBI Blast進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)具有完整的開放閱讀框(ORF)。根據(jù)這段已知序列設(shè)計(jì)PCiNAC1-F和PCiNAC1-R引物，以中間錦雞兒cDNA為模板，利用高保真酶Prime STAR進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到CiNAC1基因cDNA全長(zhǎng)序列(圖1)。CiNAC1基因cDNA序列全長(zhǎng)1 066 bp，其中開放閱讀框(ORF)921 bp，可編碼306個(gè)氨基酸(圖2)。

2.2CiNAC1蛋白與其他物種NAC類蛋白多重比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

應(yīng)用DNAMAN 5.2軟件將CiNAC1氨基酸序列與擬南芥ANAC019、苜蓿MtNAC1、大豆GmNAC35、野生大豆GaNAC21/22的氨基酸序列進(jìn)行多重序列比對(duì)，結(jié)果(圖3)表明CiNAC1蛋白與其他NAC類蛋白一樣，N端的氨基酸序列高度保守，包含A～E 等5個(gè)亞結(jié)構(gòu)域。

圖1　CiNAC1基因cDNA擴(kuò)增M. DL5000　1. CiNAC1Fig. 1　Amplification of CiNAC1 cDNA

利用MAGE6軟件將中間錦雞兒CiNAC1與苜蓿NAC1(Medicagotruncatula)、沙冬青(Ammopiptanthusmongolicus)、大豆NAC35(Glycinemax)、野生大豆NAC21/22(Glycinesoja)、湖北海棠(Malushupehensis)、可可樹NAC21/22(Theobromacacao)、木薯NAC40(Manihotesculenta)、毛果楊NAC1(Populustrichocarpa)、歐洲山楊×銀白楊NAC1(Populustremula×Populusalba)、茶樹(Camelliasinensis)、擬南芥NAC1(Arabidopsisthaliana)進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，結(jié)果(圖4)表明中間錦雞兒CiNAC1與苜蓿MtNAC1聚在一枝，它們的相似性達(dá)到89%，親緣關(guān)系最近。

2.3中間錦雞兒CiNAC1蛋白的理化性質(zhì)分析及功能預(yù)測(cè)

2.3.1CiNAC1蛋白的理化性質(zhì)分析利用ExPasy在線工具ProParam，分析CiNAC1蛋白編碼306個(gè)氨基酸，相對(duì)分子質(zhì)量34.57 kD，等電點(diǎn)pI為8.35，脂肪族指數(shù)為68.50，此蛋白是不穩(wěn)定蛋白。疏水性預(yù)測(cè)分析發(fā)現(xiàn)整個(gè)多肽鏈一共有76個(gè)疏水性氨基酸和230個(gè)親水氨基酸，表明CiNAC1蛋白是親水蛋白。

起始密碼子ATG用下劃線表示，終止密碼子TGA用星號(hào)和下劃線表示圖2　CiNAC1基因cDNA全長(zhǎng)序列及編碼氨基酸序列The ATG initiation codon is underlined; The terminal codon is underlined with asteriskFig. 2　The cDNA and the deduced amino acid sequence of CiNAC1

下劃線部分表示NAC結(jié)構(gòu)域的5個(gè)亞結(jié)構(gòu)域A～E；黑色背景表示完全一樣的氨基酸序列；灰色背景表示一致性的氨基酸序列； ANAC019. 擬南芥(NP_175697.1)；CiNAC1. 中間錦雞兒；MtNAC1. 苜蓿(XP_003595973.1)；GmNAC35. 大豆(NP_001235901.1)；GsNAC21/22. 野生大豆(KHN26800.1)圖3　CiNAC1蛋白與其他NAC類蛋白保守結(jié)構(gòu)域的比對(duì)The underlined sections are five conservative sub-domains A to E in NAC. Amino acid residues conserved in all sequences are boxed in black, while similar amino acids are boxed in gray. All abbreviation and GenBank Accession No.are shown as: ANAC019. Arabidopsis thaliana (NP_175697.1); CiNAC1. Caragana intermedia; MtNAC1. Medicago truncatula (XP_003595973.1); GmNAC35. Glycine max (NP_001235901.1); GsNAC21/22. Glycine soja (KHN26800.1)Fig. 3　Alignment of NAC domain between CiNAC1 and other NACs

