長春新堿誘導白血病MOLT-4細胞凋亡及其機制研究

董如男

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長春新堿誘導白血病MOLT-4細胞凋亡及其機制研究

董如男

目的觀察長春新堿（VCR）對人急性淋巴細胞性白血病MOLT-4細胞促凋亡作用，并探討其作用機制。方法分別用0、0.01、0.02、0.04、0.08μmol/L長春新堿處理MOLT-4細胞，然后用CCK-8法檢測細胞活性，用Hochest33258對細胞核進行染色，用Rhodam ine123對細胞進行染色，檢測線粒體膜電位情況。用caspase 8、9、3抑制劑預處理MOLT-4細胞，檢測caspase8、9、3對細胞活性的影響。結(jié)果長春新堿對細胞活性具有抑制作用，且呈明確的劑量-效應關(guān)系；細胞核染結(jié)果顯示，長春新堿可以促進細胞凋亡，劑量越大，凋亡現(xiàn)像越明顯；同時，長春新堿可以引起細胞線粒體膜電位下降，并發(fā)現(xiàn)caspase 9和3參與了細胞凋亡過程。結(jié)論長春新堿可以促進MOLT-4細胞凋亡，作用機制可能是線粒體膜電位下降，進而誘導caspase 9和3活化而促發(fā)細胞的凋亡。

長春新堿；凋亡；急性淋巴細胞性白血??；MOLT-4細胞

[Abstract]Objective To explore the apoptosis inducing effect of vincristine(VCR)on human acute lymphoblastic leukemia MOLT-4 cells and its mechanisms.Methods MOLT-4 cells were treated with 0,0.01,0.02,0.04,and 0.08μmol/L vincristine, respectively.The cell viabilitywas detected by CCK-8 assay.The nucleiwere stained by Hochest33258,and the cellswere stained by Rhodamine123.The mitochondrial membrane potential was detected.Caspase 8,9,and 3 depressant were used to pretreat MOLT-4 cells,and their effects on cytoactive were detected.Results Vincristine could inhibit the cytoactive and presented definite dose-effect relationship.The nucleistaining indicated that vincristine could promote the apoptosis.The larger the dose was,themore obvious the apoptosis presented.At the same time,vincristine could induce the decrease ofmitochondrialmembrane potential.In addition,itwas discovered caspase 9 and 3 joined the process of apoptosis.Conclusion Vincristine can promote the MOLT-4 cell apoptosis,which may bemediated by mitochondrialmembrane potential decrease that further induce the caspase 9 and 3 activation and cell apoptosis.

[Keywords]vincristine;apoptosis;acute lymphoblastic leukemia;MOLT-4 cell

長春花原產(chǎn)于地中海、印度和南美洲。而在中國，其主要在南方種植，如云南、廣東、廣西等地[1]。長春花是防治癌癥的重要藥物，據(jù)研究發(fā)現(xiàn)，目前已經(jīng)從長春花中提取出100多種生物堿[2]。其中活性較高的主要為長春花堿和長春新堿[3]。而長春新堿是從長春花中提出的很重要的吲哚類生物堿，具有很強的抗癌癥效果，對于尋求適當?shù)姆椒ㄟM行體外抗腫瘤研究具有重要意義[4]。到目前為止，國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，長春新堿對宮頸癌、結(jié)腸癌、乳腺癌等均有一定的抑制生長及誘導調(diào)亡的作用[5]。急性淋巴細胞性白血病是由于原始淋巴細胞及幼稚淋巴細胞在造血組織異常增殖，并浸潤全身各組織臟器的一種造血系統(tǒng)惡性克隆性疾病[6]。兒童與成人均可能發(fā)生，居兒童惡性腫瘤性疾病的首位[7]。因此，尋找一種有效的抗白血病藥物至關(guān)重要。本實驗使用長春新堿來作用于人急性淋巴細胞性白血病MOLT-4細胞，并初步考察其抗腫瘤作用機制。

1　材料與方法

1.1主要材料長春新堿購買于上海華聯(lián)制藥有限公司(批號:050602A)；Cell counting kit-8(CCK-8)購買于日本同仁化學公司；Z-DEVD-FMK（caspase3抑制劑，氟甲基酮）、Z-IETD-FMK（caspase8抑制劑，氟甲基酮）、Z-LEHD-FMK（caspase 9抑制劑，氟甲基酮)和二甲基亞砜(DMSO)均購買于Sigma公司；Hochest33258試劑、Rhodamine123染料購買于碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2主要儀器酶標儀（SpectraMax M5）購買于Molecular Devices公司，激光共聚焦掃描顯微鏡（TCS-SP2）德國leica公司，流式細胞儀（EPIC.SXL）購買于美國Beckman公司。

