M i c roRN A-599對(duì)靜脈曲張中血管平滑肌細(xì)胞去分化的影響及其機(jī)制研究

趙松峰，胡靈，杜麗蘋

（鄭州大學(xué)附屬洛陽(yáng)中心醫(yī)院 血管外科，河南 洛陽(yáng) 471009）

論著

M i c roRN A-599對(duì)靜脈曲張中血管平滑肌細(xì)胞去分化的影響及其機(jī)制研究

趙松峰，胡靈，杜麗蘋

（鄭州大學(xué)附屬洛陽(yáng)中心醫(yī)院 血管外科，河南 洛陽(yáng) 471009）

目的研究m i c ro R NA-599（m i R-599）在曲張靜脈中的表達(dá)，探討m i R-599是否通過下調(diào)血小板源性生長(zhǎng)因子B（P D G F-BB），抑制曲張靜脈中血管平滑肌細(xì)胞（V S MC s）去分化。方法收集大隱靜脈移植術(shù)患者中曲張靜脈和正常靜脈標(biāo)本，通過實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（q R T-P C R）檢測(cè)42例曲張靜脈組織及39例正常靜脈組織中m i R-599、m i R-200、m i R-145、m i R-146b、m i R-155的表達(dá)；W e s t e r n blot檢測(cè)兩組標(biāo)本中S M-a c t in、S M-22、S M-MC H、O P N的表達(dá)；在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，轉(zhuǎn)染m i R-599m i m i c和m i R-N C至離體培養(yǎng)的V S MC s中，W e s t e r n blot檢測(cè)V S MC s中S M-a c t in、S M-22、S M-MC H、O P N、P D G F-BB的表達(dá)，噻唑藍(lán)法測(cè)細(xì)胞增殖、劃痕實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞遷移，利用熒光素酶試驗(yàn)驗(yàn)證P D G F是m i R-599的靶基因。結(jié)果相比于正常靜脈組織，m i R-599在曲張靜脈中的表達(dá)降低（F=73.012，P=0.001）。兩組m i R-146b、m i R-200、m i R-30、m i R-155的表達(dá)量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。相比于正常靜脈組織，曲張靜脈組織中S M-a c t in、S M-22、S M-MC H的表達(dá)降低（P＜0.05），O P N的表達(dá)升高（F=56.414，P=0.009）；在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，相比于對(duì)照組，m i R-599組V S MC s中S M-a c t in、S M-22、S M-MC H的表達(dá)升高（P＜0.05），O P N的表達(dá)降低（F=27.353，P=0.022），細(xì)胞增殖減少（F= 37.824，P=0.016），遷移減少（F=69.365，P=0.001），P D G F表達(dá)量減少（F=55.345，P=0.004）。熒光素酶試驗(yàn)結(jié)果顯示，m i R-599能夠降低P D G F-3'-U T R質(zhì)粒的熒光素活性（F=21.429，P=0.036）。結(jié)論在曲張靜脈組織中，m i R-599低表達(dá)。在V S MC s中，m i R-599可以通過下調(diào)P D G F-BB而抑制V S MC s去分化。

下肢靜脈曲張；m i c ro R NA-599；血管平滑肌細(xì)胞；細(xì)胞分化

下肢靜脈曲張是指下肢淺靜脈系統(tǒng)過分迂曲、伸長(zhǎng)和擴(kuò)張，一般發(fā)生在大隱靜脈，是血管外科常見病之一，其發(fā)病機(jī)制尚不清楚［1-2］。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道顯示，靜脈曲張的病理生理基礎(chǔ)為血管重塑，其中血管平滑肌細(xì)胞（v asc u lar smooth m u scle cells，V S MC s）去分化在血管重塑過程中發(fā)揮重要作用［3-6］。

M icro R N A（以下簡(jiǎn)稱mi R）是一類長(zhǎng)度為18～25個(gè)核苷酸的普遍存在于細(xì)胞中的非編碼R N A。mi R為單鏈R N A分子，來源于內(nèi)源轉(zhuǎn)錄本，主要作用于靶基因3'非翻譯區(qū)（3’-u ntranslated re g ions，3’U T R），引起靶m R N A的降解或抑制其翻譯，從而調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)［7］。研究證實(shí)，mi R還可以通過與靶基因的5’-U T R或開放讀框序列結(jié)合發(fā)揮同樣的作用［8］。大量研究所證實(shí)，mi R在血管平滑肌細(xì)胞去分化中具有重要的調(diào)控作用，其中以mi R-599、mi R-200、mi R N A-145、mi R-146b、mi R-155的研究最為熱門［9-12］。但是上述5個(gè)mi R在靜脈曲張中的作用尚未闡明。

