微囊藻膠鞘多糖和水溶性胞外多糖的化學(xué)特性*

陳毛珍，謝梅娟，巫　偉，喻富根，李朋富

(南京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,南京 210093)

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微囊藻膠鞘多糖和水溶性胞外多糖的化學(xué)特性*

陳毛珍，謝梅娟，巫偉，喻富根，李朋富**

(南京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,南京 210093)

微囊藻(Microcystis)產(chǎn)生大量胞外多糖(EPS)，包括包裹在細(xì)胞外的膠鞘多糖(CPS)和釋放到周圍環(huán)境中的水溶性多糖(RPS)．為探究EPS在藍(lán)藻水華發(fā)生中的生理生態(tài)學(xué)意義，迫切需要了解微囊藻EPS的化學(xué)特性．本文從太湖分離群體微囊藻，經(jīng)過(guò)大約18個(gè)月實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)后，其中一些藻株轉(zhuǎn)變?yōu)閱渭?xì)胞形態(tài)．選擇5株群體藻和4株單細(xì)胞藻，比較分析這些藻株EPS的化學(xué)特性發(fā)現(xiàn)：(1)所有9株藻的EPS均為含有脫氧己糖的酸性雜多糖；(2)所有9株藻的CPS的糖醛酸含量(1.2%～2.1%)均低于RPS的糖醛酸含量(2.4%～6.2%)；(3)所有9株藻的EPS均含有乙?；土蛩峄?，其中，每一株藻CPS的乙?；烤哂赗PS的乙酰基含量，所有群體藻CPS的乙?；?4.1%～6.6%)高于所有單細(xì)胞藻CPS的乙?；?2.0%～3.2%)．本文進(jìn)而討論了EPS化學(xué)特性對(duì)EPS水溶性和微囊藻群體形成的影響，以及對(duì)其生態(tài)學(xué)作用的影響．在這些化學(xué)特性中，乙酰取代基團(tuán)被認(rèn)為可能是影響微囊藻EPS生理生態(tài)學(xué)作用的重要因素．

微囊藻；胞外多糖；乙?；?；疏水性；群體形成

藍(lán)藻水華是危害公共健康和環(huán)境安全的全球性問(wèn)題．微囊藻(Microcystis)是在湖泊和水庫(kù)中形成藍(lán)藻水華的最常見藻類．與其他藍(lán)藻一樣，微囊藻產(chǎn)生大量胞外多糖(EPS)，其中包括粘附在細(xì)胞外的膠鞘多糖(capsular polysaccharide，CPS)和釋放到周圍環(huán)境中的水溶性多糖(water-soluble released polysaccharide，RPS)[1]．據(jù)報(bào)道，英國(guó)Cheshire郡一個(gè)富營(yíng)養(yǎng)化淡水湖泊中，其變溫層(epilimnion)中的微囊藻胞外多糖粘液層占湖水總體積的0.0001%～0.007%，在水華暴發(fā)高峰期，細(xì)胞多糖粘液層達(dá)到湖水總體積的0.06%[2]．大量存在的微囊藻EPS影響水環(huán)境中的微生物豐度和多樣性、有機(jī)顆粒(organic aggregates)形成、碳循環(huán)和金屬元素循環(huán)[3-4]．

眾所周知，在自然界中微囊藻主要以群體形態(tài)存在，細(xì)胞因多糖粘液層包裹而成為群體[5]．然而，在實(shí)驗(yàn)室中長(zhǎng)期培養(yǎng)后，微囊藻喪失群體特性，主要以單細(xì)胞形態(tài)存在[6]．群體的形成有利于微囊藻垂直遷移和抵御浮游動(dòng)物的攝食[7]．此外，群體微囊藻比單細(xì)胞微囊藻擁有更高效的光合電子傳遞系統(tǒng)，有更高的低磷水平親和力和較高的防御溶藻細(xì)菌的能力[8-10]．研究表明浮游動(dòng)物攝食和藻菌相互作用可能是影響群體形成的重要因素[11-12]．此外，微囊藻細(xì)胞表面疏水性可能在細(xì)胞間粘附和群體形成中發(fā)揮重要作用，而細(xì)胞疏水性與細(xì)胞表面多糖相關(guān)[13]．

到目前為止，對(duì)微囊藻EPS化學(xué)特性的了解較少．已有報(bào)道顯示，微囊藻EPS的單糖組成具有藻株特異性，并且多為酸性雜多糖[4,14-17]．為了探究微囊藻EPS在藍(lán)藻水華發(fā)生過(guò)程中的作用，迫切需要對(duì)EPS的化學(xué)特性進(jìn)行更多更深入的研究．本文對(duì)群體微囊藻和單細(xì)胞微囊藻CPS和RPS的化學(xué)特性進(jìn)行比較研究，并討論EPS化學(xué)特性與其生理生態(tài)作用的相關(guān)性．

