納米脂肪改善裸鼠光老化皮膚質(zhì)地的實(shí)驗(yàn)研究

黃惠真 李偉 許鵬 于倩 張文杰 林曉曦

·論著·

納米脂肪改善裸鼠光老化皮膚質(zhì)地的實(shí)驗(yàn)研究

黃惠真 李偉 許鵬 于倩 張文杰 林曉曦

目的 初步探討納米脂肪改善紫外線誘導(dǎo)的光老化裸鼠皮膚質(zhì)地的作用和機(jī)理，為納米脂肪在臨床中應(yīng)用于皮膚光老化治療提供相關(guān)證據(jù)。方法 選用6～8周齡雌性BALB/c裸鼠18只，分為4組：Control組（不行任何干預(yù)，n＝6），PBSUVB組 （紫外線照射+PBS注射），ADSCs-UVB組 （紫外線照射+ADSCs注射，n＝6），Nanofat-UVB組 （紫外線照射+nanofat注射，n＝6）。注射4周后取材，肉眼觀察各組裸鼠皮膚質(zhì)地；HE和Masson染色分別觀察裸鼠皮膚結(jié)構(gòu)、真皮層厚度和膠原纖維排列情況；免疫組織化學(xué)CD31、Ki-67染色觀察皮膚微血管及細(xì)胞增殖情況。結(jié)果 注射4周后，皮膚大體觀發(fā)現(xiàn)ADSCs-UVB組、Nanofat-UVB組與PBS-UVB組之間未見明顯差異。ADSCs-UVB組、Nanofat-UVB組較PBS-UVB組真皮厚（P＜0.05），且ADSCs-UVB組比Nanofat-UVB組真皮厚（P＜0.05）。ADSCs-UVB組和Nanofat-UVB組均較PBS-UVB組微血管密度高（P＜0.05），ADSCs-UVB組與Nanofat-UVB組間微血管密度無差異（P＞0.05）。ADSCs-UVB組較Nanofat-UVB組表皮細(xì)胞增殖多（P＜0.05），在真皮細(xì)胞增殖上兩組無差異（P＞0.05）。結(jié)論 納米脂肪具有促進(jìn)真皮中膠原生成、微血管密度增加及表皮細(xì)胞增殖的作用。

納米脂肪 脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞 光老化 皮膚質(zhì)地

皮膚光老化（Photoaging Skin）系長(zhǎng)期紫外線輻射引起的皮膚老化［1-2］，主要有激光、化學(xué)剝脫、肉毒毒素、充填劑及外用抗光老化藥物等治療方法，但效果不一［3-4］。自體脂肪屬于活體組織類填充劑，具有來源豐富、易獲取、無排斥反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)。但是，傳統(tǒng)的Coleman脂肪移植法抽取的顆粒脂肪 （Macrofat）直徑較大，只能注射到皮下及深部的組織內(nèi)進(jìn)行容量充填［5-6］，難以進(jìn)行表淺皮內(nèi)注射，限制了其在光老化皮膚治療中的應(yīng)用。Tonnard等［7］將1 mm孔徑抽脂針抽到的微小顆粒脂肪進(jìn)行機(jī)械乳化，得到含有豐富脂肪干細(xì)胞的納米脂肪（Nanofat），并注射至老化的表淺皺紋的皮內(nèi)或皮下，4～6個(gè)月后觀察到注射部位的細(xì)紋及膚質(zhì)均得到明顯改善。當(dāng)前，納米脂肪對(duì)光老化皮膚改善作用的機(jī)制尚不明確，缺乏相關(guān)的組織學(xué)檢測(cè)。因此，我們將納米脂肪注射至紫外線誘導(dǎo)的光老化裸鼠皮下，進(jìn)行納米脂肪改善裸鼠光老化皮膚質(zhì)地的實(shí)驗(yàn)研究。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

6 周齡BALB/c裸鼠24只，體質(zhì)量13～18 g，均為雌性（我院SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心），飼養(yǎng)1周后進(jìn)行光老化皮膚模型制備。

脂肪組織均來源于我科接受脂肪抽吸充填術(shù)的女性（25～40歲），抽吸部位為腹部、大腿。供者無慢性疾病，并知情同意。

主要設(shè)備和器材：1 mm直徑側(cè)孔、5 mm直徑孔徑的抽脂針（金燕醫(yī)療器械制造有限公司）；三通管（ABLE公司，美國(guó)）；熒光顯微鏡（Olympus公司，日本）；HE染色試劑盒 （北京雷根生物技術(shù)有限公司），Masson染色試劑盒（南京森貝伽生物科技有限公司）；CD31抗體 （Santa Cruz，美國(guó)）；Kit-67抗體（Santa Cruz，美國(guó)）。

