程序性死亡4基因在食管鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)及意義

方　明，張榮新，朱金海

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·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)·

程序性死亡4基因在食管鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)及意義

方明1，張榮新2，朱金海3

目的：通過測定食管鱗狀細(xì)胞癌(食管鱗癌)患者腫瘤組織中程序性死亡4基因(Pdcd4)的表達(dá)，探討Pdcd4與食管鱗癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系。方法：應(yīng)用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測60例食管鱗癌組織中Pdcd4 mRNA的表達(dá)情況，同時應(yīng)用免疫組織化學(xué)法檢測石蠟包埋的178例食管鱗癌組織中Pdcd4的表達(dá)水平，相應(yīng)的癌旁正常組織作為對照。結(jié)果：Pdcd4 mRNA在食管鱗癌組織中的表達(dá)量顯著低于癌旁正常組織(P<0.01)。Pdcd4在癌旁正常組織中的陽性表達(dá)率為100.0%，明顯高于食管鱗癌組織中的47.2%(P<0.01)。Pdcd4的表達(dá)與腫瘤的分化程度有關(guān)，在高分化食管鱗癌的陽性率為71.4%，中分化食管鱗癌的陽性率為43.4%，低分化食管鱗癌的陽性率為30.2%，高分化鱗癌中Pdcd4陽性率高于中分化及低分化癌(P<0.01)；中、低分化食管鱗癌中Pdcd4陽性率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；Pdcd4陽性率在患者的年齡、腫瘤大小、TNM分期和N分期間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論：Pdcd4異常表達(dá)與食管鱗癌的組織病理分級有關(guān)。

食管腫瘤；程序性死亡4基因；免疫組織化學(xué)；實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)

程序性死亡4基因(Pdcd4)作為控制細(xì)胞凋亡的重要因子,是SHIBAHARA等[1]首先在小鼠體內(nèi)克隆到的MA-3基因，該小鼠基因長約21 kb,有11個外顯子，為單拷貝。人類Pdcd4基因定位于染色體10q24,相對分子質(zhì)量約64 000,蛋白序列編碼485個氨基酸[2]，含有表示氨基端和羧基端核定位信號的基本區(qū)域。Pdcd4不僅影響了細(xì)胞程序性死亡，而且通過抑制蛋白翻譯的起始因子抑制腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。Pdcd4在食管鱗狀細(xì)胞癌(食管鱗癌)中表達(dá)明顯下調(diào)或缺失，并且與腫瘤的分化程度、腫瘤大小、浸潤深度、淋巴道轉(zhuǎn)移、血道轉(zhuǎn)移相關(guān)。本研究選用食管鱗癌標(biāo)本作為研究對象，通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)及免疫組織化學(xué)法分別從mRNA和蛋白水平上檢測Pdcd4在食管鱗癌組織中的表達(dá)水平，探討Pdcd4基因在食管鱗癌發(fā)生、發(fā)展過程中的作用?，F(xiàn)作報道。

1　材料與方法

1.1一般資料選取蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院2011年10月至2012年6月腫瘤外科手術(shù)切除新鮮食管鱗癌組織標(biāo)本60例；其中男36例，女24例；年齡46～79歲；均經(jīng)術(shù)后病理證實為食管鱗癌，術(shù)前均未接受放、化療；相應(yīng)的癌旁正常組織作為對照。所有標(biāo)本在離體30 min內(nèi)經(jīng)液氮速凍后置入經(jīng)去酶處理的凍存管中，并放入-80 ℃冰箱中凍存?zhèn)溆?。同時從蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院臨床病理科收集2010年1月至2010年6月178例石蠟包埋的食管鱗癌組織；其中男103例，女75例；年齡48～82歲；相應(yīng)癌旁正常組織作為對照。

