農(nóng)桿菌侵染條件對柱花草遺傳轉(zhuǎn)化效率的影響

陳彩虹，釧秀娟，王薈，賈艷星，陳志堅，劉國道，羅麗娟*

(1.海南大學(xué)園藝園林學(xué)院，海南 海口 570228；2.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所，海南 儋州 571737)

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農(nóng)桿菌侵染條件對柱花草遺傳轉(zhuǎn)化效率的影響

陳彩虹1，釧秀娟1，王薈1，賈艷星1，陳志堅2，劉國道2，羅麗娟1*

(1.海南大學(xué)園藝園林學(xué)院，海南 海口 570228；2.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所，海南 儋州 571737)

在前期建立的柱花草高效組織再生體系基礎(chǔ)上，進一步以柱花草熱研5號的下胚軸為受體材料，以GUS基因為報告基因，研究了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的柱花草遺傳轉(zhuǎn)化的幾個影響因素，包括根癌農(nóng)桿菌菌液濃度、浸染時間和共培養(yǎng)時間等對農(nóng)桿菌介導(dǎo)的柱花草遺傳轉(zhuǎn)化效率的影響。結(jié)果表明，以柱花草下胚軸為外植體，在農(nóng)桿菌菌液濃度(OD600)為0.4～0.6，農(nóng)桿菌浸染時間為15 min和共培養(yǎng)3 d的條件下，愈傷的轉(zhuǎn)化效率為72%。愈傷組織進一步經(jīng)過分化、生根和煉苗等過程后，對轉(zhuǎn)化植株進行GUS染色和PCR檢測，結(jié)果表明外源基因已成功整合到柱花草基因組中。本研究結(jié)果對柱花草遺傳轉(zhuǎn)化和關(guān)鍵基因功能研究具有重要的參考價值。

根癌農(nóng)桿菌；遺傳轉(zhuǎn)化；GUS染色；柱花草

柱花草(Stylosanthesspp.)是一種重要的豆科牧草，主要分布在熱帶、亞熱帶以及溫帶地區(qū)[1]?！盁嵫?號”柱花草是從哥倫比亞國際熱帶農(nóng)業(yè)中心(CIAT)引進的CIAT184柱花草群體中，通過對早花、耐寒和抗病等性狀的單株選育而成，已被種植于我國南方地區(qū)，其具有高產(chǎn)、抗炭疽病和耐寒等特點[2]。隨著研究技術(shù)手段的發(fā)展，柱花草在生理生化特性[3]、遺傳多樣性[4]和植株再生以及遺傳轉(zhuǎn)化[5]等方面吸引了廣泛的關(guān)注和研究。然而，由于存在著可利用資源少、遺傳能力弱和易感染炭疽病等限制因素[6]，嚴(yán)重制約了柱花草深入研究的開展。為了解決在柱花草中存在的上述問題，最有效和最常用的研究手段就是通過生物技術(shù)方法對柱花草進行遺傳改良。

根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物遺傳轉(zhuǎn)化是一種最常用的轉(zhuǎn)基因方法，在水稻(Oryzasativa)、玉米(Zeamays)、高粱(Sorghumbicolor)和大豆(Glycinemax)中都有成功的研究報道[7-10]。不同品種柱花草的組織再生以及遺傳轉(zhuǎn)化已有文獻報道，如S.hamata[11]，S.humilis[12-13]和S.guianensis等[5,14]。Manners和Way[13]采用葉盤轉(zhuǎn)化法將載體pGV3850:103neo轉(zhuǎn)化S.humilis，并獲得轉(zhuǎn)基因植株。Wang等[15]采用葉盤轉(zhuǎn)化法將口蹄疫病毒外殼蛋白VP1基因轉(zhuǎn)化到柱花草栽培品種“熱研二號”中，獲得了轉(zhuǎn)基因植株。但是，迄今為止，國內(nèi)外并未有從農(nóng)桿菌浸染條件方面對柱花草遺傳轉(zhuǎn)化條件進行摸索和優(yōu)化。并且，由于轉(zhuǎn)化效率低，在轉(zhuǎn)基因柱花草植株中進行基因功能分析只有少量文獻被報道[15-16]，表明了柱花草是一種難以被根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的豆科牧草。因此，對農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化條件進行摸索和優(yōu)化，在穩(wěn)定的組織再生體系基礎(chǔ)上，建立和優(yōu)化柱花草遺傳轉(zhuǎn)化體系，對柱花草遺傳改良和基因功能研究有著重要的意義。