1　材料與方法

1.1藍(lán)藻分離與培養(yǎng)

2011年8月從太湖采集微囊藻水華樣品，在顯微鏡下觀察并進(jìn)行形態(tài)學(xué)分類鑒定[18]，用微量進(jìn)樣器槍頭挑取單個(gè)微囊藻群體，經(jīng)過(guò)無(wú)菌水洗滌后用BG11培養(yǎng)基在試管中進(jìn)行培養(yǎng)[19]，隨后轉(zhuǎn)入50 ml三角瓶中繼續(xù)培養(yǎng)．實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)約18個(gè)月后，有些藻株保持群體形態(tài)，而一些藻株失去群體特性以單細(xì)胞形態(tài)存在．本文選擇5株群體藻和4株單細(xì)胞藻用于實(shí)驗(yàn)．5株群體藻為惠氏微囊藻(M.wesenbergii)H4和H16、堅(jiān)實(shí)微囊藻(M.firma)H54、銅綠微囊藻(M.aeruginosa)H169和水華微囊藻(M.flos-aquae)H183，4株單細(xì)胞藻為惠氏微囊藻H50和H2、堅(jiān)實(shí)微囊藻H43和銅綠微囊藻H177．所選藻株在3 L三角瓶中培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)連續(xù)通入過(guò)濾空氣．培養(yǎng)溫度為25℃，光照強(qiáng)度為2500 lx，光暗周期比為12 h∶12 h．

1.2多糖的提取

微囊藻培養(yǎng)30 d后進(jìn)入穩(wěn)定期，7000 轉(zhuǎn)/min離心收集含RPS的上清液，并依次用0.45和0.22 μm的微孔濾膜過(guò)濾．將濾液轉(zhuǎn)移到截留分子量為7000 Dalton的透析袋中，在蒸餾水中4℃透析72 h，隨后45℃減壓蒸餾濃縮．CPS從沉淀的藻細(xì)胞中提取，用0.05% NaCl溶液重懸藻細(xì)胞，60℃水浴30 min[20]．隨后離心收集含CPS的上清液，過(guò)濾、透析和濃縮的方法同上．由于冷凍干燥的多糖在水中不能完全溶解，因此直接將一部分濃縮后的多糖用于測(cè)定蛋白質(zhì)、糖醛酸和取代基團(tuán)含量．另一部分濃縮后的多糖溶液在測(cè)定體積后，冷凍干燥、稱重，并計(jì)算濃縮多糖溶液中RPS或CPS含量．

1.3單糖組成分析

1.3.1中性單糖組成分析冷凍干燥的多糖用2 M三氟乙酸在120℃下水解3 h，水解產(chǎn)物用過(guò)濾空氣吹干后，按照李鐵林等的方法進(jìn)行糖腈衍生化[21]，加入10 mg鹽酸羥胺和0.5ml吡啶，90℃水浴30 min并振蕩，取出后冷卻至室溫，加入0.5ml醋酸酐，在90℃下繼續(xù)反應(yīng)30 min進(jìn)行乙?；?，反應(yīng)完成后進(jìn)行氣相色譜分析．單糖標(biāo)準(zhǔn)品處理同上．然后用氣相液相色譜法定性和定量分析，儀器為HP-6890氣相色譜儀，色譜柱為HP-55%苯甲基硅烷(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；流量為1.2ml/min；進(jìn)樣溫度為260℃；程序升溫：146℃保留2 min，從146℃以2℃/min升溫到210℃，從210℃以30℃/min升溫到280℃；FID檢測(cè)器，檢測(cè)溫度300℃，載氣為氮?dú)?；進(jìn)樣量為1 μl．

1.3.2酸性單糖定性分析干燥后的多糖水解產(chǎn)物加入1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮進(jìn)行衍生化反應(yīng)[22]，衍生產(chǎn)物使用氯仿萃取2次，最終得到的水相產(chǎn)物用高效液相色譜(HPLC)法分析，HPLC色譜柱：ZORBAX SB-C18(150 mm×4.6mm)；流動(dòng)相：0.1mol/L磷酸鹽緩沖液-乙腈(V∶V=83∶17)；流速：0.7ml/min；柱溫：30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：245 nm．