血小板源性生長(zhǎng)因子B（platelet deri v ed g ro w th f actor-BB，P D G F-BB）是目前公認(rèn)的，可以誘導(dǎo)V S CM s表型轉(zhuǎn)化的一種生長(zhǎng)因子［13］。M A R T I N［14-15］和W A G NE R等［16］的研究發(fā)現(xiàn)，瑞舒伐他汀可以通過抑制P D G F-BB的表達(dá)從而抑制V S MC s的表型轉(zhuǎn)化。

本實(shí)驗(yàn)擬通過實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time q u antitati v e polymerase chain reaction，q R TPC R）檢測(cè)靜脈曲張組織及對(duì)應(yīng)正常靜脈組織中mi R-599、mi R-200、mi R-145、mi R-146b、mi R-155的表達(dá)，篩選出與靜脈曲張相關(guān)的mi R N A，并通過細(xì)胞離體實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證mi R-599是否可以抑制V S MC s去分化及其作用機(jī)制是否為通過下調(diào)P D G F-BB。

1　資料與方法

1.1一般資料

選取2012年8月-2015年6月在鄭州大學(xué)附屬洛陽(yáng)中心醫(yī)院行大隱靜脈移植術(shù)患者曲張靜脈（42例）和正常靜脈標(biāo)本（39例）。其中，男性23例，女性19例；年齡45～76歲，平均（54.0±5.6）歲，樣品采集后立即置入-80℃冰箱冷凍保存，并經(jīng)病理診斷證實(shí)。本研究中患者均簽署知情同意書，并由鄭州大學(xué)附屬洛陽(yáng)中心醫(yī)院倫理委員會(huì)審核通過。

1.2方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)試劑人血管平滑肌細(xì)胞T/G H A-V S MC（上海鈺博生物科技有限公司），達(dá)爾伯克必需基本培養(yǎng)基 （d u lbecco's minim u messential medi u m，D M E M）胰蛋白酶（美國(guó)S i g ma公司），胎牛血清（美國(guó)G ibco公司），R N A提取試劑（美國(guó)I n v itro g en公司），Ta K a R a逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（大連寶生生物工程有限公司），限制性內(nèi)切酶B am HⅠ、X hoⅠ、T4 DN A連接酶，無內(nèi)毒素質(zhì)粒小、大提取試劑盒，S YB R G reen熒光染料試劑盒（瑞士R oche公司），脂質(zhì)體2000（上海英駿公司），4，6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚（瑞士R cohe公司），噻唑藍(lán)［3-（4，5-dimethyl-2-thia z olyl）-2，5-diphenyl-2-H-tetra z oli u m bromide，M TT］（美國(guó) Em resco公司），兔或鼠抗人S M-actin、S M-22、S M-MC H、O P N、P D G F-BB、肌動(dòng)蛋白β多克隆抗體（英國(guó)A b cam公司），辣根過氧化酶標(biāo)記的山羊抗兔或者抗鼠二抗、異硫氰酸熒光素（f l u orescein isothiocyanate，F(xiàn) I T C）、紅色異硫氰酸熒光素（red f l u orescein isothiocyanate，F(xiàn) R I T C）標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白G（美國(guó)J ac k son公司），W estern blot檢測(cè)相關(guān)試劑（江蘇碧云天生物技術(shù)研究所）。

1.2.2q R T-P C R反應(yīng)檢測(cè)基因表達(dá)提取曲張靜脈和正常靜脈組織中總R N A，將提取的R N A進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄成cDN A，反應(yīng)體系為20μl，反應(yīng)條件為：16℃預(yù)變性30min，45℃變性30min，85℃退火5min。運(yùn)用S YB R G reen法檢測(cè)mi R-599、mi R-200、mi R-145、mi R-146b、mi R-155的表達(dá)，反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性15 min，94℃變性30s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)，72℃繼續(xù)延伸8min。每組樣品重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，統(tǒng)計(jì)分析曲張靜脈和正常靜脈組織中mi R-599、mi R-200、mi R-145、mi R-146b、mi R-155的表達(dá)。其次，在質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后將V S MC s分成空白對(duì)照組、過表達(dá)mi R-599組和無效處理組3組，提取總R N A，反轉(zhuǎn)錄cDN A，用S YB R G reen法，用 A B I P R I S M 7500自動(dòng)熒光 PC R儀進(jìn)行q R T-PC R反應(yīng)檢查mi R-599m R N A表達(dá)水平，每組樣品重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，設(shè)定閾值，測(cè)定平均的C t值。