1.2 構(gòu)建裸鼠光老化皮膚模型

6 只裸鼠為空白對(duì)照組，另18只裸鼠進(jìn)行紫外線UVB照射建立光老化動(dòng)物模型。每周照射5次，共照射8周。第1周每次照射200 sec，即160 mJ/ cm2，第2～4周起每周能量較前一周增加1/3，依次為210 mJ/cm2、280 mJ/cm2、370 mJ/cm2，第5周起維持370 mJ/cm2，至8周時(shí)完成建模。繼續(xù)飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型構(gòu)建。

1.3 ADSCs分離與培養(yǎng)及納米脂肪制備

1.3.1 脂肪抽取

供脂患者局部注射腫脹液麻醉，10 min后分別用特制的側(cè)孔孔徑為1 mm和5 mm的抽脂針連接20 mL注射器，人工負(fù)壓條件下放射狀抽吸，分別得到微小顆粒脂肪和傳統(tǒng)的顆粒脂肪。抽吸后注射器直立靜置，排凈腫脹液后，生理鹽水漂洗2遍備用。其中，微小顆粒脂肪用于納米脂肪制備，顆粒脂肪用于分離培養(yǎng)ADSCs。

1.3.2 ADSCs分離與培養(yǎng)

ADSCs分離及培養(yǎng)方法參照文獻(xiàn)［8］。2 d后可觀察到ADSCs原代細(xì)胞開始貼壁；3 d后換液去掉不貼壁的血細(xì)胞及死細(xì)胞，6～7 d后待原代長(zhǎng)滿90%時(shí)即可進(jìn)行傳代。實(shí)驗(yàn)取第4代細(xì)胞重懸于PBS中備用。

1.3.3 納米脂肪制備

將初步處理后的微小顆粒脂肪經(jīng)孔徑0.5 mm的濾網(wǎng)過濾，隨后將脂肪經(jīng)2個(gè)20 mL注射針筒連接三通管快速對(duì)打30次，機(jī)械乳化，用0.5 mm孔徑的濾網(wǎng)再次過濾，得到的脂肪乳化液即為納米脂肪（圖1）。

1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的構(gòu)建

1.4.1 實(shí)驗(yàn)分組

①Control組：為空白對(duì)照組（n＝6），裸鼠未經(jīng)任何處理；②PBS-UVB組：UVB照射+PBS注射（自身對(duì)照）；③ADSCs-UVB組（n＝6）：UVB照射+ADSCs注射；④Nanofat-UVB實(shí)驗(yàn)組 （n＝6）：UVB照射+Nanofat注射。注射后4周取材。

1.4.2 具體注射部位

注射的裸鼠分左右兩側(cè)上、下背部共4個(gè)注射區(qū)域，每個(gè)區(qū)域?yàn)? cm×1 cm大小。左側(cè)兩個(gè)區(qū)域注射PBS，右側(cè)兩個(gè)區(qū)域注射ADSCs或納米脂肪。

1.4.3 Nanofat-UVB實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物模型制備

①前期我們對(duì)1 cm×1 cm大小區(qū)域納米脂肪的注射量進(jìn)行摸索，參照文獻(xiàn)，注射部位皮膚變成黃白色即可。按照這一標(biāo)準(zhǔn)，裸鼠的每一1 cm×1 cm區(qū)域的注射量為0.2 mL；②裸鼠腹腔注射水合氯醛麻醉并術(shù)前拍照，用標(biāo)尺測(cè)量注射區(qū)域。27G針頭連接1 mL注射器，經(jīng)皮下將納米脂肪注射到裸鼠右側(cè)背部已標(biāo)記好的上、下兩個(gè)區(qū)域，注射層次盡量表淺，每個(gè)區(qū)域注射0.2 mL納米脂肪，進(jìn)針后邊退邊推脂肪乳液，確保均勻注射；③裸鼠左側(cè)背部上、下兩個(gè)區(qū)域分別注射0.2 mL PBS作為自身對(duì)照組。注射后飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物房，4周后取材（圖2）。