括號(hào)內(nèi)為氨基酸登錄號(hào)；分支上的數(shù)字表示Bootstrap驗(yàn)證中基于1 000次重復(fù)該節(jié)點(diǎn)的可信度的百分比；標(biāo)尺表示演化距離圖4　CiNAC1與其他物種NACs的系統(tǒng)進(jìn)化分析The accession No. was given in bracket; The numbers on the branches represent the reliability percent of bootstrap values based on 1 000 replications; Scaleplate represents the evolution distance of these plantsFig. 4　Phylogeneic analysis of CiNAC1 and NACs from other species

2.3.2CiNAC1蛋白的功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)與分析利用NCBI CDD(Converved Domain Database)數(shù)據(jù)庫(kù)分析CiNAC1蛋白的保守結(jié)構(gòu)域發(fā)現(xiàn)，在N端第11～135個(gè)氨基酸之間有一個(gè)由125個(gè)氨基酸組成的NAM保守結(jié)構(gòu)域。因此，可以推斷出中間錦雞兒CiNAC1基因?qū)儆贜AC家族。

利用NetPhos和NetGlycate在線軟件預(yù)測(cè)CiNAC1蛋白的磷酸化位點(diǎn)和糖基化位點(diǎn)時(shí)發(fā)現(xiàn)，CiNAC1基因編碼的共包含7個(gè)糖基化位點(diǎn)(10、32、48、121、124、226、269)和 26個(gè)磷酸化位點(diǎn)，其中26個(gè)磷酸化位點(diǎn)均為蘇氨酸(Thr)磷酸化位點(diǎn)(50、82、112、161、199、236、267、268、334、341、379、395、429、453、455、466、485、559、584、670、686、736、737、791、877、890)。

2.3.3CiNAC1蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)利用SOPMA在線軟件預(yù)測(cè)CiNAC1蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)CiNAC1蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)無規(guī)卷曲所占比例最多，其中145個(gè)氨基酸形成無規(guī)卷曲，所占比例為47.39%；70個(gè)氨基酸形成α-螺旋，所占比例為22.88%；66個(gè)氨基酸形成延伸鏈，所占比例為21.57%；25個(gè)氨基酸形成β-轉(zhuǎn)角，所占比例為8.17%。

2.4CiNAC1基因在不同非生物逆境脅迫下的表達(dá)分析

為了進(jìn)一步研究CiNAC1基因的功能，本實(shí)驗(yàn)采用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)了中間錦雞兒在經(jīng)過NaCl、脫水、土壤干旱、高pH處理以后CiNAC1基因表達(dá)量的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(圖5)，脫水處理以后中間錦雞兒CiNAC1基因表達(dá)量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，且在6 h時(shí)最高，達(dá)到6倍；NaCl處理后CiNAC1基因表達(dá)量逐漸升高，到12 h時(shí)達(dá)到未處理的6倍左右，并且一直到48 h仍保持高水平；

高pH處理后，CiNAC1基因表達(dá)量逐漸升高，且在48 h時(shí)達(dá)到最高水平，約為未處理的13倍；土壤干旱處理后CiNAC1基因表達(dá)量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，在16 d時(shí)達(dá)到最高水平，約為未處理的4倍。說明中間錦雞兒CiNAC1基因可能參與對(duì)干旱、強(qiáng)堿和鹽脅迫的響應(yīng)。

2.5轉(zhuǎn)基因擬南芥中 CiNAC1基因的表達(dá)分析

選取T3代純合體轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗的葉片，提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，利用特異性引物PCiNAC1-F和PCiNAC1-R進(jìn)行RT-PCR鑒定，結(jié)果如圖6，A所示，以野生型擬南芥cDNA做的陰性對(duì)照沒有擴(kuò)增出目的條帶，中間錦雞兒cDNA做陽(yáng)性對(duì)照有單一條帶，在10個(gè)轉(zhuǎn)基因株系中均擴(kuò)增出目的條帶，表明CiNAC1在各轉(zhuǎn)基因株系中都有表達(dá)。同時(shí)利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)CiNAC1在轉(zhuǎn)基因株系中的表達(dá)水平(圖6，B)，選取表達(dá)量較高的OE-5、OE-42和OE-60純合體株系用于下一步的表型檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。