1.4蛋白質(zhì)、糖醛酸和取代基團(tuán)含量的測(cè)定

蛋白質(zhì)含量用Bradford方法測(cè)定，標(biāo)樣采用牛血清白蛋白[23]．糖醛酸含量的分析按照Blumenkrantz等[24]的方法，多糖溶液與四硼酸鈉硫酸溶液反應(yīng)后，進(jìn)一步與間羥聯(lián)苯反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物在520 nm處測(cè)定光吸收值，以葡萄糖醛酸為標(biāo)樣．乙酰基含量利用多糖中的乙?；c堿性羥胺反應(yīng)生成乙酰氧肟酸(acetohydroxamic acid)進(jìn)行測(cè)定，以葡萄糖五乙酸酯為標(biāo)樣[25]．丙酮酸含量分析通過(guò)多糖酸水解(1 N HCl，6 h，100℃)釋放的丙酮酸轉(zhuǎn)化為2，4-二硝基苯肼衍生物后進(jìn)行測(cè)定，以丙酮酸為標(biāo)樣[26]．硫酸基團(tuán)含量通過(guò)多糖酸水解后釋放的硫酸基團(tuán)與氯化鋇反應(yīng)生成硫酸鋇進(jìn)行測(cè)定，以硫酸鉀為標(biāo)樣[27]．

1.5藍(lán)藻細(xì)胞疏水性分析

藍(lán)藻細(xì)胞表面疏水性采用細(xì)菌粘附于碳?xì)浠衔?BATH)方法進(jìn)行測(cè)定[28]．測(cè)定細(xì)胞疏水性前，先用超聲波處理微囊藻群體(80 W，20 Hz，1 min)[13]．離心收集藻細(xì)胞，用磷酸鹽緩沖液(PBS，10 mmol/L，pH 7.2)洗滌兩次并重懸于PBS中至OD560≈0.9．取5 ml洗滌后的細(xì)胞懸浮液加2 ml二甲苯于試管中渦旋混合1 min．靜置10 min，測(cè)定下層水相OD560．藍(lán)藻的疏水性表示為：(ODi-ODf)/ODi×100，其中ODi和ODf分別是最初和最終的細(xì)胞懸浮液OD560．

2　實(shí)驗(yàn)結(jié)果．

2.1單糖組成、糖醛酸和蛋白質(zhì)含量

從太湖分離到的群體微囊藻經(jīng)過(guò)大約18個(gè)月的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)后出現(xiàn)3類不同的形態(tài)：有的藻株完全轉(zhuǎn)變?yōu)閱渭?xì)胞形態(tài)，一些藻株轉(zhuǎn)變?yōu)閱渭?xì)胞和群體共存的狀態(tài)，有的藻株仍以群體形態(tài)存在．為了提取多糖而進(jìn)行通氣培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，群體微囊藻在通氣攪拌培養(yǎng)后出現(xiàn)了2類形態(tài)：有的變成了單細(xì)胞和群體共存的狀態(tài)，而有的仍以群體形態(tài)存在．這說(shuō)明在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)過(guò)程中微囊藻群體的穩(wěn)定性有差異，本文試圖通過(guò)CPS化學(xué)特性的比較分析來(lái)探討導(dǎo)致群體穩(wěn)定性差異的原因．微囊藻H4、H16、H54、H169和H183都是在通氣培養(yǎng)后仍然全部以群體形態(tài)存在的藻株，是群體穩(wěn)定性較高的藻株．微囊藻H50、H2、H43和H177是在培養(yǎng)過(guò)程中全部以單細(xì)胞形態(tài)存在的藻株，是由群體很不穩(wěn)定的微囊藻藻株轉(zhuǎn)變而來(lái)的．

群體微囊藻的CPS和RPS中含有7～9種單糖，單細(xì)胞微囊藻的CPS和RPS中含有7～8種單糖(表1、2)．所有微囊藻的CPS和RPS中都含有蛋白質(zhì)、脫氧己糖(巖藻糖和/或鼠李糖)和酸性己糖(葡萄糖醛酸和/或半乳糖醛酸)，都含有鼠李糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖和葡萄糖醛酸(表1、2和3)．對(duì)于CPS和RPS，不同的微囊藻藻株間單糖組成存在差異．其中，脫氧己糖巖藻糖在微囊藻H16中缺乏，戊糖阿拉伯糖在微囊藻H50中缺乏，戊糖木糖在微囊藻H2、H43和H177中缺乏，半乳糖醛酸在4個(gè)藻株(H16、H183、H169和H50)中缺乏，另外，阿拉伯糖也在藻株H183的CPS中缺乏．比較同一株藻的CPS和RPS發(fā)現(xiàn)，除了藻株H183以外，同一株藻CPS和RPS含有的單糖種類是相同的，但是，從單糖摩爾比看，它們的組成都不同．對(duì)于每個(gè)微囊藻藻株，CPS的蛋白質(zhì)含量比RPS的高，而CPS中糖醛酸含量(1.2%～2.1%)低于RPS的糖醛酸含量(2.4%～6.2%)(表3)．比較群體藻(5株)和單細(xì)胞藻(4株)的單糖組成、糖醛酸和蛋白質(zhì)含量，不管是RPS還是CPS，都沒有發(fā)現(xiàn)規(guī)律性的差異．

