乳腺癌Jab1蛋白調(diào)控Nov基因的表達受甲基化水平影響

王順妮,陳紅巖,葉曉娟,閔太善,盧大儒,陳浩明

(1. 復旦大學 生命科學學院,上海 200438； 2. 復旦大學 遺傳工程國家重點實驗室,上海 200438；3. 復旦大學 現(xiàn)代人類學教育部重點實驗室,上海 200438)

?

乳腺癌Jab1蛋白調(diào)控Nov基因的表達受甲基化水平影響

王順妮1,2,3,陳紅巖1,2,3,葉曉娟1,2,3,閔太善1,2,3,盧大儒1,2,3,陳浩明1,2,3

(1. 復旦大學 生命科學學院,上海 200438； 2. 復旦大學 遺傳工程國家重點實驗室,上海 200438；3. 復旦大學 現(xiàn)代人類學教育部重點實驗室,上海 200438)

為探討癌基因Jab1在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的功能,首先在乳腺癌細胞MDA231中建立了慢病毒介導的Jab1基因的表達干擾系統(tǒng),并通過人基因表達譜芯片分析結(jié)果以及實時定量PCR實驗篩選出受Jab1調(diào)控的下游基因；此外,通過實時定量PCR以及Western blot實驗證實Jab1干擾表達能降低Nov基因在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平表達,而且Nov啟動子區(qū)域存在4個高甲基化CpG位點.進一步使用甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑處理Jab1干擾表達細胞,發(fā)現(xiàn)與未使用抑制劑處理細胞相比,Nov基因的mRNA和蛋白質(zhì)表達水平發(fā)生明顯上調(diào),說明Jab1基因調(diào)控Nov表達受甲基化水平的影響,提示Jab1可能是通過表觀遺傳學水平調(diào)控Nov基因的表達.

乳腺癌； Jab1； 甲基化；Nov

乳腺癌高居女性惡性腫瘤的首位,全世界范圍內(nèi)每年約有120萬新發(fā)乳腺癌病例,嚴重威脅著女性健康.Jab1也稱為c-Jun激活結(jié)構(gòu)域結(jié)合蛋白-1(c-Jun activation domain binding protein 1),同時也是COP9信號復合體的第5個亞單位(CSN5)[1].COP9信號復合體(CSN)是一個復雜保守的蛋白質(zhì),包含8個亞基,即CSN1～CSN8[2].CSN在多種真核動物和植物中都表達,并參與多種生物學過程[3-4].Jab1是一種重要的原癌蛋白,只存在于真核生物中,能夠從復合體中脫離開單獨進行作用并行使其功能[5-6],很多研究表明Jab1在多種癌癥病人樣本中都有過表達的現(xiàn)象,包括乳腺癌、腦垂體瘤、胰腺癌和肺癌[7-12]等,因此進一步深入揭示Jab1在腫瘤細胞中的分子機制顯得尤為重要.

Nov(Nephroblastoma overexpressed),又稱CCN3,是CCN家族中的成員之一,其在多個器官的發(fā)育和分化中起重要作用[13].Nov的異常表達常見于腫瘤中,并與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及浸潤有關.在多數(shù)腫瘤中,Nov起負調(diào)節(jié)作用,能夠促進腫瘤細胞的分化,抑制腫瘤細胞的增殖；但在個別腫瘤,例如前列腺癌、腎細胞癌等癌癥中,Nov反而能夠促進腫瘤細胞的增殖和轉(zhuǎn)移[14].以上結(jié)果提示我們Nov在腫瘤中具有重要作用.

在腫瘤形成過程中,表觀遺傳學機制的作用越來越受到重視.其中一個重要機制就是DNA甲基化.研究表明,異常的DNA甲基化可以出現(xiàn)在腫瘤發(fā)生和發(fā)展的各個階段[15-17].

在本次研究中,通過攜帶相應shRNA片段的慢病毒感染乳腺癌細胞系MDA231后篩選到Jab1調(diào)控的下游基因Nov,并從表觀遺傳學的水平初步探索了Jab1調(diào)控Nov基因的可能分子機制.