1.2主要試劑免疫組織化學(xué)EliVision法檢測Pdcd4的表達(dá)，試劑兔抗人Pdcd4 Ab和抗兔二抗均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；抗體稀釋液胎牛血清由蚌埠醫(yī)學(xué)院病理實驗室提供，液體DAB酶底物顯色試劑盒購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司，無水乙醇、二甲苯、PBS緩沖液、抗原修復(fù)液0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液(pH 6.0，枸櫞酸三鈉3 g，枸櫞酸0.4 g)由蚌埠醫(yī)學(xué)院病理實驗室提供。Trizol(RNA提取試劑)和PCR試劑盒購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行，Pdcd4引物設(shè)計由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行；SyBR、Dye、溴酚藍(lán)、瓊脂糖、溴化乙錠(EB)購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；焦炭酸二乙酯(DEPC)、三氯甲烷、異丙醇、乙醇去RNA酶水、超純水由蚌埠醫(yī)學(xué)院病理實驗室提供。

1.3方法

1.3.1PCR方法采用在線Primer3引物設(shè)計軟件設(shè)計SYBR Green Ⅰ實時熒光定量PCR擴(kuò)增Pdcd4引物序列,上游引物：5′ AAA GGG AAG GTT GCT GGA TAG 3′，下游引物：5′ CAC ATC CAC CTC CTC CAC AT 3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長度130 bp。內(nèi)參GAPDH 引物序列，上游引物：5′ TGG GTG TGA ACC ATG AGA AGT 3′，下游引物：5′ TGA GTC CTT CCA CGA TAC CAA 3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長度1 126 bp。

采用Trizol法提取食管鱗癌組織和癌旁正常組織RNA，經(jīng)紫外分光光度計測定并采用2.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定總RNA質(zhì)量。按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA，逆轉(zhuǎn)錄的cDNA用于PCR反應(yīng)；反應(yīng)條件：預(yù)變性 95 ℃ 2 min，變性95 ℃ 10 s，退火/延伸60 ℃ 40 s，共40個循環(huán)；擴(kuò)增完畢后進(jìn)行融解曲線分析，并觀察其是否為單峰曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增情況繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，檢測擴(kuò)增效率。PCR結(jié)果表示：以GAPDH為內(nèi)參基因，用在食管鱗癌組織及癌旁正常組織中的CT值與GAPDH的CT值相減，求出ΔCT值，目的基因Pdcd4的表達(dá)量=2-△△CT，比較Pdcd4 mRNA在食管鱗癌組織與癌旁正常食管組織中表達(dá)的差異。

1.3.2免疫組織化學(xué)方法按試劑盒說明操作。根據(jù)著色程度和陽性細(xì)胞總數(shù)判定，Pdcd4蛋白在正常食管組織中大多數(shù)以細(xì)胞核中呈不同染色程度的棕黃色顆粒為特點，少數(shù)位于細(xì)胞質(zhì)，而在食管癌組織中細(xì)胞核著色明顯下降并有向細(xì)胞質(zhì)中轉(zhuǎn)移的傾向。每張切片隨機(jī)觀察10個高倍視野(×400)，每個高倍視野計數(shù)100個癌細(xì)胞，計陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。沒有或<30%的陽性細(xì)胞記為陰性；≥30%記為陽性[3]。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法采用χ2檢驗及配對t檢驗及秩和檢驗。

2　結(jié)果

2.1食管正常組織和鱗癌組織Pdcd4相對定量結(jié)果比較癌旁正常組織中的Pdcd4 mRNA含量明顯高于食管鱗癌組織中的含量(P<0.01)(見表1)。

2.2免疫組織化學(xué)結(jié)果比較178例癌旁正常組織Pdcd4陽性率為100.0%；Pdcd4在食管鱗癌組織中表達(dá)較少，陽性率為47.2%。Pdcd4在癌旁組織中的陽性率顯著高于食管鱗癌組織(P<0.01)(見表2，圖1、2)。在食管鱗癌組織中，高分化鱗癌中Pdcd4陽性率均明顯高于中分化和低分化鱗癌(P<0.01)(見表3，圖3、4)。Pdcd4陽性率在患者的年齡、性別、腫瘤大小、TNM分期和N分期間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05) (見表4)。