1.3細胞系與細胞培養(yǎng)MOLT-4細胞來自于美國ATCC細胞庫。細胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于5%CO2、飽和濕度、37℃條件下進行培養(yǎng)。

1.4CCK-8法檢測長春新堿對細胞活性抑制作用取對數(shù)生長期的細胞，倒去原來的培養(yǎng)液，加入胰蛋白酶消化細胞，在顯微鏡下觀察；消化完成后，倒掉胰蛋白酶，加入培養(yǎng)液，并將細胞稀釋成105個/ml的細胞懸液，接種到96孔培養(yǎng)板上，每孔加100μl細胞懸液，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞培養(yǎng)24 h后，向96孔培養(yǎng)板上每個孔中加入不同濃度的長春新堿，每個藥物濃度4個平行孔。置于培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24、48、72 h。然后棄掉舊培養(yǎng)液，向96孔培養(yǎng)板上每個孔中加100μl含10%CCK-8的培養(yǎng)液，然后用微量振蕩器振蕩后，用酶標儀在450 nm檢測波長測定吸光度值，計算抑制率。

2　結(jié)果

2.1長春新堿對細胞生長抑制的作用如表1，CCK-8法測定結(jié)果顯示，0.01～0.08μmol/L的長春新堿分別作用MOLT-4細胞24、48、72 h后，均能抑制細胞的活性，具有劑量-時間依賴關(guān)系。經(jīng)過比較，長春新堿處理24 h后，細胞活性抑制效果不明顯；處理72 h，長春新堿對細胞的毒性太強，因此，選擇48 h作為最佳細胞處理時間，計算得IC50值為0.037μmol/L。因此，選擇0.04μmol/L作為中濃度，0.02和0.08μmol/L分別作為低濃度和高濃度。

表1　不同濃度長春新堿對M0 L T-4細胞生長的抑制作用（n＝4）

2.2共聚焦顯微鏡觀察細胞凋亡情況0.02、0.04、0.08μmol/L低中高3個濃度長春新堿分別處理細胞48 h后，Hochest33258細胞核染色結(jié)果見圖1。低中高濃度的長春新堿均能引起細胞核質(zhì)固縮，并形成凋亡小體。有凋亡小體的細胞被認為是凋亡細胞，經(jīng)過細胞計數(shù)，統(tǒng)計出細胞凋亡率。結(jié)果見圖2，低中高濃度長春新堿引起的細胞凋亡率分別為（35.6±4.1）%、（56.9±5.2）%、（71.6±3.9）%（P＜0.01）。

2.3長春新堿對細胞線粒體膜電位的影響經(jīng)過Rhodamine123染色后，流式細胞儀檢測到低中高濃度的長春新堿引起的線粒體膜電位下降的百分率分別為（21.3±3.6）%、（36.9±4.1）%、（64.5±2.9）%，不同濃度之間比較有統(tǒng)計學差異（P＜0.01）。

2.4caspase8、9、3抑制劑對細胞活性的影響長春新堿處理細胞之前，先用caspase 8、9、3抑制劑預處理細胞，然后用CCK-8法檢測細胞活性，結(jié)果見表2。caspase 8預處理組的細胞活性與同等濃度的長春新堿處理的細胞活性無明顯差異；而caspase 9和3預處理組的細胞活性顯著高于同等濃度的長春新堿處理的細胞活性（P＜0.05）。

圖2　細胞凋亡率檢測與對照組（0μmol/L長春新堿）比較，①P＜0.01

3　討論

長春新堿是夾竹桃科植物長春花中提取出的生物堿，具有良好的抗腫瘤作用[8]。目前其制劑已被作為臨床抗腫瘤藥物。大量研究表明，長春新堿可以抑制體外培養(yǎng)的腫瘤細胞的增殖，并直接殺傷腫瘤細胞[9]。目前國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，某些抗癌藥物中的一些化學基團可以使分子氧還原形成活性氧（比如O2-等），其可以誘導癌細胞凋亡[10]。當細胞內(nèi)活性氧水平過高時，線粒體就會受到活性氧的氧化攻擊，導致線粒體跨膜電位下降，此外還會促進caspase 9蛋白表達的上調(diào)，進而激活下游的caspase家族蛋白，如caspase 3等，促進細胞凋亡，并產(chǎn)生凋亡小體、引起DNA斷裂等一系列凋亡反應[11]。