2.6CiNAC1在原生質(zhì)體中的亞細(xì)胞定位

選取生長(zhǎng)3～4周齡擬南芥幼苗的葉片，制備擬南芥葉肉原生質(zhì)體。將構(gòu)建好的pCAMBIA1302-CiNAC1質(zhì)粒和35S∶GFP空載體分別轉(zhuǎn)化到擬南芥葉肉原生質(zhì)體，培養(yǎng)16 h后觀察GFP熒光信號(hào)。如圖7所示，35S∶GFP空載體的熒光遍布整個(gè)細(xì)胞，而GFP-CiNAC1僅定位于細(xì)胞核中。

2.7CiNAC1促進(jìn)側(cè)根生長(zhǎng)

將野生型擬南芥(WT)和過表達(dá)株系(OE-5、OE-42和OE-60)種子分別種在1/2 MS培養(yǎng)基上，春化3 d。在溫室中正常生長(zhǎng)40 h后，將其移到新的1/2 MS培養(yǎng)基上豎直培養(yǎng)12 d后，拍照(圖8)，統(tǒng)計(jì)側(cè)根數(shù)，測(cè)量根長(zhǎng)，并計(jì)算側(cè)根數(shù)/根長(zhǎng)的比值(表1)，進(jìn)行3次生物重復(fù)。結(jié)果表明，CiNAC1過表達(dá)株系的側(cè)根數(shù)目明顯高于野生型擬南芥，而且達(dá)到了極顯著水平；CiNAC1過表達(dá)株系的根系也明顯比野生型的長(zhǎng)；CiNAC1過表達(dá)株系的側(cè)根數(shù)/根長(zhǎng)的比值也明顯高于野生型，而且均達(dá)到了顯著水平。這說明，過表達(dá)CiNAC1基因促進(jìn)了擬南芥?zhèn)雀陌l(fā)生，同時(shí)也促進(jìn)了主根的伸長(zhǎng)。

圖5　qRT-PCR檢測(cè)各種脅迫下 CiNAC1基因的表達(dá)Fig. 5　The expression of CiNAC1 under different stresses by qRT-PCR

A. CiNAC1轉(zhuǎn)基因株系RT-PCR鑒定：M.DL2000; C-.野生型擬南芥cDNA(陰性對(duì)照)；C+.中間錦雞兒cDNA(陽(yáng)性對(duì)照)；其他代號(hào)為轉(zhuǎn)基因株系；B.轉(zhuǎn)基因株系 CiNAC1表達(dá)水平的實(shí)時(shí)定量PCR鑒定圖6　CiNAC1轉(zhuǎn)基因株系鑒定及表達(dá)水平鑒定A. RT-PCR identification of CiNAC1 transgenic Arabidopsis lines: C-. Arabidopsis thaliana cDNA (Negative control); C+. Caragana intermedia cDNA (Positive control); Others are transgenic lines; B. Quantitative real-time PCR analysis of CiNAC1 expression in CiNAC1 transgenic linesFig. 6　The expression level of CiNAC1 in transgenic Arabidopsis

圖7　擬南芥葉肉原生質(zhì)體中GFP- CiNAC1的亞細(xì)胞定位Fig. 7　The nuclear localization of GFP- CiNAC1 in Arabidopsis mesophyll protoplast

擬南芥種子在1/2 MS培養(yǎng)基中正常生長(zhǎng)40 h后，轉(zhuǎn)移到新的1/2 MS培養(yǎng)基中，豎直培養(yǎng)12 d(n=50)圖8　過表達(dá) CiNAC1基因促進(jìn)擬南芥?zhèn)雀l(fā)生The 40-hours-seedlings on 1/2 MS medium were transferred to new medium(n=50)Fig. 8　Overexpression of CiNAC1 promoted the lateral root formation in Arabidopsis

植株P(guān)lant表型特征Phenotypiccharacteristic側(cè)根數(shù)Numbersoflateralroot/number根長(zhǎng)Rootlength/cm側(cè)根數(shù)/根長(zhǎng)Lateralrootdensity(N/L)WT10.28±4.404.443±1.192.565±1.33OE-512.42±4.39*4.564±1.453.235±1.93*OE-4215.58±6.05**5.293±1.71**3.265±1.57*OE-6014.36±4.81**5.095±1.49*3.131±1.45*

注：表中所列數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差；*表示顯著性水平，*P<0.05；**P<0.01

Note: The data listed in the table as mean ±SD; Asterisks indicate a significant difference.*P<0.05;**P<0.01