1.4.4 ADSCs-UVB實(shí)驗(yàn)對(duì)照組動(dòng)物模型制備

①裸鼠腹腔注射水合氯醛麻醉并術(shù)前拍照，用記號(hào)筆及標(biāo)尺測(cè)量選取左右、上下背部皮膚進(jìn)行標(biāo)記；②第4代ADSCs用PBS重懸成細(xì)胞懸液，用27G針頭連接1 mL注射器，經(jīng)皮下分別注射到裸鼠右側(cè)背部?jī)蓚€(gè)區(qū)域，注射盡量表淺，每個(gè)區(qū)域注射0.2 mL（含1×106個(gè)ADSCs）細(xì)胞懸液，進(jìn)針后邊退邊推，使細(xì)胞懸液在標(biāo)記區(qū)域內(nèi)均勻平鋪；③裸鼠左側(cè)背部上下兩個(gè)區(qū)域分別注射0.2 mL PBS作為自身對(duì)照。注射后飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物房，4周后取材（圖2）。

1.5 大體觀察

觀察各組裸鼠模型注射部位的皮膚變化，包括皮膚質(zhì)地紋理的變化，取材時(shí)同時(shí)觀察皮下血運(yùn)及脂肪吸收情況。

1.6 組織學(xué)觀察

注射后4周取材，4%多聚甲醛固定24 h，石蠟包埋，6 mm厚石蠟切片，HE及Masson染色。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的免疫組化過程，4℃孵育羊抗小鼠CD31抗體過夜，第二天37℃孵育攜過氧化氫酶的羊抗小鼠二抗30 min。隨后在光鏡下DAB顯色液顯色。同時(shí)進(jìn)行Kit-67免疫組化染色，方法同CD31免疫組化染色。

Masson染色：通過顯微鏡自帶量尺，在100倍視野下，以5個(gè)相同間隔距離點(diǎn)測(cè)量真皮厚度，計(jì)算每張切片平均真皮厚度；CD31染色：分別在200倍光鏡下對(duì)每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野拍照，計(jì)數(shù)每張照片中的微血管數(shù)量，取平均值為樣本的微血管數(shù)量；Kit-67染色：分別在400倍光鏡下對(duì)每張石蠟切片隨機(jī)選取5個(gè)視野拍照，分別計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞中陽性細(xì)胞數(shù)（不包括毛囊和皮脂腺增殖的增殖細(xì)胞），PI（Proliferate index，PI）=陽性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)。

1.7 數(shù)據(jù)分析

以SPSS軟件分析比較各組間平均真皮厚度、微血管數(shù)量及PI，均采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 納米脂肪的制備及大體觀Fig.1 Preparation and gross view of nanofat

2 結(jié)果

2.1 裸鼠背部皮膚的外觀

注射后4周，空白組因自然老化而出現(xiàn)皮膚皺褶。ADSCs-UVB組皮膚質(zhì)地與PBS-UVB組相比未見差異。Nanofat-UVB組皮膚注射納米脂肪后即刻，可見皮膚呈黃白色腫脹外觀，注射后1周開始淡化，此后每天逐漸吸收淡化，4周后肉眼仍能隱約看到皮下殘余脂肪。但是皮膚質(zhì)地與左側(cè)UVB-PBS自身對(duì)照組相比，未見明顯差異。

2.2 真皮厚度

空白對(duì)照組、PBS-UVB組、ADSCs-UVB組、Nanofat-UVB組真皮厚度分別為 （233.4±5.39）μm、（161.6±3.63）μm、（212.5±9.0）μm和（181.0±6.47）μm。Nanofat-UVB與PBS-UVB對(duì)照組，ADSCs-UVB組與PBS-UVB對(duì)照組的真皮厚度均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），ADSCs-UVB組與Nanofat-UVB組之間真皮厚度比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）（圖3、5）。

圖2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的構(gòu)建Fig.2 Preparation of experimental animal model