表2食管鱗癌和癌旁正常組織Pdcd4免疫組織化學(xué)結(jié)果比較(n)

表3　食管鱗癌組織病理分級與Pdcd4表達(dá)的關(guān)系

率的兩兩比較：與高分化比較**P<0.01

表4　食管鱗癌臨床病理特征與Pdcd4表達(dá)的關(guān)系

*示Hc值

3　討論

細(xì)胞凋亡是維持細(xì)胞生理性過程和機(jī)體穩(wěn)定的重要形式。Pdcd4是近年來發(fā)現(xiàn)的一種腫瘤抑制因子，可與真核細(xì)胞翻譯起始復(fù)合物中的翻譯起始因子A(eIF4A)相互作用，通過eIF4A的解螺旋酶活性并且與eIF4G結(jié)合，從而抑制與細(xì)胞增殖有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子合成[4]。近年來有學(xué)者[5-6]認(rèn)為Pdcd4對腫瘤的抑制作用主要通過抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)錄和翻譯過程而實現(xiàn)。

食管癌作為危害人類健康較為嚴(yán)重的惡性腫瘤，其發(fā)生是多基因、多階段、多因素共同參與下的復(fù)雜過程，其中包括癌基因的激活和抑癌基因的下調(diào)和滅活，以及細(xì)胞凋亡和增殖調(diào)節(jié)失控等。本實驗應(yīng)用免疫組織化學(xué)法檢測石蠟包埋的178例食管鱗癌組織和相應(yīng)的178例癌旁正常組織中Pdcd4的表達(dá)水平，結(jié)果顯示Pdcd4在癌旁正常組織中的陽性率為100.0%，明顯高于食管鱗癌組織中的47.2%，這與FASSAN等[7]的相關(guān)研究基本一致，提示Pdcd4對食管鱗癌的發(fā)生有一定影響。WEDEKEN等[8]對Pdcd4是通過何種通道及機(jī)制影響食管鱗癌發(fā)生作了相應(yīng)研究，提示Pdcd4基因通過該5′端的非編碼區(qū)功能域與真核細(xì)胞翻譯起始因子eIF4A發(fā)生結(jié)合，通過封閉eIF4A解螺旋酶活性從而抑制p53 mRNA以及核糖體復(fù)合物和蛋白質(zhì)的合成，達(dá)到抑制細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)化的目的。microRNA-21在腫瘤中的作用近年來被逐漸公認(rèn)，microRNA-21是通過Pdcd4靶基因而起作用[9]，microRNA-499-5p通過Pdcd4靶基因而起作用影響結(jié)直腸癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移[10]。因此我們認(rèn)為Pdcd4在食管組織中的水平對腫瘤的發(fā)生起一定的作用，低水平的Pdcd4促使腫瘤的形成，而高水平的Pdcd4有預(yù)防腫瘤的作用。

腫瘤臨床分期不僅可以指導(dǎo)臨床治療而且是影響腫瘤預(yù)后的重要因素。本實驗發(fā)現(xiàn)Pdcd4在食管鱗癌臨床TNM分期中表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，與FASSAN等[7]的研究結(jié)果相反，究其原因可能與臨床病例分期選擇差異有關(guān)。本研究通過免疫組織化學(xué)法檢測不同病理分化程度食管鱗癌組織中Pdcd4的表達(dá)，結(jié)果提示高分化鱗癌中Pdcd4的表達(dá)均高于中分化及低分化癌(P<0.01)；但中、低分化食管鱗癌中Pdcd4的差異無統(tǒng)計學(xué)意義，與FASSAN等[7]的結(jié)果不一致，這可能與分級標(biāo)準(zhǔn)選擇的差異以及東西方人基因表達(dá)差異有關(guān)。