表1　群體和單細(xì)胞微囊藻CPS單糖組成*

*數(shù)據(jù)為摩爾比率；+表示存在，-表示不存在，下同．

表2　群體和單細(xì)胞微囊藻RPS單糖組成

表3　群體和單細(xì)胞微囊藻CPS和RPS中蛋白質(zhì)、糖醛酸和取代基團(tuán)含量*

*數(shù)據(jù)為Wt/CPS干重，Wt/RPS干重(%)(mean±SE，n=3);-表示不存在．

2.2取代基團(tuán)含量和疏水性

所有微囊藻CPS和RPS都含有乙?；土蛩峄?個(gè)藻株(H4、H16、H50和H2)的CPS和藻株H50的RPS外，其它多糖中都含有丙酮酸(表3)．群體藻CPS的乙?；?4.1%～6.6%)均高于其RPS的乙酰基含量(1.1%～2.4%)，單細(xì)胞藻CPS的乙?；?2.0%～3.2%)也均高于其RPS的乙?；?0.5%～1.1%)．除水華微囊藻H183、惠氏微囊藻H50和銅綠微囊藻H177外，其余微囊藻CPS的丙酮酸含量均比RPS低．除惠氏微囊藻H16外，各微囊藻CPS的硫酸基團(tuán)含量均比RPS的高．群體微囊藻CPS的乙?；?4.1%～6.6%)總體高于單細(xì)胞藻CPS的乙酰基含量(2.0%～3.2%)．群體微囊藻表現(xiàn)出較高的疏水性(惠氏微囊藻H4、惠氏微囊藻H16、堅(jiān)實(shí)微囊藻H54、銅綠微囊藻H169和水華微囊藻H183的疏水性分別為66.4%±2.0%、81.6%±1.6%、59.9%±2.0%、63.1%±3.3%和68.7%±1.5%)，而實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)單細(xì)胞微囊藻均保留在水相中，疏水性數(shù)值都為0，表現(xiàn)出親水性．這說(shuō)明群體微囊藻細(xì)胞表面是疏水的，而單細(xì)胞藻的細(xì)胞表面是親水的．

3　討論

3.1微囊藻EPS的化學(xué)特性

本研究中所有的CPS和RPS均為酸性雜多糖，這與以前的報(bào)道一致．Nakagawa等[14]報(bào)道群體銅綠微囊藻(M．a(chǎn)eruginosaK-3A)的CPS含有12.8%的蛋白質(zhì)和8種單糖(半乳糖醛酸、鼠李糖、木糖、葡萄糖、阿拉伯糖、巖藻糖、甘露糖和半乳糖)．Plude等[15]的研究表明群體水華微囊藻(M．flos-aquaeC3-40)的CPS包含6種單糖(半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、鼠李糖和半乳糖醛酸)．Forni等[16]發(fā)現(xiàn)6個(gè)單細(xì)胞微囊藻株的CPS和RPS均為酸性雜多糖．Li等[3]發(fā)現(xiàn)微囊藻水華樣品中的CPS含有5.4%的蛋白質(zhì)和7種單糖(葡糖醛酸、半乳糖醛酸、鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖)．還有研究表明實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)和野外生長(zhǎng)的微囊藻的CPS冷凍干燥后，在水中的溶解度都很低[3,14-15]．本研究也顯示凍干的EPS在水中溶解度很低．此外，本研究中EPS含有脫氧己糖、蛋白質(zhì)、乙?；⒈岷土蛩峄?，與其他一些藍(lán)藻的EPS一致[1]．已有報(bào)道顯示，一株銅綠微囊藻的RPS含有硫酸基[17]，本文結(jié)果顯示在惠氏微囊藻、水華微囊藻、堅(jiān)實(shí)微囊藻的EPS中也存在硫酸基.