2.3 真皮微血管密度，皮膚細(xì)胞增殖

空白對(duì)照組、PBS-UVB對(duì)照組、ADSCs-UVB組、Nanofat-UVB組每高倍鏡下平均微血管密度分別為（16.3±1.14）、（13.0±0.76）、（17.5±1.51）和（16.0± 1.36）。Nanofat-UVB組、ADSCs-UVB組與PBS-UVB組比較，真皮微血管密度均有明顯差異 （P＜0.05），ADSCs-UVB組與Nanofat-UVB組間無明顯差異（P＞0.05）?？瞻讓?duì)照組、PBS-UVB組、ADSCs-UVB組、Nanofat-UVB組每高倍鏡下真皮平均增殖指數(shù)分別為 （4.15±0.67）、（5.48±1.00）、（5.62±0.82）和（5.77±0.99）。 PBS-UVB組 、ADSCs-UVB組 、Nanofat-UVB組間均無明顯差異（P＞0.05）。每高倍鏡下表皮平均增殖指數(shù)分別為 （41.1±2.44）、（24.4± 2.5）、（37.8±2.0）和 （31.0±1.80），ADSCs-UVB組、Nanofat-UVB組與PBS-UVB組的增殖指數(shù)有顯著差異 （P＜0.05），ADSCs-UVB組與Nanofat-UVB組之間有顯著差異（P＜0.05）（圖4、5）。

圖3 注射后4周各組皮膚HE染色及Masson染色Fig.3 HE and Masson staining in different groups at 4 weeks after injection

圖4 術(shù)后4周各組皮膚CD31，Kit-67免疫組化染色Fig.4 CD31 and Kit-67 staining in different groups at 4 weeks after injection

圖5 術(shù)后4周各組皮膚高倍鏡下真皮厚度，微血管數(shù)量，表皮細(xì)胞增殖指數(shù)Fig.5 Dermal thickness，the number of microvessels and the epidermal proliferate index in different groups at 4 weeks after injection

3 討論

顆粒脂肪移植患者的長(zhǎng)期隨訪發(fā)現(xiàn)，脂肪移植部位皮膚皺紋減輕、彈性增加、毛孔縮小及皮膚色澤變均勻，被認(rèn)為系移植脂肪組織中含有的ADSCs可以分化成不同組織細(xì)胞，進(jìn)而促進(jìn)組織修復(fù)及功能改善［9］。多項(xiàng)創(chuàng)面愈合研究表明，脂肪組織中的ADSCs及其分泌的細(xì)胞因子具有促進(jìn)成纖維細(xì)胞增生、增加膠原合成、抗凋亡、抗氧化等作用［10］。有研究發(fā)現(xiàn)，光老化的治療機(jī)制與傷口愈合的機(jī)制相似，提示了ADSCs具有潛在的抗老化作用。目前已證實(shí)ADSCs具有抗皮膚老化的作用。Kim等［11］將ADSCs注射至光老化無毛小鼠皮下，發(fā)現(xiàn)ADSCs可促進(jìn)無毛小鼠老化皮膚的真皮膠原生成、真皮增厚，認(rèn)為皮下注射ADSCs可作為一種新的治療皮膚光老化的方法。

Tonnard等［7］對(duì)納米脂肪進(jìn)行分離培養(yǎng)得到SVFs的細(xì)胞數(shù)約為等體積的顆粒脂肪的2/3，而SVFs主要干細(xì)胞為脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞，說明納米脂肪仍然存在大量的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，且經(jīng)過CD34+檢測(cè)及誘導(dǎo)分化，證實(shí)這些間充質(zhì)干細(xì)胞的干性完好。高景恒等［12］認(rèn)為，納米脂肪是脂肪組織去除白色脂肪細(xì)胞后的細(xì)胞群，與SVFs是同一性質(zhì)的細(xì)胞群，兩者區(qū)別在于提取方式不同。盡管納米脂肪中的細(xì)胞數(shù)少于SVFs的細(xì)胞群，但兩者均含有ADSCs，即兩者細(xì)胞內(nèi)容是相似的，僅在數(shù)量上存在差異。因此，納米脂肪的應(yīng)用實(shí)際也近似于ADSCs的應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)中，我們將納米脂肪注射至光老化裸鼠模型皮下，注射后4周后觀察到，注射部位真皮增厚，微血管數(shù)量增多且表皮細(xì)胞增殖明顯增多。我們推測(cè)納米脂肪乳液中所含的ADSCs發(fā)揮了改善光老化皮膚的作用。