1　材料和方法

1.1材料

人源胚胎腎細胞(Human Embryonic Kidney, HEK)293T、人乳腺癌細胞MDA231、慢病毒包裝相關質(zhì)粒均為本實驗室保存；DMSO試劑購自上海試劑廠；Lipofetamin 2000轉(zhuǎn)染試劑、TRIzol試劑購自Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄以及定量PCR試劑購自Toyobo公司；RIPA裂解液、一抗稀釋液以及HRP標記的Western blot二抗購自碧云天生物研究所；人表達譜芯片購自上海博奧生物有限公司；Jab1一抗購自Thermo公司；β-actin、Nov一抗購自Cell Signaling公司；Polybrene粉末試劑購自Sigma公司；PVDF膜購自Millipore公司；細胞培養(yǎng)相關培養(yǎng)基、血清以及雙抗均購自Gibco公司；5-氮雜-2′-脫氧胞苷(5′-aza-dC)購自上海研域生物科技有限公司,DNA甲基化檢測試劑盒購自上海銳賽生物技術有限公司.

1.2細胞培養(yǎng)

293T、MDA231細胞培養(yǎng)使用DMEM高糖培養(yǎng)基,完全培養(yǎng)基中含有10% 胎牛血清以及青霉素(100U/mL)-鏈霉素(100μg/mL)雙抗；培養(yǎng)于37℃、含5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng).

1.3慢病毒包裝

Jab1對應的干擾慢病毒shRNA序列為: Jab1sh2: 5′-GCACTGAAACCCGAGTAAATG-3′,Jab1sh5: 5′-GCTTGAGCTGTTGTGGAATAA-3′；對照組慢病毒shRNA序列: shLuc: 5′-CGTACG CGGAATACTTCGA-3′,分別克隆到pCDH-copGFP慢病毒表達載體中.

慢病毒包裝時將各種慢病毒主質(zhì)粒分別和3種輔助質(zhì)粒PLP1、PLP2以及VSVG按質(zhì)量比3∶1∶1∶1 混合后轉(zhuǎn)染至293T細胞中,8h后換液,48h后收集病毒上清,2000r/min離心10min后用0.45μm 濾器過濾并分裝后凍存于-80℃冰箱；感染時,取1mL慢病毒加入到含有10%細胞的六孔板中,加入1mL DMEM高糖完全培養(yǎng)基,并加入終濃度為3μg/mL的Polybrene溶液.

1.4抽提細胞總RNA

經(jīng)過慢病毒感染的細胞棄去培養(yǎng)基后使用PBS將培養(yǎng)基洗干凈,加入TRIzol裂解液后將細胞置于冰上裂解10min,加入三氯甲烷震蕩靜置,分層后冷凍離心取上層,加入等量異丙醇充分混勻后冷凍離心去上清,加入75%乙醇洗滌沉淀后加入適量DEPC水,凍于-80℃冰箱.

1.5實時定量PCR

定量PCR在ABI公司7900HT定量PCR儀上進行,結(jié)果由配套的SDS2.4軟件進行分析,GAPDH基因作為內(nèi)參基因,實驗進行3組重復；GAPDH上游引物: 5′-ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3′,GAPDH下游引物: 5′-GCCATCACGCCACAGTTTC-3′；Jab1上游引物: 5′-GCAATCGGGTGGTAT CATAGC-3′,Jab1下游引物5′-GCAATCGGGTGGTATCATAGC-3′；Nov上游引物: 5′-TGCGGATA TTGTTCTTGTTGGA-3′,Nov下游引物: 5′-ATTGACGGTTCCTATTGGTGAC-3′.

1.6Western blot

經(jīng)過慢病毒感染的細胞棄去培養(yǎng)基后使用PBS將培養(yǎng)基洗干凈,加入RIPA裂解液將細胞置于冰上裂解30min,冷凍離心取上清,BCA定量后將各蛋白質(zhì)裂解液用RIPA裂解液調(diào)整至統(tǒng)一濃度,加入適量上樣緩沖液,煮沸10min后,取20μL進行SDS-PAGE電泳,電泳結(jié)束后200mA恒流轉(zhuǎn)膜2h至孔徑0.22μm 的PVDF膜,使用5%脫脂奶粉封閉1h,一抗(各抗體按照1∶103稀釋)室溫搖床孵育2h,相應二抗(1∶103稀釋)室溫搖床孵育1h,基因科技(上海)有限公司G-BOX顯影儀顯影拍照.