農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化效率受許多因素的影響，包括植物種類、外植體選擇、愈傷組織誘導(dǎo)和分化、農(nóng)桿菌浸染條件等方面[7-10]。本研究在前期建立的柱花草“熱研5號”組織再生體系基礎(chǔ)上[17]，從農(nóng)桿菌浸染條件方面對柱花草遺傳轉(zhuǎn)化條件進行摸索和優(yōu)化，利用GUS染色方法分析轉(zhuǎn)化效率，并通過PCR檢測來鑒定轉(zhuǎn)基因柱花草植株，為柱花草遺傳改良和重要基因功能研究提供重要的技術(shù)支持。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1植物與載體菌株柱花草為“熱研5號”品種(Stylosanthesguianensiscv. Reyan No. 5)，由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院品種資源研究所牧草中心提供，2014年10月13日種無菌苗；根癌農(nóng)桿菌為EHA105(Agrobacteriumtumefaciens)，載體質(zhì)粒為pCAMBIA 1301(含GUS報告基因及潮霉素Hyg篩選標(biāo)記)。

1.1.2試劑材料DNA聚合酶(Premix Taq Version 2.0)和DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(DNA Ladder Marker)均購自大連TaKaRa公司；新型廣譜植物基因組DNA快速提取試劑盒購自北京蓋寧金諾生物技術(shù)有限責(zé)任公司；卡那霉素、利福平、潮霉素、乙酰丁香酮均購自北京索萊寶有限公司；PCR引物合成由北京六合華大基因科技股份有限公司合成完成；常規(guī)化學(xué)藥品及組織培養(yǎng)所用試劑均為國產(chǎn)AR級分析純。

1.2方法

1.2.1無菌苗的培養(yǎng)無菌苗培養(yǎng)參照釧秀娟等[17]方法進行，待子葉完全展開后備用。

1.2.2農(nóng)桿菌菌液的制備將含質(zhì)粒pCAMBIA 1301的農(nóng)桿菌EHA105菌液，劃線培養(yǎng)于含有50 mg/L卡那霉素和50 mg/L 利福平的YEB固體培養(yǎng)基上(表1)，于28℃培養(yǎng)2 d。挑取單克隆接種于含有50 mg/L卡那霉素和50 mg/L利福平的YEB液體培養(yǎng)基中28℃培養(yǎng)過夜。將20 μL菌液加入到添加相應(yīng)抗生素的50 mL YEB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600為0.6。菌液于25℃，4000 r/min離心10 min，去上清，菌體沉淀用50 mL新鮮YEB液體培養(yǎng)基重懸使其最終OD600為0.6[18]。

1.2.3農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化、抗性愈傷的篩選和植株再生將下胚軸置于農(nóng)桿菌(菌液OD600為0.6)懸浮液中浸染15 min，并于25℃共培養(yǎng)3 d后，將外植體材料轉(zhuǎn)移至含200 mg/L羧芐青霉素(Carb)的CIM培養(yǎng)基上恢復(fù)培養(yǎng)1周，隨后轉(zhuǎn)移至含15 mg/L Hyg和200 mg/L Carb的CIM培養(yǎng)基中進行篩選和再生。28 d后將抗性愈傷轉(zhuǎn)移至含15 mg/L Hyg和200 mg/L Carb的芽誘導(dǎo)胚芽培養(yǎng)基(表1，SIM)中，10～30 d后有體胚形成，并將成熟的體胚轉(zhuǎn)入含200 mg/L Carb的狀芽(表1，SEM)培養(yǎng)基中，待叢生芽長到2 cm時，從基部切斷叢生芽并轉(zhuǎn)移至含200 mg/L Carb的生根培養(yǎng)基(表1，RM)中培養(yǎng)，15 d后可獲得抗性再生植株。將生根良好的再生植株經(jīng)閉瓶煉苗、開瓶煉苗和移栽后,即可定植。