SIEWERT等[11]分析認(rèn)為，腫瘤細(xì)胞分化程度是食管癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的一個獨立影響因子，腫瘤細(xì)胞的分化程度越低，其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率越高。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響食管鱗癌預(yù)后的重要因素，新分期對N分級的改變體現(xiàn)在將原先的有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移根據(jù)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目細(xì)化為N0～N34個等級，臨床研究[12]表明淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目與食管鱗癌生存期呈負(fù)相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)食管鱗癌N0、N1、N2、N3中Pdcd4蛋白的表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，與FASSAN等[7]的結(jié)果有差異，這可能與新的食管鱗癌分期中N分級的變化有關(guān)，新分期中只是注重淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目而沒有區(qū)分淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移部位及頻度；也有可能與東西方人基因表達(dá)差異有關(guān)。

綜上，我們的實驗證明Pdcd4在食管鱗癌發(fā)生中的作用是肯定的，并且在不同分化程度腫瘤中表達(dá)存在差異。至于在腫瘤不同分期中的表達(dá)差異目前國內(nèi)外的研究尚無共識，仍有大量的研究及工作要做。

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(本文編輯劉夢楠)

Expression of programmed cell death 4 gene in esophageal squamous cell carcinoma and its significance

FANG Ming1,ZHANG Rong-xin2,ZHU Jin-hai3

(1.DepartmentofGeneralSurgery,TheFirstPeople′sHospitalofWuhu,WuhuAnhui241000;2.DepartmentofSurgicalOncology,AnhuiProvincialTumorHospital,HefeiAnhui230000;3.DepartmentofSurgicalOncology,TheFirstAffiliatedHospitalofBengbuMedicalCollege,BengbuAnhui233004,China)

Objective:To explore the expression of programmed cell death 4(Pdcd4) gene in esophageal squamous cell carcinoma,and relationship between the expression level of Pdcd4 and occurrence and development of tumor.Methods:The expressions of Pdcd4 mRNA in 60 esophageal squamous cell carcinoma tissues and adjacent normal tissue were detected by real-time polymerase chain reaction,and the expressions of Pdcd4 protein in 178 esophageal squamous cell carcinoma tissues and adjacent normal tissue were detected by immunohistochemical method.Results:The expression of Pdcd4 mRNA in esophageal squamous cell carcinoma tissue were significantly lower than that in adjacent normal tissue(P<0.01).The positive expression rate of Pdcd4 in esophageal squamous cell carcinoma tissue(47.2%) were significantly lower than that in adjacent normal tissue(100.0%)(P<0.01).The expression of Pdcd4 was correlation with tumor differentiation,the positive expression rates of Pdcd4 in high,moderate and low differentiation esophageal squamous cell carcinoma tissue were 71.4%,43.4% and 30.2%,respectively.The positive expression rate of Pdcd4 in high differentiation esophageal squamous cell carcinoma tissue was higher than that in moderate and low differentiation esophageal squamous cell carcinoma tissue,the difference of the positive expression rate of Pdcd4 between moderate and low differentiation esophageal squamous cell carcinoma was not statistically significant(P>0.05).The difference of the positive expression rate of Pdcd4 between age of patient,tumor size,TNM staging and N staging were not statistically significant(P>0.05).Conclusions:The abnormal expression of Pdcd4 is correlation with the occurrence and development of esophageal squamous cell carcinoma.

esophageal neoplasms;programmed cell death 4;immunohistochemical;real time polymerase chain reaction

2014-08-14

單位] 1.安徽省蕪湖市第一人民醫(yī)院 普外科，241000；2.安徽省腫瘤醫(yī)院 腫瘤外科，安徽 合肥 230000；3.蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 腫瘤外科，安徽 蚌埠 233004

[作者簡介] 方明(1979-)，男，碩士，主治醫(yī)師.

張榮新，碩士研究生導(dǎo)師，主任醫(yī)師，教授.E-mail：zrx13855219010@126.com

1000-2200(2016)05-0570-04

R 735.1

A

10.13898/j.cnki.issn.1000-2200.2016.05.004