本課題以MOLT-4細胞為研究對象，考察長春新堿是否也能通過損壞線粒體這條渠道促使細胞凋亡。細胞核染色結(jié)果表明，長春新堿處理細胞后，細胞質(zhì)濃縮，并形成了凋亡小體，這是典型的凋亡現(xiàn)象。Rhodamine123是線粒體膜電位特異性染料，通過流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，長春新堿確實可以引起細胞線粒體膜電位的下降，并且具有濃度依賴性，證實了線粒體參與了長春新堿誘導的細胞凋亡過程。

caspase 8為凋亡外源途徑的經(jīng)典促凋亡蛋白，caspase 9為內(nèi)源凋亡途徑的典型促凋亡蛋白，caspase 3為caspase 8和9的下游凋亡執(zhí)行蛋白。本研究通過caspase 8、9、3的抑制劑來特異性的抑制caspase 8、9、3，發(fā)現(xiàn)抑制caspase 9和3，都能提高長春新堿誘導的細胞凋亡率，而caspase 8抑制劑長春新堿誘導的細胞凋亡沒有明顯影響。因此推測長春新堿誘導的MOLT-4細胞內(nèi)活性氧水平過高，導致線粒體跨膜電位下降并促進caspase 9蛋白表達的上調(diào)，然后激活下游的caspase 3，最終促發(fā)了細胞凋亡。

綜上所述，長春新堿作為一線的抗癌藥物，對人白血病T淋巴MOLT-4細胞具有良好的體外抑制效果，殺死細胞的方式為凋亡，其可能的機制為線粒體膜電位下降引起的內(nèi)源性通路介導的凋亡。這為長春新堿用于人白血病T淋巴癌的治療和研究提供了很好的理論依據(jù)。

表2　caspase8、9、3抑制劑對細胞活性的影響（n＝4）

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Research on apoptosis of leukemia MOLT-4 cells induced by vincristine and itsmechanism

Dong Runan Department of Hematology,Central Hospital ofWeinan City,Weinan,Shaanxi,714000,China

R 733.7

A

1004-0188（2016）03-0278-04

10.3969/j.issn.1004-0188.2016.03.017

714000陜西渭南，渭南市中心醫(yī)院血液科

1.5共聚焦顯微鏡觀察細胞凋亡情況取對數(shù)生長期的細胞，將細胞制成濃度為105個/ml的細胞懸液，接種到共聚焦培養(yǎng)皿中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞培養(yǎng)24 h后，向培養(yǎng)皿中加入不同濃度的長春新堿，每個藥物濃度4個平行皿。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，棄掉舊培養(yǎng)液，加入10μM的Hochest33258染液，在培養(yǎng)箱中孵育30 min，然后用PBS清洗細胞3遍，再用共聚焦顯微鏡觀察細胞核變化，并統(tǒng)計不同形態(tài)細胞核百分率。

1.6流式細胞儀檢測長春新堿對細胞線粒體膜電位的影響取對數(shù)生長期的細胞，將細胞制成濃度為105個/ml的細胞懸液，接種到6孔板中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞培養(yǎng)24 h后，向培養(yǎng)皿中加入不同濃度的長春新堿，每個藥物濃度4個平行孔，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，然后用消化液消化細胞并分散成細胞懸浮液。用5μM的Rhodamine123避光染色10min，再用2000 r/min離心5min，去掉上清液，再用PBS重懸浮細胞，并用200目的尼龍篩過濾細胞，最后上流式細胞儀檢測細胞中Rhodamine123的熒光強度。

1.7caspase抑制劑對細胞生長的影響取對數(shù)生長期的細胞，消化細胞并將細胞稀釋成濃度為105個/m l的細胞懸液，接種到96孔培養(yǎng)板上，每孔加細胞100μl懸液，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞貼壁后，分別加入caspase8、9、3抑制劑預處理3 h，然后去掉舊培養(yǎng)液加入不同濃度的藥物，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。再用CCK-8法檢測細胞活性。

1.8統(tǒng)計學方法所有數(shù)據(jù)采用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件處理。計量資料以表示，組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

圖1共聚焦顯微鏡觀察細胞凋亡情況（×400）
A：對照組；B：0.02μmol/L長春新堿組；C：0.04μmol/L長春新堿組；D：0.08μmol/L長春新堿組

（2015-12-05）