1.2.4轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化農(nóng)桿菌菌液濃度摸索：取下胚軸分別置于含不同農(nóng)桿菌菌液濃度(OD600為0.2，0.4，0.6和0.8)的懸浮液中浸泡15 min，無菌濾紙瀝干殘留的菌液，然后轉(zhuǎn)移至愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基(表1，CIM)中，于25℃暗培養(yǎng)3 d后，進行恢復(fù)及篩選培養(yǎng)，通過GUS染色結(jié)果統(tǒng)計篩選后的陽性轉(zhuǎn)化愈傷數(shù)量。每個處理設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)。

農(nóng)桿菌浸染時間摸索：取下胚軸分別置于OD600為0.6的農(nóng)桿菌懸浮液中浸泡不同時間(5，10，15和20 min)，無菌濾紙瀝干殘留的菌液，然后轉(zhuǎn)移至愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基(表1，CIM)中，于25℃暗培養(yǎng)3 d后，進行恢復(fù)及篩選培養(yǎng)，通過GUS染色結(jié)果統(tǒng)計篩選后的陽性轉(zhuǎn)化愈傷數(shù)量。每個處理設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)。

共培養(yǎng)時間篩選：下胚軸于OD600為0.6的農(nóng)桿菌懸浮液浸染15 min，無菌濾紙瀝干殘留的菌液，然后轉(zhuǎn)移至愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基(表1，CIM)中，于25℃共培養(yǎng)1到4 d后，進行恢復(fù)及篩選培養(yǎng)，通過GUS染色結(jié)果統(tǒng)計篩選后的陽性轉(zhuǎn)化愈傷數(shù)量。每個處理設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)。

1.2.5GUS染色分析GUS染色參照J(rèn)efferson[19]方法進行。將轉(zhuǎn)化材料浸在GUS染液中，于37℃中反應(yīng)8～10 h，取出放入75%乙醇中脫色12 h，然后在實體顯微鏡觀察外植體染色情況。

1.2.6PCR鑒定轉(zhuǎn)化植株提取再生柱花草植株葉片的基因組DNA后，通過PCR擴增GUS基因，引物序列分別為F：5′-TCGCGCAAGACTGTAACCAC-3′和 R：5′-CTTTAGGCATTGGTTTCGAAGC-3′。PCR 擴增條件為：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸30 s，30個循環(huán)，最后72℃延伸10 min，隨后將PCR擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

轉(zhuǎn)化效率(%)=GUS染色陽性數(shù)/篩選后的愈傷總數(shù)×100

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)均用Microsoft office excel 2003進行處理，采用SPSS軟件(v13.0)進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

2　結(jié)果與分析

2.1柱花草的遺傳轉(zhuǎn)化

以柱花草熱研5號下胚軸為外植體，農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化的共培養(yǎng)時期、恢復(fù)培養(yǎng)時期、愈傷篩選、誘芽、壯芽、生根以及移栽等過程如圖1所示。

2.2不同農(nóng)桿菌浸染條件對愈傷組織轉(zhuǎn)化效率的影響

在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化中，農(nóng)桿菌菌液濃度、浸染時間和共培養(yǎng)時間均對轉(zhuǎn)化效率有顯著的影響。從圖2A可以看出，隨著農(nóng)桿菌菌液濃度升高，愈傷組織的轉(zhuǎn)化效率有增加的趨勢，當(dāng)OD600為0.4到0.6時，轉(zhuǎn)化效率最高，約達60%；但是，隨著菌液濃度增加，轉(zhuǎn)化效率有降低的趨勢，當(dāng)OD600為0.8時，轉(zhuǎn)化效率為52%，且愈傷組織分化率降低，并逐漸褐化。所以，OD600為0.4～0.6是最適合的農(nóng)桿菌菌液浸染濃度。

從圖2B可以看出，隨著農(nóng)桿菌浸染時間延長，愈傷組織的轉(zhuǎn)化效率有明顯增加的趨勢，當(dāng)浸染時間為15 min時，轉(zhuǎn)化效率最高，轉(zhuǎn)化效率為浸染5 min時的2.3倍；但是，隨著浸染時間的繼續(xù)增加，轉(zhuǎn)化效率顯著降低，且對愈傷組織造成傷害，浸染時間20 min時的轉(zhuǎn)化效率僅為15 min時的16%，差異顯著。所以，最佳的農(nóng)桿菌浸染時間為15 min。

圖2　不同農(nóng)桿菌浸染條件對轉(zhuǎn)化效率的影響Fig.2　Factors affecting the transformation efficiencies of stylo　A：農(nóng)桿菌菌液濃度；B：浸染時間；C：共培養(yǎng)時間。A: Agrobacterium concentration; B: Infected time; C: Co-culture duration. 不同字母表示差異顯著(P<0.05)。Different letters indicate significant difference (P<0.05).