3.2EPS化學(xué)特性對(duì)其水溶性的影響及對(duì)群體形成的作用

群體微囊藻細(xì)胞有較高的疏水性，而單細(xì)胞微囊藻表現(xiàn)為親水性，這與之前的報(bào)道一致[13]．細(xì)胞疏水性被認(rèn)為與表面多糖相關(guān)，群體微囊藻細(xì)胞表現(xiàn)出疏水性表明包裹在細(xì)胞表面的CPS應(yīng)該是具有較強(qiáng)的疏水性．由于EPS中乙?；鶊F(tuán)、蛋白質(zhì)和脫氧己糖(如巖藻糖和鼠李糖)的存在，使一些藍(lán)藻的EPS具有顯著的疏水性[1]．本文的結(jié)果顯示每個(gè)微囊藻株CPS的蛋白質(zhì)含量均比RPS高(表1、2)，然而，Yang等的報(bào)道顯示蛋白水解酶處理對(duì)細(xì)胞疏水性并沒有影響[13]，這表明蛋白質(zhì)可能不是影響微囊藻CPS疏水性和細(xì)胞疏水性的因素．脫氧己糖巖藻糖和鼠李糖的存在有可能是微囊藻EPS具備疏水性的一個(gè)因素(表1、2)，而Vieira等研究表明對(duì)于形成聚集體的硅藻顆粒直鏈藻(Aulacoseiragranulate)，其EPS中56.1%的末端單糖是巖藻糖和鼠李糖，表明末端脫氧己糖可能對(duì)增加EPS疏水性和粘附性有重要作用[29]，為了了解脫氧己糖對(duì)微囊藻EPS疏水性的影響，需要進(jìn)一步分析其化學(xué)結(jié)構(gòu)來(lái)確定脫氧糖是否處在多糖分子的末端．

已有研究證實(shí)乙酰取代基團(tuán)能夠改變多糖的物理化學(xué)性質(zhì)．乙?；潭鹊偷哪揪厶悄芡耆苡谒?，而高度乙?；哪揪厶莿t不能溶于水，脫乙?；哪揪厶悄芘c更多的水分子通過(guò)氫鍵結(jié)合，因而能更好地溶于水[30]．不溶性的殼多糖(chitin)經(jīng)脫乙酰后生成了水溶性的幾丁聚糖(chitosan)[31]．在本研究中，RPS乙?；枯^低，可能是導(dǎo)致其相對(duì)較高的水溶性并溶解在培養(yǎng)基中的一個(gè)重要因素．相反，CPS的乙?；枯^高，可能是導(dǎo)致其相對(duì)較高的疏水性以及粘附在細(xì)胞表面的一個(gè)重要因素．

已有研究也顯示微生物EPS的乙?；鶎?duì)細(xì)胞聚集似乎是必不可少的．在形成微生物膜(biofilm)的早期階段，能產(chǎn)生乙?；Ｔ逅岬囊吧豌~綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)形成小的群體，而乙酰化缺陷型細(xì)菌不形成小群體[32]．熒光假單胞菌(PseudomonasfluorescensSBW25)細(xì)胞表層粘液中纖維素的乙?；彩瞧湫纬晌⑸锬さ谋匾獥l件[33]，可以推測(cè)微生物EPS的乙酰取代基決定了EPS的粘附性和凝結(jié)特性，并決定微生物膜的結(jié)構(gòu)[32]．本文結(jié)果顯示，群體微囊藻CPS乙酰基含量高于單細(xì)胞微囊藻CPS乙?；浚砻魅后w微囊藻CPS疏水性和粘附性可能會(huì)更高．另外，據(jù)報(bào)道，群體微囊藻CPS層也比單細(xì)胞微囊藻CPS層厚[34]．因此，群體微囊藻通過(guò)CPS介導(dǎo)的細(xì)胞間聯(lián)結(jié)可能是牢固的，從而導(dǎo)致細(xì)胞被固定于群體內(nèi)．單細(xì)胞藻可能不能建立牢固的細(xì)胞間聯(lián)結(jié)，從而無(wú)法形成群體．綜合本文的結(jié)果以及文獻(xiàn)報(bào)道可以推測(cè)，微囊藻CPS中乙?；靠赡苁怯绊懫涫杷院驼掣叫缘囊粋€(gè)重要因素，CPS中的乙?；赡苡绊懳⒛以迦后w的形成和穩(wěn)定性．