1.7熒光顯微鏡觀察

Leica公司倒置熒光顯微鏡觀察細胞,使用藍色激發(fā)光觀察綠色熒光,在200倍放大條件下選取適當視野、適當曝光時間進行拍照,保存照片.

1.85′-aza-dC處理細胞

消化對數(shù)生長期細胞鋪于細胞培養(yǎng)皿中,按照1∶103的比例加入5′-aza-dC于細胞中,根據(jù)細胞生長情況進行換液,生長至合適密度后抽提總RNA及總蛋白質(zhì).

1.9甲基化檢測和甲基化程度計算

使用shLuc、Jab1sh2和Jab1sh5慢病毒感染細胞,根據(jù)DNA甲基化檢測試劑盒步驟處理細胞后進行PCR擴增反應,并回收PCR產(chǎn)物進行測序.在基因組DNA中,由于非甲基化的胞嘧啶(C)經(jīng)過亞硫酸氫鹽處理與PCR擴增后會轉(zhuǎn)變?yōu)樾叵汆奏?T)；全部發(fā)生甲基化的“C”經(jīng)過亞硫酸氫鹽處理與 PCR 擴增后仍然為“C”；而部分發(fā)生甲基化的“C”堿基經(jīng)過處理后會呈現(xiàn)出“C”和“T”疊加的情況(圖1).前期的研究發(fā)現(xiàn)通過計算測序峰圖中的“C”的峰高與“C”及“T”峰高之和的比值可以得出每個 CpG 位點的甲基化比例,公式如下所示:

甲基化程度=甲基化峰高/(甲基化峰高+非甲基化峰高)×100%

1.10數(shù)據(jù)處理

2　結(jié)　果

2.1慢病毒介導的Jab1基因的shRNA干擾

用制備的對照慢病毒(shLuc)和Jab1基因的shRNA干擾慢病毒(Jab1sh2和Jab1sh5)分別感染MDA231細胞,120h后使用熒光顯微鏡觀察慢病毒干擾表達情況,并抽提相應細胞總蛋白質(zhì),進行Western blot實驗,檢測細胞內(nèi)Jab1基因的表達水平(圖2).可見光視野和熒光視野的對比結(jié)果表明(圖2(a)),高于80%的細胞具有不同程度的GFP熒光強度,說明shLuc、Jab1sh2和Jab1sh5慢病毒對MDA231細胞的感染率高.Western blot檢測結(jié)果表明,在蛋白質(zhì)水平上Jab1基因的shRNA慢病毒干擾細胞組中的Jab1表達量顯著低于對照組(圖2(b)).以上結(jié)果表明,慢病毒介導的shRNA干擾使得MDA231細胞中Jab1基因的表達顯著下調(diào),乳腺癌細胞MDA231中Jab1表達干擾系統(tǒng)構(gòu)建成功.

2.2Jab1表達干擾后人表達譜芯片篩選

使用shLuc、Jab1sh2和Jab1sh5慢病毒感染MDA231細胞后,抽提RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA后使用Illumina Bead Chip Human HF12-V4型芯片檢測,總共測定1600個基因,之后根據(jù)表達差異顯著程度以及基因功能篩選出了表達差異顯著并且與細胞增殖遷移等相關的候選基因,包括Nov、CSF2以及DEK等,篩選結(jié)果如表1所示.

表1　MDA231細胞感染慢病毒后表達譜篩選結(jié)果

根據(jù)表達譜芯片篩選結(jié)果,進一步使用實時定量PCR驗證了上述候選基因轉(zhuǎn)錄水平表達變化情況,結(jié)果如圖3所示,在Jab1低表達(P<0.001)時Nov基因的mRNA水平發(fā)生了明顯下調(diào),并具有統(tǒng)計學差異(P<0.001). 根據(jù)已有的Nov基因研究報道[18-19],本研究選擇了Nov基因作為Jab1調(diào)控的下游基因進一步研究.

2.3Jab1干擾表達能夠下調(diào)Nov基因表達

本研究進一步對Jab1干擾表達后Nov的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平進行了檢測.實時定量PCR結(jié)果表明,(圖4(a)),Jab1表達干擾組相較于對照組細胞Jab1基因mRNA水平顯著下調(diào),同時,Nov基因mRNA表達水平也相應下調(diào),統(tǒng)計結(jié)果表明Jab1表達干擾組和對照組相比,Nov的mRNA表達水平均具有極顯著性差異(P<0.01).如圖4(b)所示,隨著MDA231細胞中Jab1蛋白表達量下降,Nov蛋白表達水平也顯著下調(diào)(以β-actin作為內(nèi)參),表明Jab1可在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平調(diào)控Nov基因的表達.