共培養(yǎng)時間顯著影響愈傷組織的轉(zhuǎn)化效率。圖2C結(jié)果表明，隨著共培養(yǎng)時間的延長，愈傷組織的轉(zhuǎn)化效率有顯著增加的趨勢，當(dāng)共培養(yǎng)時間為3 d時，愈傷組織轉(zhuǎn)化效率最高，為72%，轉(zhuǎn)化效率分別為共培養(yǎng)1和2 d時的2.7和1.3倍；但是，隨著共培養(yǎng)時間繼續(xù)延長，愈傷組織轉(zhuǎn)化效率降低，共培養(yǎng)4 d時的轉(zhuǎn)化效率僅為3 d時的61%，且愈傷組織周圍有大量農(nóng)桿菌形成，影響后期愈傷組織生長。所以，最佳的共培養(yǎng)時間為3 d。

圖3　轉(zhuǎn)化材料GUS染色分析Fig.3　GUS staining analysis of transgenic material　　　A：下胚軸外植體愈傷組織，標(biāo)尺=100 μm；B：抗性芽，標(biāo)尺=100 μm；C：根染GUS，標(biāo)尺=1 cm；D：轉(zhuǎn)化植株，標(biāo)尺=1 cm。A: Callus induced from hypocotyl, Bar=100 μm; B: Resistant shoots induced from callus, Bar=100 μm; C: Root dyeing GUS, Bar=1 cm; D:Putative transgenic plant, Bar=1 cm.

圖4　轉(zhuǎn)基因抗性植株P(guān)CR檢測Fig.4　PCR analysis of putative transgenic plant　　　M：Mark；+：陽性對照(質(zhì)粒)；-：陰性對照(野生型植株)；1～3：轉(zhuǎn)基因抗性植株。M: Mark; +: Positive control (plasmid); -: Negative (wild type plant); 1-3: Three putative transgenic plant.

2.3轉(zhuǎn)化材料GUS檢測

柱花草下胚軸根據(jù)上述優(yōu)化后的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化條件進行處理，并經(jīng)共培養(yǎng)和恢復(fù)培養(yǎng)、抗性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)、抗性芽生長、生根和抗性苗移栽后，獲得可能的轉(zhuǎn)基因植株(圖1)。對不同階段的組織進行GUS染色分析，結(jié)果表明，處于篩選階段的愈傷組織經(jīng)GUS染色后呈現(xiàn)出藍色，表明GUS基因已成功在愈傷組織中表達(圖3A)；具有抗性的愈傷組織經(jīng)過芽誘導(dǎo)后，GUS染色呈現(xiàn)藍色，表明GUS基因在抗性芽中表達(圖3B)；抗性芽經(jīng)生根和煉苗后，轉(zhuǎn)化植株和根的GUS染色呈現(xiàn)藍色，表明GUS基因已穩(wěn)定的在柱花草植株中表達(圖3C，D)。

2.4轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測

本研究進一步對轉(zhuǎn)化后的再生植株在基因組水平上進行PCR檢測。我們從12株移栽的抗性植株隨機挑選3株并提取其葉片基因組DNA，通過PCR反應(yīng)擴增GUS基因。結(jié)果表明，隨機挑選的3株轉(zhuǎn)化植株都能成功的擴增出563 bp的目的片段(圖4，1-3泳道)，而野生型柱花草(-)則未能擴增出目的條帶。結(jié)果進一步證明了GUS基因已成功的整合到柱花草基因組中。

3　討論

根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化已成為作物遺傳轉(zhuǎn)化的主要途徑之一，并可對植物性狀進行定向的遺傳改良[20-21]。在柱花草遺傳轉(zhuǎn)化研究中，國外對其組織再生和遺傳轉(zhuǎn)化方法進行了相關(guān)分析[5,12-13,15]，國內(nèi)就王冬梅等[22]從農(nóng)桿菌浸染條件之農(nóng)桿菌菌液濃度方面進行研究的相關(guān)報道。由于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化效率受植物種類和農(nóng)桿菌浸染條件等因素影響，因此，本研究主要從農(nóng)桿菌浸染條件方面對柱花草遺傳轉(zhuǎn)化條件進行摸索和優(yōu)化，結(jié)合GUS染色和PCR分析來鑒定轉(zhuǎn)基因柱花草植株。