乙酰取代基團(tuán)能阻礙糖苷水解酶水解多糖，抑制植物細(xì)胞壁多糖的酶解[35]，并增強(qiáng)植物細(xì)胞壁對(duì)入侵微生物的防御能力[36]．銅綠假單胞菌胞外多糖海藻酸(alginate)脫乙酰后，海藻酸裂解酶的水解作用提高了15倍[37]．群體微囊藻CPS含有較高含量的乙?；?，有可能會(huì)阻礙糖苷水解酶將其解聚．雖然群體微囊藻有許多附生的異養(yǎng)細(xì)菌[12]，但是細(xì)菌對(duì)CPS的利用有可能是緩慢的．

多糖側(cè)鏈存在糖醛酸或丙酮酸有利于多糖溶于水[38]．RPS的糖醛酸含量比CPS的高(表3)，較高的糖醛酸含量有可能會(huì)促進(jìn)RPS在培養(yǎng)基中溶解．但是，RPS和CPS的化學(xué)結(jié)構(gòu)是未知的，不清楚糖醛酸和丙酮酸是否位于多糖側(cè)鏈，因此關(guān)于糖醛酸和丙酮酸含量對(duì)RPS和CPS溶解度的影響還需要進(jìn)一步研究．

3.3EPS在水環(huán)境中的生態(tài)學(xué)作用

水體中細(xì)菌群落能夠降解微囊藻的EPS[39]．由于乙酰取代基能抑制多糖的酶降解[33]，微囊藻EPS中乙?；拇嬖谟锌赡軙?huì)抑制細(xì)菌的降解作用，而微囊藻CPS和RPS的乙?；坎煌?，有可能導(dǎo)致二者對(duì)微生物降解的敏感性不同．糖醛酸、硫酸基和丙酮酸的存在賦予EPS陰離子特性，使EPS對(duì)金屬離子具有親和力[1]．由于糖醛酸、硫酸基和丙酮酸在微囊藻CPS和RPS中的含量不同，也有可能導(dǎo)致CPS和RPS螯合金屬離子能力有差異．另外，微囊藻EPS化學(xué)特性影響其物化特性，比如乙?；坑绊懫涫杷匦?，從而也有可能影響其形成有機(jī)顆粒的能力．EPS化學(xué)特性對(duì)其生態(tài)學(xué)作用的影響有待進(jìn)一步深入具體地研究．

4　結(jié)論

本文對(duì)群體和單細(xì)胞微囊藻CPS和RPS的化學(xué)特性進(jìn)行比較研究，這是關(guān)于微囊藻EPS的乙?；捅岬氖状螆?bào)道．研究表明，所有的EPS均為含有脫氧己糖的酸性雜多糖．對(duì)于每個(gè)微囊藻株，其CPS的糖醛酸含量均比RPS低，而CPS的乙酰基含量均比RPS高．此外，群體微囊藻CPS的乙?；勘葐渭?xì)胞微囊藻CPS高．EPS中還含有蛋白質(zhì)和硫酸基團(tuán)．這些數(shù)據(jù)將有助于理解微囊藻EPS在藍(lán)藻水華形成中的生理生態(tài)學(xué)作用．基于本文的研究可以推測(cè)，乙酰取代基可能是影響EPS水溶性的重要因素，也是影響EPS在群體形成中的作用以及其生態(tài)學(xué)作用的重要因素．

[1]Pereira S, Zille A, Micheletti Eetal. Complexity of cyanobacterial exopolysaccharides: composition, structures, inducing factors and putative genes involved in their biosynthesis and assembly.FEMSMicrobiologyReviews, 2009, 33(5): 917-941.

[2]Tien CJ, Krivtsov V, Levado Eetal. Occurrence of cell-associated mucilage and soluble extracellular polysaccharides in Rostherne Mere and their possible significance.Hydrobiologia, 2002, 485(1/2/3): 245-252.

[3]Li PF, Cai YF, Shi LMetal. Microbial degradation and preliminary chemical characterization ofMicrocystisexopolysaccharides from a cyanobacterial water bloom of Lake Taihu.InternationalReviewofHydrobiology, 2009, 94(6): 645-655.

[4]蔡元峰, 施麗梅, 李朋富等. 與微囊藻胞外多糖降解相關(guān)的微生物菌群分析. 湖泊科學(xué), 2009, 21(3): 369-374. DOI 10.18307/2009.0309.

[5]Otsuka S, Suda S, Li Retal. Morphological variability of colonies ofMicrocystismorphospecies in culture.JournalofGeneralandAppliedMicrobiology, 2000, 46(1): 39-50.

[6]Zhang M, Kong FX, Tan Xetal. Biochemical, morphological and genetic variations inMicrocystisaeruginosadue to colony disaggregation.WorldJournalofMicrobiologyandBiotechnology, 2007, 23(5): 663-670.