2.4Nov啟動子CpG位點分析

DNA甲基化是常見的表觀遺傳修飾,一般多發(fā)生于CpG雙核苷酸部位或CpG島區(qū)域.已有研究表明腫瘤中許多重要功能基因的DNA甲基化水平存在明顯的異常[20],進而影響基因的表達.

為進一步研究Jab1是通過何種機制調(diào)控Nov的表達,本研究對于Nov啟動子3000bp 區(qū)域進行了在線CpG位點分析(www.urogene.org),結(jié)果如圖5所示,啟動子區(qū)域存在多個CpG位點和一個CpG島,說明Jab1有可能會通過調(diào)控Nov基因啟動子甲基化程度進而調(diào)節(jié)Nov的轉(zhuǎn)錄翻譯表達.

于是使用DNA甲基化檢測試劑盒檢測了Nov基因可能轉(zhuǎn)錄起始位點區(qū)域(-120～+150)序列(通過網(wǎng)站http: ∥promotor.biosino.org/預測)有4個CpG位點的甲基化程度顯著高于對照組,表示這四個CpG位點的高甲基化可能與Nov在乳腺癌細胞中受Jab1蛋白調(diào)控有關.

2.55′-aza-dC對Nov基因表達的影響

為進一步研究Jab1是否會影響Nov基因的DNA甲基化,本研究使用甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑5′-aza-dC分別處理Jab1干擾表達實驗組和shLuc對照組,生長至合適密度后抽取總RNA和總蛋白質(zhì)進行了實時定量PCR以及Western blot實驗.5′-aza-dC可以直接作用于DNA上,抑制DNA甲基轉(zhuǎn)移酶,使DNA甲基化水平降低.5′-aza-dC處理細胞后,Nov的轉(zhuǎn)錄水平增加(以DMSO為對照),并且具有統(tǒng)計學上的顯著性差異(P<0.05),結(jié)果如圖6(a)所示.Western blot檢測結(jié)果(圖6(b))顯示,5′-aza-dC處理Jab1干擾表達實驗組和shLuc對照組后,Nov的表達水平相對于未加5′-aza-dC(DMSO組)發(fā)生了上調(diào),表明甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑能增加Nov的表達,使用5′-aza-dC處理后Nov的表達從顯著下調(diào)變?yōu)榱私M間表達基本無差異,說明Jab1基因調(diào)控Nov的表達受甲基化水平的影響.

3　討　論

已有研究表明,原癌蛋白Jab1對于多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有重要作用,并且因Jab1對腫瘤抑制子的降解能力使得其也參與了其他細胞進程,例如細胞增殖、凋亡、血管增生等[21-23].而這些作用也正是將它和腫瘤的發(fā)生發(fā)展、不良預后和化療抵抗等聯(lián)系起來的重要原因.Jab1位于人染色體8q13.1,這個區(qū)域已有研究發(fā)現(xiàn)在乳腺癌、前列腺癌、大腸癌和子宮癌中具有過度擴增的現(xiàn)象,而且Jab1與具有侵染性和遷移性的癌癥發(fā)生都有相關性[24-28].Nov作為CCN家族中的重要成員參與多種生理過程和病理過程,先前有研究報道Nov的異常表達常見于腫瘤中并且受到多種因素的調(diào)控,存在時間和空間特異性[19],例如在鳥視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞中BMP信號通路激活后可誘導Nov基因的表達,而Notch信號通路則能夠降低Nov的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平.以上結(jié)果提示Nov在癌癥中的作用和相關生物學功能也越來越受到人們的重視.

然而此前還沒有研究揭示Jab1與Nov的調(diào)控關系和分子機制,因此在本次研究中,首先利用shRNA介導的慢病毒感染轉(zhuǎn)移性乳腺癌細胞系MDA231,實現(xiàn)了Jab1基因表達的干擾.再通過人表達譜芯片篩選出一系列可能被Jab1調(diào)控的基因,并通過實時定量PCR發(fā)現(xiàn)Jab1基因的干擾表達能夠使得與細胞增殖相關基因Nov在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上都發(fā)生顯著下調(diào).