農(nóng)桿菌能否有效地附著并浸染外植體是遺傳轉(zhuǎn)化成功與否的關(guān)鍵。對農(nóng)桿菌介導(dǎo)的紫花苜蓿(Medicagosativa)遺傳轉(zhuǎn)化條件進行摸索，包括農(nóng)桿菌菌液濃度，浸染時間和共培養(yǎng)時間等，結(jié)果表明最佳的轉(zhuǎn)化條件為農(nóng)桿菌菌液濃度OD600在0.3～0.5間，浸染時間為10～15 min，共培養(yǎng)時間為3 d，轉(zhuǎn)化效率高達72%[20]。在百脈根(Lotuscorniculatus)，研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)農(nóng)桿菌濃度OD600在0.5左右，浸染20 min和共培養(yǎng)3 d的條件下，百脈根遺傳轉(zhuǎn)化效率為50%[21]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)農(nóng)桿菌菌液OD600為0.4～0.6時，浸染15 min和共培養(yǎng)3 d的條件下，可獲得較高的柱花草愈傷組織轉(zhuǎn)化效率(約72%)，即為最適的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化條件，過低或過高的菌液濃度、浸染時間和共培養(yǎng)時間都對轉(zhuǎn)化效率和愈傷組織生長產(chǎn)生不利影響(圖2)。這與上述紫花苜蓿和百脈根轉(zhuǎn)化條件中的最適農(nóng)桿菌菌液濃度和共培養(yǎng)時間相符，但與百脈根的浸染時間不一致，其可能是由于不同外植體材料受農(nóng)桿菌浸染的敏感性不同。

柱花草的遺傳轉(zhuǎn)化始于1987年，Manners[12]以S.humilis為材料，將農(nóng)桿菌懸浮液浸泡外植體2～5 min，共培養(yǎng)2 d，植株轉(zhuǎn)化效率約為0.3%。王冬梅等[22]以熱研二號為材料，將預(yù)培養(yǎng)2 d的外植體，用經(jīng)10 μmol/L乙酰丁香酮預(yù)處理OD值為1.5的農(nóng)桿菌和稀釋5倍番木瓜浸提液一起，采用農(nóng)桿菌抽真空浸入法轉(zhuǎn)化柱花草，在加1.5 mg/L脯氨酸的共培養(yǎng)基上共培養(yǎng)，芽的轉(zhuǎn)化率可達20%。本研究在前人研究的基礎(chǔ)上通過對農(nóng)桿菌浸染條件進行摸索后，使得柱花草的愈傷轉(zhuǎn)化效率高達72%，建立和優(yōu)化了柱花草遺傳轉(zhuǎn)化體系，獲得轉(zhuǎn)基因柱花草。本研究結(jié)果對柱花草遺傳轉(zhuǎn)化和關(guān)鍵基因功能研究提供了可靠的依據(jù)，并為柱花草的遺傳改良奠定了基礎(chǔ)。

References：

[1]Liu G D, Phaikaew C, Stur W W.Stylosanthesdevelopment and utilization in China and south-east Asia. Journal of Tropical Grasslands, 1997, 31(5): 460-466.

[2]Liu G D, Bai C J, He H X,etal. The selection and utilization ofStylosanthesguianensiscv. Reyan No. 5. Acta Agrestia Sinica, 2001, 9(1): 1-7.

[3]Zhou B Y, Guo Z F. Effect of ABA and its biosynthesis inhibitor on chilling resistance and anti-oxidant enzymes activity. Acta Prataculturae Sinica, 2005, 14(6): 94-99.

[4]Jiang C S. The progress of studies onStylosanthes. Journal of Chinese Journal of Tropical Crops, 2005, 26(4): 104-108.

[5]Quecini V M, Alves A C, Vieiraet M L,etal. Factors influencing electroporation-mediated gene transfer toStylosanthesguianensis(Aubl.) Sw. protoplasts. Journal of Genetics and Molecular Research, 2002, 25(1): 73-80.