[7]Fulton RSIII, Paerl HW. Effects of colonial morphology on zooplankton utilization of algal resources during blue-green algal (Microcystisaeruginosa) blooms.LimnologyandOceanography, 1987, 32(3): 634-644.

[8]Shen H, Song LR. Comparative studies on physiological responses to phosphorus in two phenotypes of bloom-formingMicrocystis.Hydrobiologia, 2007, 592(1): 475-486.

[9]Wu ZX, Song LR. Physiological comparison between colonial and unicellular forms ofMicrocystisaeruginosaKüTZ (Cyanobacteria).Phycologia, 2008, 47(1): 98-104.

[10]Wang XY, Xie MJ, Wu Wetal. Differential sensitivity of colonial and unicellularMicrocystisstrains to an algicidal bacteriumPseudomonasaeruginosa.JournalofPlanktonResearch, 2013, 35(5): 1172-1176.

[11]Yang Z, Kong, FX, Shi XLetal. Changes in the morphology and polysaccharide content ofMicrocystisaeruginosa(cyanobacteria) during flagellate grazing.JournalofPhycology, 2008, 44(3): 716-720.

[12]Shen H, Niu Y, Xie Petal. Morphological and physiological changes inMicrocystisaeruginosaas a result of interactions with heterotrophic bacteria.FreshwaterBiology, 2011, 56(6): 1065-1080.

[13]Yang HL, Cai YF, Xia Metal. Role of cell hydrophobicity on colony formation inMicrocystis(Cyanobacteria).InternationalReviewofHydrobiology, 2011, 96(2): 141-148.

[14]Nakagawa M, Takamura Y, Yagi O. Isolation and characterization of the slime from a cyanobacterium,MicrocystisaeruginosaK-3A.AgriculturalandBiologicalChemistry, 1987, 51(2): 329-337.

[15]Plude JL, Parker DL, Schommer OJetal. Chemical characterization of polysaccharide from the slime layer of the cyanobacteriumMicrocystisflos-aquaeC3-40.AppliedandEnvironmentalMicrobiology, 1991, 57(6): 1696-1700.

[16]Forni, C, Telo FR, Caiola G. Comparative analysis of the polysaccharides produced by different species ofMicrocystis(Chroococcales, Cyanophyta).Phycologia, 1997, 36(3): 181-185.

[17]梅秋紅, 繆月秋, 張成武等. 銅綠微囊藻(Microcystisaeruginosavarmajor)胞外酸性多糖的分離、純化及其理化特性. 湖泊科學(xué), 2005, 17(4): 322-326. DOI 10.18307/2005.0407.

[18]虞功高, 宋立榮, 李仁輝. 中國(guó)淡水微囊藻屬常見種類的分類學(xué)討論——以滇池為例. 植物分類學(xué)報(bào), 2007, 45(5): 727-741.

[19]Rippka R. Isolation and purification of cyanobacteria.MethodsinEnzymology, 1988, 167: 3-27.

[20]Xu HC, Cai HY, Yu GHetal. Insights into extracellular polymeric substances of cyanobacteriumMicrocystisaeruginosausing fractionation procedure and parallel factor analysis.WaterResearch, 2013, 47(6): 2005-2014.

[21]李鐵林, 吳昌賢, 張燕霞. 糖和糖醇的氣相色譜分析研究Ⅱ糖腈乙酰酯衍生物氣相色譜分析的改進(jìn). 分析化學(xué), 1982, 10(5): 272-276.

[22]Strydom DJ. Chromatographic separation of 1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone-derivatized neutral, acidic and basic aldoses.JournalofChromatographyA, 1994, 678(1): 17-23.

[23]Bradford MM. Rapid and sensitive method for quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.AnalyticalBiochemistry, 1976, 72(1/2): 248-254.

[24]Blumenkrantz N, Asboe-Hansen G. New method for quantitative determination of uronic acids.AnalyticalBiochemistry, 1973, 54(2): 484-489.

[25]McComb EA, McCready RM. Determination of acetyl in pectin and in acetylated carbohydrate polymers hydroxamic acid reaction.AnalyticalBiochemistry, 1957, 29(5): 819-821.

[26]Sloneker JH, Orentas DG. Pyruvic acid, a unique component of an exocellular bacterial polysaccharide.Nature, 1962, 194(4827): 478-479.

[27]Dodgson KS, Price RG. A note on the determination of the ester sulphate content of sulphated polysaccharides.BiochemicalJournal, 1962, 84(1): 106-110.