傳統(tǒng)顆粒脂肪移植作為結(jié)構(gòu)脂肪移植最大的目的是容量充填作用［9］，而納米脂肪制備過程中正常脂肪結(jié)構(gòu)被基本破壞，只能作為非結(jié)構(gòu)脂肪移植的形式應(yīng)用于臨床。Kemalo?lu［13］報(bào)道了1例左小腿創(chuàng)傷后局部組織缺損的女患者，在接受2次失敗的皮膚移植后，第3次進(jìn)行中厚皮片的移植結(jié)合皮下納米脂肪注射。術(shù)后6個(gè)月移植皮片完全存活，未見壞死。推測(cè)納米脂肪中存在的干細(xì)胞促進(jìn)成纖維細(xì)胞的膠原合成及血管內(nèi)皮細(xì)胞的血管生成，進(jìn)而促進(jìn)移植皮片成活。同年，Tamburino等［14］報(bào)道了一位患外陰萎縮性硬化性苔蘚的女性患者，在陰道口及陰蒂附近的皮內(nèi)注射20 mL納米脂肪。10個(gè)月隨訪顯示，病灶皮膚質(zhì)地、大陰唇形態(tài)得到了明顯的恢復(fù)。認(rèn)為這些改善源于納米脂肪中干細(xì)胞的促皮膚再生能力。通過這些臨床應(yīng)用報(bào)道，可以肯定納米脂肪促進(jìn)皮膚再生及功能改善的作用，其作用可能與所含ADSCs密切相關(guān)。

另外，相對(duì)于ADSCs的分離提取培養(yǎng)，納米脂肪則有這些優(yōu)勢(shì)：①獲取簡(jiǎn)單，污染可能性小，可直接應(yīng)用；②不需要培養(yǎng)擴(kuò)增，無培養(yǎng)過程中的污染和致瘤風(fēng)險(xiǎn)；③無培養(yǎng)過程中細(xì)胞干性丟失的可能，保持其增殖和分化的潛能［15-16］。因此，納米脂肪相對(duì)于ADSCs在臨床運(yùn)用中具有更簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、安全、高效的優(yōu)點(diǎn)。

綜上所述，我們推測(cè)納米脂肪改善光老化皮膚質(zhì)地是通過其含有的ADSCs促進(jìn)真皮膠原生成，微血管生成及表皮基底細(xì)胞增殖，更具體的機(jī)制需要進(jìn)一步研究。

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The Improvement of Photoaging Skin Texture on Nude Mouse by Nanofat Grafting

HUANG Huizhen，LI Wei，XU Peng，YU Qian，ZHANG Wenjie，LIN Xiaoxi.Department of Plastic and Reconstructive Surgery，Shanghai Ninth People's Hospital，Shanghai Jiaotong University School of Medicine，Shanghai 200011，China.Corresponding author：LI Wei
（E-mail：liweiboshi@163.com）.

Objection To explore the mechanism of nanofat improving photoaging skin texture of nude mice and to provide related evidence for the clinical application of nanofat on photoaging skin.Methods Eighteen 6-8 weeks female BALB/c nude mice were included and divided into four groups：control group （no intervention，n=6），PBS-UVB group （ultraviolet irradiation+PBS injection），ADSCs-UVB group（ultraviolet irradiation+nanofat injection，n=6），Nanofat-UVB group （ultraviolet irradiation+nanofat injection，n=6）.Four weeks after injection，skin specimens were collected：the skin texture of each group were evaluated by general observation；HE and Masson stain were performed to observe skin structure，dermis thickness and collagen fibers arrangement；immunohistochemistry stain of CD31 and Ki-67 were performed to observe the microvessel density and cell proliferation respectively.Results Four weeks after injection，in terms of skin general observation：ADSCs-UVB group and Nanofat-UVB group showed no obvious difference compared with PBS-UVB group.In terms of dermis thickness：ADSCs-UVB group and Nanofat-UVB group showed obvious thicker dermis than PBS-UVB group （P＜0.05）and ADSCs-UVB group showed thicker dermis than Nanofat-UVB group （P＜0.05）.In terms of dermis microvessel density：ADSCs-UVB group and Nanofat-UVB group showed higher microvessel density than PBS-UVB group （P＜0.05），there was no difference between ADSCs-UVB group and Nanofat-UVB group （P＞0.05）.In terms of cells proliferation：ADSCs-UVB group showed more increased epidermic cells proliferation than Nanofat-UVB group （P＜0.05），the two groups showed no difference of dermis cells proliferation（P＞0.05）.Conclusion Nanofat have the ability to improve dermis collagen generation，microvessel density multiplication and epidermic cells proliferation.

Nanofat；Adipose-derived mesenchymal stem cells；Photoaging；Skin texture

R622

A

1673－0364（2016）04－0212－05

10.3969/j.issn.1673-0364.2016.04.002

國(guó)家自然科學(xué)基金（81071565）。

200011 上海市 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院整復(fù)外科。

李偉（E-mail：liweiboshi@163.com）。

（2016年5月20日；

2016年7月2日）