[6]Yang M X, Lin G B, Chen C H,etal. Microscopic observation ofStylosanthesinfected byColletotrichumgloeosporioides. Acta Prataculturae Sinica, 2015, 24(5): 175-181.

[7]Qin D J, Chen D X, Hu X,etal. Advances on genetic transformation of rice. Journal of Biology, 2008, 25(5): 5-9.

[8]Sun C b, Guo J, Tao R,etal. Study on genetic transformation system of maize mediated byAgrobacteriumtumefaciens. Journal of Chinese Agricultural Science Bulletin, 2012, 28(36): 71-75.

[9]Zhu L, Lang Z H, Li G Y,etal. Introduction of Btcry1Ahgene into sweet sorghum (SorghumbicolorL. Moench) byAgrobacteriumtumefaciens-mediated transformation. Journal of Scientia Agricultura Sinica, 2011, 44(10): 1989-1996.

[10]Muthukrishnan A, Kondeti S, Thankaraj S M,etal. Application of sonication in combination with vacuum infiltration enhances theAgrobacterium-mediated genetic transformation in indian soybean cultivars. Journal of Applied Microbiology and Biotechnology, 2015, 75: 2266-2287.

[11]Manners J M. Transformation ofStylosanthesspp. usingAgrobacteriumtumefaciens. Journal of Plant Cell Reports, 1987, 6: 204-207.

[12]Manners J M. Transgenic plants of the tropical pasture legumeStylosantheshumilis. Journal of Plant Science, 1988, 55: 61-68.

[13]Manners J M, Way H. Efficient transformation with regeneration of the tropical pasture legumeStylosantheshumilisusingAgrobacteriumrhizogenesand a Ti plasmid-binary vector system. Journal of Plant Cell Reports, 1989, 8: 341-345.

[14]Sarria R, Calderón A, Thro A M,etal.Agrobacterium-mediated transformation ofStylosanthesguianensisand production of transgenic plants. Journal of Plant Science, 1994, 96: 119-127.

[15]Wang D M, Zhu J B, Peng M,etal. Induction of a protective antibody response toFMDVin mice following oral immunization with transgenicStylosanthesspp. as a feed stuff additive. Journal of Transgenic Research, 2008, 17(6): 1163-1170.

[16]Bao G G, Zhuo C L, Guo Z F,etal. Co-expression ofNCEDandALOimproves vitamin C level and tolerance to drought and chilling in transgenic tobacco and stylo plants. Journal of Plant Biotechnology Journal, 2016, 1(14): 1-9.

[17]Chuan X J, Chen C H, Luo L J. Callus induction ofStylosanthesguianensiscv. Reyan No.5. Pratacultural Science, 2015, 32(1): 78-84.

[18]Tippani R, Yarra R, Bulle M,etal. In vitro plantlet regeneration andAgrobacteriumtumefaciensmediated genetic transformation of Indian Kino tree (PterocarpusmarsupiumRoxb.). Journal of Acta Physiologiae Plantarum, 2013, 35: 3437-3446.

[19]Jefferson R A. Assaying chimeric genes in plants: the GUS gene fusion system. Journal of Plant Molecular Biology Reporter, 1987, 5: 387-405.

[20]Liu J L, Zhang Z L, Wu Y M,etal. Establishment of an efficientAgrobacterium-mediated genetic transformation system ofLotuscorniculatus. Acta Prataculturae Sinica, 2006, 15(3): 128-131.

[21]Ma H L, Lu X S, Cao Z Z,etal. Analysis of factors influencing gene transformation inMedicagosativa. Acta Prataculturae Sinica, 2006, 15(5): 94-102.

[22]Wang D M, Tang Y Q, Zhou P. An investigation of approaches to optimize gene transformation system ofStylosanthesguianensisReyanⅡ. Pratacultural Science, 2005, 22(10): 25-30.

[2]劉國道, 白昌軍, 何華玄, 等. 熱研5號選育研究. 草地學(xué)報, 2001, 9(1): 1-7.

[3]周碧艷, 郭振飛. ABA及其合成抑制劑對柱花草抗冷性及抗氧化酶活性的影響. 草業(yè)學(xué)報, 2005, 14(6): 94-99.

[4]蔣昌順. 柱花草的研究進展. 熱帶作物學(xué)報, 2005, 26(4): 104-108.