進一步,本研究探討了使用shRNA介導的慢病毒干擾Jab1表達后引起Nov表達變化的機制,通過對Nov基因啟動子分析推測Jab1低表達有可能會引起Nov基因甲基化的異常發(fā)生.使用甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5′-aza-dC處理Jab1干擾表達的乳腺癌細胞系,發(fā)現(xiàn)Jab1基因表達干擾實驗組中Nov基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平表達從原來的下調(diào)變?yōu)榕c對照組間無明顯表達差異,此結(jié)果提示我們Jab1可能是通過表觀遺傳學中的甲基化修飾方式來調(diào)控Nov基因的表達.下一步研究可聚焦在Jab1基因是具體通過調(diào)控Nov啟動子哪個甲基化位點使得Nov基因的mRNA和蛋白質(zhì)表達水平改變,并進一步通過過表達Nov基因的方法研究Nov對于乳腺癌MDA231細胞生長增殖的影響.

[1] ZHOU J, WAN B, LI R,etal. Jab1 interacts with brain-specific kinase 2(BRSK2) and promotes its degradation in the ubiquitin-proteasome pathway [J].BiochemBiophysResCommun, 2012,422(4): 647-652.

[2]YOSHIDA A, YONEDA-KATO N, PANATTONI M.etal. CSN5/Jab1 controls multiple events in the mammalian cell cycle [J].FEBSLett, 2010,584(22): 4545-4552.

[3]STRATMANN J W, GUSMAROLI G. Many jobs for one good cop-the COP9 signalosome guards development and defense [J].PlantSci, 2012,185(4): 50-64.

[4]HUA Z, VIERSTRA R D. The cullin-RING ubiquitin-protein ligases [J].AnnuRevPlantBiol, 2010,62: 299-334.

[5]KOTIGUDA G G, WEINBERG D, DESSAU M,etal. The organization of a CSN5-containing subcomplex of the COP9 signalosome [J].JBiolChem, 2012,287(50): 42031-42041.

[6]SHARON M, MAO H, STEPHENS E,etal. Symmetrical modularity of the COP9 signalosome complex suggests its multifunctionality [J].Structure, 2009,17(1): 31-40.

[7]CAYLI S, EYIBILEN A, GURBUZLER L,etal. Jab1 expression is associated with TGF-beta1 signaling in chronic rhinosinusitis and nasal polyposis [J].ActaHistochem, 2012,114(1): 12-17.

[8]KOUVARAKI M A, RASSIDAKIS G Z, TIAN L,etal. Jun activation domain-binding protein 1 expression in breast cancer inversely correlates with the cell cycle inhibitor p27(Kip1) [J].CancerRes, 2003,63(11): 2977-2981.

[9]NIE W, SONG W, ZHANG W,etal. miR-1470 mediates lapatinib induced p27 upregulation by targeting c-jun [J].JCellPhysiol, 2015,230(7): 1630-1639.

[10]PORRELLO E, RIVELLINI C, DINA G,etal. Jab1 regulates Schwann cell proliferation and axonal sorting through p27 [J].JExpMed, 2014,211(1): 29-43.

[11]FUKUMOTO A, IKEDA N, SHO M,etal. Prognostic significance of localized p27(Kip1) and potential role of Jab1/CSN5 in pancreatic cancer [J].OncolRep, 2004,11(2): 277-284.

[12]FEI M, HANG Q, HOU S,etal. Adhesion to fibronectin induces p27(Kip1) nuclear accumulation through down-regulation of Jab1 and contributes to cell adhesion-mediated drug resistance (CAM-DR) in RPMI 8,226 cells [J].MolCellBiochem, 2014,386(1-2): 177-187.

[13]REN Z, HOU Y, MA S,etal. Effects of CCN3 on fibroblast proliferation, apoptosis and extracellular matrix production [J].IntJMolMed, 2014,33(6): 1607-1612.

[14]WU L, RUNKLE C, JIN H J,etal. CCN3/NOV gene expression in human prostate cancer is directly suppressed by the androgen receptor [J].Oncogene, 2014,33(4): 504-513.

[15]XING E P, NIE Y, WANG L D,etal. Aberrant methylation of p16INK4a and deletion of p15INK4b are frequent events in human esophageal cancer in Linxian, China [J].Carcinogenesis, 2009,20(1): 77-84.