3　討　論

中間錦雞兒經(jīng)過漫長(zhǎng)的進(jìn)化過程，適應(yīng)了干旱、高溫、高鹽堿等極端的生長(zhǎng)環(huán)境，具有了很強(qiáng)的抗逆性[27]。從中間錦雞兒中克隆參與抗逆性相關(guān)的基因，并對(duì)其進(jìn)行功能研究，這對(duì)進(jìn)一步從分子機(jī)制上研究中間錦雞兒抗逆性機(jī)理提供了一定的幫助。本研究從中間錦雞兒中克隆得到一個(gè)NAC轉(zhuǎn)錄因子，經(jīng)過Blast比對(duì)發(fā)現(xiàn)，它與擬南芥NAC1基因同源性較高，因此將其命名為CiNAC1。

本研究通過觀察擬南芥葉肉細(xì)胞原生質(zhì)體的亞細(xì)胞定位，發(fā)現(xiàn)CiNAC1的表達(dá)產(chǎn)物定位在細(xì)胞核上，該結(jié)果與NAC轉(zhuǎn)錄因子的N端保守結(jié)構(gòu)域中含有核定位信號(hào)的理論一致。已經(jīng)有很多研究表明，NAC轉(zhuǎn)錄因子的定位在細(xì)胞核。如Xie等[28]發(fā)現(xiàn)擬南芥AtNAC1定位在細(xì)胞核；Han等[29]通過構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)融合蛋白的轉(zhuǎn)基因株系，發(fā)現(xiàn)中間錦雞兒GFP-CiNAC3和GFP-CiNAC4的表達(dá)產(chǎn)物定位于細(xì)胞核中；Zhang等[30]也通過構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)融合蛋白的轉(zhuǎn)基因株系，發(fā)現(xiàn)胡楊GFP-PeNAC045的表達(dá)產(chǎn)物定位于細(xì)胞核。

本研究結(jié)果CiNAC1轉(zhuǎn)基因株系側(cè)根數(shù)目比野生型多，主根也比野生型長(zhǎng)，側(cè)根數(shù)/根長(zhǎng)的比值(即側(cè)根密度)也比野生型大。過表達(dá)CiNAC1擬南芥?zhèn)雀鶖?shù)比野生型多的這一結(jié)果與擬南芥AtNAC1的表型一致[28]，過表達(dá)CiNAC1擬南芥主根比野生型長(zhǎng)的這一結(jié)果與過表達(dá)GmNAC004擬南芥一致[31]。在NAC轉(zhuǎn)錄因子家族中，有很多與生長(zhǎng)素相關(guān)的基因。Xie等[28]發(fā)現(xiàn)擬南芥AtNAC1可以被生長(zhǎng)素誘導(dǎo)，促進(jìn)下游2個(gè)生長(zhǎng)素相關(guān)基因DBP(DNABINDINGPROTEIN)和AIR3(AUXIN-INDUCEDINROOTCULTURES3)的表達(dá)，從而介導(dǎo)生長(zhǎng)素信號(hào)，促進(jìn)根尖和側(cè)根的發(fā)育。即AtNAC1在TIR1下游傳送生長(zhǎng)素信號(hào)給AIR3從而促進(jìn)側(cè)根生長(zhǎng)；Xie等[32]發(fā)現(xiàn)SINAT5促進(jìn)泛素相關(guān)的NAC1降解來衰減生長(zhǎng)素信號(hào)；Guo等[33]發(fā)現(xiàn)microRNA 直接切斷NAC1轉(zhuǎn)錄因子的mRNA來下調(diào)生長(zhǎng)素信號(hào)，從而調(diào)控?cái)M南芥?zhèn)雀陌l(fā)育；Wang等[34]發(fā)現(xiàn)生長(zhǎng)素和赤霉素誘導(dǎo)AtNAC1上游基因的表達(dá)，從而誘發(fā)側(cè)根的形成；He等[35-36]發(fā)現(xiàn)擬南芥AtNAC2(ANAC092、AT5G39610)可以被生長(zhǎng)素誘導(dǎo)，并且參與生長(zhǎng)素調(diào)控的側(cè)根形成，而且AtNAC2參與擬南芥對(duì)鹽脅迫的響應(yīng)，能夠誘導(dǎo)許多衰老相關(guān)基因，參與乙烯和ABA的響應(yīng)；Hao等[37]發(fā)現(xiàn)大豆GmNAC20基因可以促進(jìn)擬南芥?zhèn)雀男纬?，在過表達(dá)GmNAC20擬南芥中，生長(zhǎng)素相關(guān)的下游基因ARF2、AXR1的表達(dá)量降低，而ARF7、ARF19、LBD12、AIR1表達(dá)量降低；Quach等[31]發(fā)現(xiàn)無論在正常生長(zhǎng)條件下還是在水脅迫條件下，過表達(dá)GmNAC004擬南芥與野生型相比側(cè)根數(shù)目增加，根長(zhǎng)較長(zhǎng)。以上的結(jié)果表明不同物種NAC1同源性較高、功能比較保守。