[28]Fattom A, Shilo M. Hydrophobicity as an adhesion mechanism of benthic cyanobacteria.AppliedandEnvironmentalMicrobiology, 1984, 47(1): 135-143.

[29]Vieira AAH, Ortolano PIC, Giroldo Detal. Role of hydrophobic extracellular polysaccharide ofAulacoseiragranulata(Bacillariophyceae) on aggregate formation in a turbulent and hypereutrophic reservoir.LimnologyandOceanography, 2008, 53(5): 1887-1899.

[30]Pawar PMA, Koutaniemi S, Tenkanen Metal. Acetylation of woody lignocellulose: significance and regulation.FrontersinPlantScience, 2013, 4: 118.

[31]Rinaudo M. Role of substituents on the properties of some polysaccharides.Biomacromolecules, 2004, 5(4): 1155-1165.

[32]Tielen P, Strathmann M, Jaeger KEetal. Alginate acetylation influences initial surface colonization by mucoidPseudomonasaeruginosa.MicrobiologicalResearch, 2005, 160(2): 165-176.

[33]Spiers AJ, Bohannon J, Gehrig SMetal. Biofilm formation at the air-liquid interface by thePseudomonasfluorescensSBW25 wrinkly spreader requires an acetylated form of cellulose.MolecularMicrobiology, 2003, 50(1): 15-27.

[34]Zhang M, Shi XL, Yu Yetal. The acclimative changes in photochemistry after colony formation of the cyanobacteriaMicrocystisaeruginosa.JournalofPhycology, 2011, 47(3): 524-532.

[35]Gille S, Pauly M. O-acetylation of plant cell wall polysaccharides.FrontersinPlantScience, 2012, 3: 12.

[36]Biely P. Microbial carbohydrate esterases deacetylating plant polysaccharides.BiotechnologyAdvances, 2012, 30(6): 1575-1588.

[37]Sutherland IW. Polysaccharide lyases.FEMSMicrobiologyReviews, 1995, 16(4): 323-347.

[38]Sutherland IW. Structure-function relationships in microbial exopolysaccharides.BiotechnologyAdvances, 1994, 12(2): 393-448.

[39]Yang Z, Kong FX, Zhang Metal. Effect of filtered cultures of flagellateOchromonassp. on colony formation inMicrocystisaeruginosa.InternationalReviewofHydrobiology, 2009, 94(2): 143-152.

Chemical characteristics of capsular polysaccharide and water-soluble released exopolysaccharide from Microcystis

CHEN Maozhen, XIE Meijuan, WU Wei, YU Fugen & LI Pengfu**

(SchoolofLifeSciences,NanjingUniversity,Nanjing210093,P.R.China)

Microcystisspp. produces large amounts of exopolysaccharides (EPSs) including capsular polysaccharides (CPSs) which form mucilaginous matrix around the cells, and water-soluble released polysaccharides (RPSs). To understand their ecophysiological roles in cyanobacterial bloom, we urgently need more information on chemical characters of EPS. In this paper, colonialMicrocystisstrains were isolated from Lake Taihu. After incubation for about 18 months in the lab, some strains turned to be unicellular form. The comparative study of chemical characteristics of EPSs from five colonial strains and four unicellular strains showed that (1) all the EPSs were acidic heteropolysaccharides containing the deoxyhexoses; (2) the uronic acid content was lower in CPS (1.2%-2.1%) than in RPS (2.4%-6.2%) for allMicrocystisstrains; (3) acetate and sulfate groups were present in all EPSs, of which the acetate content was higher in CPS than in RPS for each strain, and higher in CPSs (4.1%-6.6%) of all colonial strains than in CPSs (2.0%-3.2%) of all unicellular strains. The chemical characteristics of EPS were discussed with respects in the solubility of EPS in water, the roles in colony formation and the ecological roles in the aquatic environments. It was thought that among these chemical characteristics, acetyl substitution might be an important factor affecting the ecophysiological roles of EPS in cyanobacterial bloom.

Microcystis; exopolysaccharide; acetyl group; hydrophobicity; colony formation

J.LakeSci.(湖泊科學(xué))， 2016， 28(3)： 609-615

10.18307/2016.0317

?2016 byJournalofLakeSciences

*國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31270447)和國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃“973”項(xiàng)目(2008CB418004)聯(lián)合資助. 2015-07-28收稿;2015-08-14收修改稿. 陳毛珍(1989～), 女, 碩士研究生; E-mail: cmz0370@163.com.

**通信作者;E-mail: pengfuli@nju.edu.cn.