[16]WANG Y, FANG M Z, LIAO J,etal. Hypermethylation-associated inactivation of retinoic acid receptor beta in human esophageal squamous cell carcinoma [J].ClinCancerRes, 2003,9(14): 5257-5263.

[17]CLEMENT G, BRAUNSCHWEIG R, PASQUIER N,etal. Alterations of the Wnt signaling pathway during the neoplastic progression of Barrett’s esophagus [J].Oncogene, 2003,25(21): 3084-3092.

[18]PARK M, BAEK I J, KIM H,etal. CCN3 overexpression inhibits growth of callosal projections via upregulation of RAB25 [J].BiochemBiophysResCommun, 2015,461(3): 456-462.

[19]RODDY K A, BOULTER C A. Targeted mutation of NOV/CCN3 in mice disrupts joint homeostasis and causes osteoarthritis-like disease [J].OsteoarthritisCartilage, 2015,23(4): 607-615.

[20]JONES P A, BAYLIN S B. The epigenomics of cancer [J].Cell, 2007,128(4): 683-692.

[21]Shackleford T J, Claret F X. Jab1/CSN5: A new player in cell cycle control and cancer [J].CellDiv, 2012,5: 26.

[22]PAN Y, YANG H, CLARET F X. Emerging roles of Jab1/CSN5 in DNA damage response, DNA repair, and cancer [J].CancerBiolTher, 2014,15(3): 256-262.

[23]WANG H, SONG W, HU T,etal. Fank1 interacts with Jab1 and regulates cell apoptosis via the AP-1 pathway [J].CellMolLifeSci, 2011,68(12): 2129-2139.

[24]OKOH V O, GARBA N A, PENNEY R B,etal. Redox signalling to nuclear regulatory proteins by reactive oxygen species contributes to oestrogen-induced growth of breast cancer cells [J].BrJCancer, 2015,112(10): 1687-1702.

[25]UDALI S, GUARINI P, RUZZENENTE A,etal. DNA methylation and gene expression profiles show novel regulatory pathways in hepatocellular carcinoma [J].ClinEpigenetics, 2015,7(1): 43.

[26]DIMOVA I, ORSETTI B, NEGRE V,etal. Genomic markers for ovarian cancer at chromosomes 1, 8 and 17 revealed by array CGH analysis [J].Tumori, 2009,95(3): 357-366.

[27]HALLSTROM T C, NEVINS J R. Jab1 is a specificity factor for E2F1-induced apoptosis [J].GenesDev, 2006,20(5): 613-623.

[28]ZHANG Y, BAYSAC K C, YEE L F,etal. Elevated DDX21 regulates c-Jun activity and rRNA processing in human breast cancers [J].BreastCancerRes, 2014,16(5): 449.

Jab1 Regulating Nov Affected by DNA Methylation in Breast Cancer Cell Line

WANG Shunni1,2,3, CHEN Hongyan1,2,3, YE Xiaojuan1,2,3, MIN Taishan1,2,3,LU Daru1,2,3, CHEN Haoming1,2,3

(1. School of Life Science, Fudan University, Shanghai 200438, China; 2. State Key LaboratoryofGeneticsEngineering,FudanUniversity,Shanghai200438,China; 3.MOEKeyLaboratoryofContemporaryAnthropology,FudanUniversity,Shanghai200438,China)

In order to study the effects of Jab1 in breast cancer, a Jab1 gene knockdown system in breast cancer cell line MDA231 was established with lentivirus mediated RNA interference. Then our study confirmed thatNovgene was regulated by Jab1 through human expression microarray and Real-Time PCR. Moreover, the knockdown of Jab1 decreased the expression level of mRNA and protein ofNovgene. Moreover, 4 CpG sites ofNovpromotor have high methylation rates. The expression level ofNovgene had no significant difference after adding methyltransferase inhibitor 5′-aza-dC in Jab1 knockdown cell lines comparing to the expression ofNovdown regulated in Jab1 knockdown cell lines without inhibitor which indicats that Jab1 may regulateNovgene through epigenetics.

breast cancer; Jab1; methylation;Nov

0427-7104(2016)01-0112-07

2015-05-05

國家自然科學基金(81071739,81272385)

王順妮(1989—),女,碩士研究生；陳浩明,男,副教授,E-mail: hmchen@fudan.edu.cn.

R 737.9

A