[1]孫利軍,李大勇,張慧娟,等. NAC轉(zhuǎn)錄因子在植物抗病和抗微生物脅迫反應(yīng)中的作用[J]. 遺傳, 2012, 34(8): 993-1 002.

SUN L J, LI D Y, ZHANG H J,etal. Functions of NAC transciption factors in biotic and abiotic stress responses in plants[J].Hereditas, 2012, 34(8): 993-1 002.

[2]陳娜,蔣晶,曹必好,等. 植物NAC轉(zhuǎn)錄因子功能研究新進(jìn)展[J]. 分子植物育種, 2015, 13(6): 1 407-1 414.

CHEN N, JIANG J, CAO B H,etal. The latest progresses on plant NAC transcription factors function[J].MolecularPlantBreeding, 2015, 13(6): 1 407-1 414.

[3]彭輝,于興旺,等. 植物NAC轉(zhuǎn)錄因子家族研究概況[J]. 植物學(xué)報(bào), 2010, 45(2): 236-248.

PENG H, YU X W,etal. Research progress of plant transcription factors[J].ChineseBulletinofBotany. 2010, 45(2): 236-248.

[4]AIDA M, IHIDA T, FUKAKI H,etal. Genes involved in organ separation inArabidopsis: an analysis of the cup-shaped cotyledon mutant[J].PlantCell, 1997, 9(6): 841-857.

[5]SOUER E, VAN HOUWELINGEN A, KLOOS D,etal. The no apical meristem gene of petunia is required for pattern formation in embryos and flowers and is expressed at meristem and primordia boundaries[J].Cell, 1996, 85(2): 159-170.

[6]NURUZZAMAN M, MANIMEKALAI R, SHARONI A M,etal. Genome-wide analysis of NAC transcription factor family in rice[J].Gene, 2010,465(1-2): 30-44.

[7]LE D T, NISHIYAMA R, WATANABE Y,etal. Genome-wide survey and expression analysis of the plant-specific NAC transcription factor family in soybean during development and dehydration stress[J].DNARes, 2011, 18(4): 263-276.

[8]HU R, QI G, KONG Y,etal. Comprehensive analysis of NAC domain transcription factor gene family inPopulustrichocarpa[J].BMCPlantBiology, 2010, 10: 145-178.

[9]RUSHTON P J, BOKOWIEC M T,etal. Tobacco transcription factors:novel in sights into transcriptional regulation in the Solanaceae[J].PlantPhysiol., 2008, 147: 280-295.

[10]邢國(guó)芳,王雁明,張魏斌,等. 植物NAC轉(zhuǎn)錄因子研究進(jìn)展[J]. 山西農(nóng)業(yè)科學(xué), 2012, 40(4): 409-411.

XING G F, WANG Y M, ZHANG W B,etal. Research progress of NAC transcription factors in plant[J].JournalofShanxiAgriculturalSciences, 2012, 40(4): 409-411.

[12]李偉,韓蕾,等. 植物NAC轉(zhuǎn)錄因子的種類、特征和功能[J]. 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào), 2011, 17(4): 596-606.

LI W, HAN L,etal. Characteristics and functions of NAC transcription factors in plants[J].ChineseJournalofAppliedandEnvironmentBiology, 2011, 17(4): 596-606.

[13]OLSEN A N, EMST H A, LEGGIO L L,etal. NAC Transcription factors: structurally distinct, functionally diverse[J].TrendsinPlantScience, 2005, 10(2): 79-87.

[14]KO J H, YANG S H, PARK A H,etal. ANAC012,a member of the plant-specific NAC transcription factor family, negatively regulates xylary fiber development inArabidopsisthaliana[J].PlantJournal, 2007, 50: 1 035-1 048.