[6]楊茂霞, 林國彪, 陳彩虹, 等. 膠胞炭疽菌侵染柱花草葉片的顯微觀察. 草業(yè)學(xué)報, 2015, 24(5): 175-181.

[7]秦代錦, 陳德西, 胡曉, 等. 水稻遺傳轉(zhuǎn)化研究進展. 生物學(xué)雜志, 2008, 25(5): 5-9.

[8]孫傳波, 郭嘉, 陶蕊, 等. 農(nóng)桿菌介導(dǎo)玉米遺傳轉(zhuǎn)化體系的研究. 中國農(nóng)學(xué)通報, 2012, 28(36): 71-75.

[9]朱莉, 郎志宏, 李桂英, 等. 農(nóng)桿菌介導(dǎo)甜高粱轉(zhuǎn)Btcry1Ah的研究. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2011, 44(10): 1989-1996.

[17]釧秀娟, 陳彩虹, 羅麗娟. 熱研5號柱花草高頻、優(yōu)質(zhì)愈傷組織的誘導(dǎo). 草業(yè)科學(xué), 2015, 32(1): 78-84.

[20]劉建利, 張占路, 吳燕民, 等. 百脈根農(nóng)桿菌快速高效遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立. 草業(yè)學(xué)報, 2006, 15(3): 128-131.

[21]馬暉玲, 盧欣石, 曹致中, 等. 紫花苜蓿基因轉(zhuǎn)化的影響因素分析. 草業(yè)學(xué)報, 2006, 15(5): 94-102.

[22]王冬梅, 唐燕瓊, 周鵬. 熱研二號柱花草轉(zhuǎn)化體系優(yōu)化的研究. 草業(yè)科學(xué), 2005, 22(10): 25-30.

*Factors affecting genetic transformation efficiency for stylo (Stylosanthesguianensis) withAgrobacteriumtumefaciens

CHEN Cai-Hong1, CHUAN Xiu-Juan1, WANG Hui1, JIA Yan-Xing1, CHEN Zhi-Jian2, LIU Guo-Dao2, LUO Li-Juan1*

1.HorticultureandLandscapeofHainanUniversity,Haikou570228,China；2.TropicalCropGeneticResourcesInstitute,ChineseAcademyofTropicalAgriculturalSciences,Danzhou571737,China

The objective of this study was to investigate effects ofAgrobacteriumconcentration, infection time and co-culture duration on the genetic transformation efficiency for stylo (Stylosanthesguianensis) using a high-efficiency regeneration system that had been developed previously. Hypocotyls from stylo seedlings were used as plant material and the β-glucuronidase (GUS) gene was used as the reporter gene. The callus transformation efficiency was evaluated by GUS staining. The callus transformation efficiency reached 72% under the following conditions:Agrobacteriumat a concentration of OD600=0.4-0.6, with 15 mins infection and 3 days of co-cultivation. The exogenous gene had been successfully introduced into the stylo genome as indicated by GUS staining and PCR detection after callus selection, shoot differentiation and rooting. The results indicate that thisA.tumefaciens-mediated transformation system is suitable for genetic improvement and functional gene analysis of stylo.

Agrobacteriumtumefaciens; genetic transformation; GUS staining;Stylosanthes

10.11686/cyxb2015532

http://cyxb.lzu.edu.cn

2015-11-26；改回日期：2016-01-26

國家自然科學(xué)基金(31360575), 國家牧草產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系熱帶牧草育種(CARS-35-03), 海南大學(xué)優(yōu)秀研究生學(xué)位論文培育計劃(M8K3124001001003002)資助。

陳彩虹(1992-), 女, 海南文昌人, 在讀碩士。E-mail:331202062@qq.com

Corresponding author. E-mail:Luoljd@126.com

陳彩虹，釧秀娟，王薈，賈艷星，陳志堅，劉國道，羅麗娟. 農(nóng)桿菌侵染條件對柱花草遺傳轉(zhuǎn)化效率的影響. 草業(yè)學(xué)報, 2016, 25(6): 102-108.

CHEN Cai-Hong, CHUAN Xiu-Juan, WANG Hui, JIA Yan-Xing, CHEN Zhi-Jian, LIU Guo-Dao, LUO Li-Juan. Factors affecting genetic transformation efficiency for stylo (Stylosanthesguianensis) withAgrobacteriumtumefaciens. Acta Prataculturae Sinica, 2016, 25(6): 102-108.