[15]AIDA M, ISHIDA T, FUKAKI H,etal. Genes involved in organ separation inArabidopsis: an analysis of thecup-shapedcotyledonmutant[J].PlantCell, 1997, 9: 841-857.

[16]HE X J, MU R L, CAO W H,etal.AtNAC2, a transcription factor downstream of rthylene and auxin signaling pathways,is involved in salt stress response an lateral root development[J].PlantJournal, 2005, 44(6): 903-916.

[17]王瑞芳,胡銀松,高文蕊,等. 植物NAC轉(zhuǎn)錄因子家族在抗逆響應(yīng)中的功能[J]. 植物生理學(xué)報(bào), 2014, 50(4): 1 494-1 500.

WANG R F, HU Y S, GAO W R,etal. Functions of NAC transcription factors family in stress responses in plant[J].PlantPhysiologyJournal, 2014, 50(4): 1 494-1 500.

[18]KIM S Y, KIM S G, KIM Y S,etal. Exploring memberance-associated NAC transcription factors inArabidopsis:Implications for membrance biology in genome regulation[J].NucleicAcidsResearch, 2006, 35(1): 203-213.

[19]CHRISTIANSON J A, WILSON I W, LLEWELLYN D J,etal. The low-oxygen induced NAC domain transcription factorANAC012 affects viabilityArabidopsisseeds following low-oxygen treatment[J].PlantPhysiology, 2009, 149(4): 1 724-1 738.

[20]張海娟,吳劍鋒,胡帥,等. 蕪菁NAC轉(zhuǎn)錄因子BcNAC2基因的分離及其表達(dá)[J]. 園藝學(xué)報(bào), 2011, 38(8): 1 089-1 096.

ZHANG H J, WU J F, HU S,etal. Isolation and expression analysis ofBcNAC2, a NAC transcription factor gene in Turnip[J].ActaHorticulturaeSinica, 2011, 38(8): 1 089-1 096.

[21]KOU X H, WANG S,etal. Molecular characterization and expression analysis of NAC family transcription factors in tomato[J].PlantMolecularBiologyReporter, 2014, 32: 501-516.

[22]SHAN W, KUANG J F,etal. Molecular characterization of banana NAC transcription factors and their interactions with ethylene sigalling component EIL during fruit ripening[J].JournalofExperimentalBotany, 2012, 63(14): 5 171-5 187.

[23]KOU X H, WATKINS C B, GAN S S,etal.ArabidopsisAtNAPregulates fruit senescence[J].JournalofExperimentalBotany, 2012, 63(17): 6 139-6 147.

[24]韓曉敏. 中間錦雞兒非生物脅迫相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的克隆與功能分析[D]. 呼和浩特：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué), 2015.

[25]王峰,左忠,張浩,等. 檸條飼料加工相關(guān)問題的探討[J]. 草業(yè)科學(xué), 2015, 22(6): 75-80.

WANG F, ZUO Z, ZHANG H,etal. Study onCaraganafeed process and its related problem[J].PratacultuRal.Science, 2015, 22(6): 75-80.

[26]劉國(guó)謙,張俊寶,劉東慶，等. 檸條的開發(fā)利用及草粉加工飼喂技術(shù)[J]. 草業(yè)科學(xué), 2003, 20(7): 26-30.

LIU G Q, ZHANG J B, LIU D Q,etal.Caraganaexploitation and the processing of meal feeding technique[J].PratacultuRalScience, 2003, 20(7): 26-30.

[27]楊杞,尹佳佳,王穎,等. 檸條錦雞兒CKLEA1基因克隆及表達(dá)分析[J]. 中國(guó)生物工程雜志, 2013, 33(5): 93-99.

YANG Q,YIN J J, WANG Y,etal. Clone and expression analysis ofCkLEA4 fromCaraganakorshinskii[J].ChinaBiotechnology, 2013, 33(5): 93-99.

[28]QI X, FRUGIS G,etal.ArabidopsisNAC1 transcription auxin signal downstream of TIR1 to promote lateral root development[J].GenesandDevelopment, 2000. 14(23): 3 024-3 036.

[29]HAN X M, FENG Z Q, XING D D,etal. Two NAC transcription factors fromCaraganaintermediaaltered salt tolerance of the transgenicArabidopsis[J].BMCPlantBiology, 2015, 15, 208-219.

[30]張曉菲,路信,等. 胡楊NAC轉(zhuǎn)錄因子PeNAC045基因的克隆及功能分析[J]. 北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2015, 37(6): 1-10.

ZHANG X F, LU X,etal. Cloning and functional analysis ofPeNAC045 fromPopuluseuphratica[J].JournalofBeijingFoerstryUniversity, 2015, 37(6): 1-10.

[31]QUACH T N, TRAN L S, VALLIYODAN B,etal. Functional analysis of water stress responsive soybeanGmNAC003 andGmNAC004 transcription factors in lateral root development inArabidopsis[J].PLoSOne, 2014, 9(1): 1-12.

[32]QI X, GUO H S, DALLMAN G,etal. SINAT5 promotes ubiquitin-related degradation ofNAC1 to attenuate auxin signals[J].Nature, 2002, 419: 167-170.

[33]GUO H S, QI X, FEI J F,etal. MicroRNA directs mRNA cleavage of the transcriptions factorNAC1 to downregulate auxin signals forArabidopsislateral root development[J].ThePlantCell, 2005, 17: 1 376-1 386.

[34]WANG Y H, DUAN L S, LU M Z,etal. Expression ofNAC1 up-stream regulatory region and its relationship to the lateral root initiation induced by gibberellins and auxins[J].ScienceinChina, 2006, 49(5): 429-435.

[35]HE X J, MU R L, CAO W H,etal.AtNAC2, a transcription factor downstream of ethylene and auxin signaling pathways, is involved in salt stress response and lateral root development[J].PlantJournal, 2005, 44(6): 903-916.

[36]BALAZADEH S, SIDDIQUI H, ALLU A D,etal. A gene regulatory network controlled by the NAC transcription factorANAC092/AtNAC2/ORE1 during salt-promoted senescence[J].PlantJournal, 2010, 62(2): 250-264.

[37]HAO Y J, WEI W,etal. Soybean NAC transcription factors promote abiotic stress tolerance and lateral root formation in transgenic plants[J].PlantJournal, 2011, 68(2): 302-313.

(編輯:宋亞珍)

Cloning and Functional Analysis ofCiNAC1 fromCaraganaintermedia

YUE Junyan, YUE Wenran, YANG Qi, YU Xiumin, YANG Feiyun,WANG Guangxia, LI Guojing, WANG Ruigang, CONG Jingyu*

(Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010018, China)

NACs are one of the largest plant-specific transcription factor families. Members in this family play important roles in growth and abiotic stress responses. In this study, the full-length cDNA sequence ofCiNAC1 fromCaraganaintermediawas cloned by PCR technique. It was 1 066 bp in length. Bioinformatics analysis showed thatCiNAC1 had an open reading frame of 921 bp, encoding 306 amino acids. The calculated molecular weight of CiNAC1 was 34.57 kD and the isoionic point was 8.35. The CiNAC1 protein was a hydrophilic protein which had a conserved NAM domain in the N-terminus. It contained 26 phosphorylation sites and 7 glycosylation sites. Real-time quantitative PCR analysis showed thatCiNAC1 was induced by drought, NaCl, dehydration, and high pH. Localization assays revealed that CiNAC1 localized in the nuclei, consistent with its role as transcription factor. Overexpression ofCiNAC1 promoted the lateral root formation and length of the primary root. These results indicated thatCiNAC1 might be related to response to environmental stress inC.intermedia.

Caraganaintermedia;NAC transcription factors;abiotic stress; functional analysis

1000-4025(2016)07-1285-09

10.7606/j.issn.1000-4025.2016.07.1285

2016-03-31;修改稿收到日期:2016-05-23

內(nèi)蒙古自治區(qū)高等學(xué)校科學(xué)研究項(xiàng)目(NJZY055)；內(nèi)蒙古自治區(qū)科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)(201503004)；內(nèi)蒙古自治區(qū)產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)人才團(tuán)隊(duì)(草原英才工程)

岳俊燕(1990-)，女，在讀碩士研究生，主要從事植物分子生物學(xué)研究。E-mail:Yuejunyan13@163.com

叢靖宇，博士，副教授，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事植物分子生物學(xué)研究。E-mail:congjingyuwyh@163.com

Q785;Q786

A

[11]OOKA H, SATON K, K,etal. Comprehensive analysis of NAC family genes inOryzasativaandArabidopsisthaliana[J].DNARes., 2003, 10: 239-247.