1.2.3W e s t e r n blot檢測(cè)蛋白表達(dá)量提取曲張靜脈和正常靜脈組織中總蛋白，二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，B C A）法定量蛋白，聚丙烯酰胺凝膠電泳膠每孔加入30μl樣品，70 V 30min進(jìn)行蛋白濃聚，110 V 2 h進(jìn)行凝膠電泳，并用孔徑0.45μm聚偏氟乙烯膜250m A 100min進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜后經(jīng)常溫下三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽溶液（tris b uff ered saline and t w een 20，T B S T）洗膜3次、封閉1 h后，以1∶1 000濃度加入兔（鼠）抗人S M-actin一抗（或抗S M-22、S M-M H C、O P N、P D G F-BB、肌動(dòng)蛋白β一抗），4℃孵育過夜，常溫下T B S T洗膜3次，辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔（鼠）二抗孵育后增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法（enhanced chemil u minescence，E C L）檢測(cè)?？逻_(dá)膠片暗室顯影，Q u antity one軟件分析。其次，在質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后將V S MC s分成空白對(duì)照組、過表達(dá)mi R-599組和無效處理組3組，提取總蛋白，檢測(cè)各組中S M-actin、S M-22、S M-M H C、O P N、P D G F-BB、肌動(dòng)蛋白β的表達(dá)。

1.2.4轉(zhuǎn)染細(xì)胞株mi R-599-mimic由上海吉瑪公司設(shè)計(jì)合成，mi R-599-mimic序列為，正向引物：5'-G UU G U G U C A G UUUVU C AAA C-3'，反向引物：5'-G U UU G A U AAA C U G A C A C AA C-3'。對(duì)照序列為，正向引物：5'-G UU G U G U C A G A UUVU C AA U C-3'，反向引物：5'-G A UU G A U AA U C U G A C A C AA C-3'將V S MC細(xì)胞接種至6孔板，生長(zhǎng)至50%～70%密度時(shí)，以脂質(zhì)體2 000分別轉(zhuǎn)染mi R-599 mimic或mimic-對(duì)照各100 pmol 24 h后，提取總R N A后PC R鑒定轉(zhuǎn)染效率，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.5M TT法測(cè)V S MC s增殖在質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后將V S MC s分成空白對(duì)照組、過表達(dá)mi R-599組和無效處理組3組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，2個(gè)不加細(xì)胞的空白孔。細(xì)胞在各自條件下培養(yǎng)24、48和72 h。培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入M TT液20μl，37℃下繼續(xù)孵育4～6 h，小心棄去培養(yǎng)上清液，每孔加入150μl改良Ea g le培養(yǎng)基溶液，震蕩10min，選擇492 nm波長(zhǎng)在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定各孔吸光度值并記錄。以時(shí)間為橫軸，吸光值為縱軸繪制各組V S MC s細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.2.6細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)測(cè)V S MC s遷移在質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后將V S MC s分成空白對(duì)照組、過表達(dá)mi R-599組和無效處理組3組。1.8mmol/L羥基脲作用12 h抑制細(xì)胞增殖，100μl黃色槍頭垂直孔板制造細(xì)胞劃痕，吸掉細(xì)胞培養(yǎng)液，磷酸鹽緩沖溶液（phosphate b uff er saline，P B S）沖洗孔板3次。在相應(yīng)的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)細(xì)胞，拍照記錄0、12、24、48和72 h圖片，用I ma g e pro pl u s 6.0軟件分析計(jì)算細(xì)胞遷移面積，并以遷移面積和原劃痕面積比值來表示各組V S MC s遷移的多少。

1.2.7細(xì)胞免疫熒光法檢測(cè)各組中S M-a c t in在細(xì)胞中的分布及表達(dá)在質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后將V S MC s分成空白對(duì)照組、過表達(dá)mi R-599組和無效處理組3組。P B S洗3遍，用4%多聚甲醛固定，0.25%Triton X 100穿破細(xì)胞膜，山羊血清室溫封閉1 h，加入稀釋250倍的anti-S M A抗體，4℃過夜，P B S清洗3遍，加入結(jié)合有異硫氰酸熒光素的山羊抗兔二抗，室溫孵育1 h，P B S清洗3遍，熒光顯微鏡拍照后圖片用I ma g e pro pl u s 6.0分析。

1.2.8熒光素酶試驗(yàn)設(shè)計(jì)合成P D G F-BB-3'-U T R的序列及突變序列，以P D G F-BB質(zhì)粒為載體，分別構(gòu)建能夠表達(dá)熒光素酶的包含P D G F-BB-3'-U T R 和P D G F-BB-3'-U T R突變序列的質(zhì)粒，然后將V S MC s按每孔1×105接種至24孔板，24 h后以脂質(zhì)體2 000共轉(zhuǎn)染200 n g包含P D G F-BB-3'-U T R 或P D G F-BB-3'-U T R突變序列的熒光素酶質(zhì)粒和80 n g海腎熒光質(zhì)粒，以及60 pmol mi R-599-mimic或?qū)φ眨?8 h后用熒光檢測(cè)儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度，海腎熒光作為內(nèi)參照，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用S P SS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組比較用單因素方差分析，兩兩比較用LS D法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1V SMC去分化相關(guān)的m i RN A s和蛋白質(zhì)在曲張靜脈和正常靜脈組織中的表達(dá)

q R T-PC R反應(yīng)檢測(cè)曲張靜脈和正常靜脈組織中mi R-599、mi R-200、mi R-145、mi R-146b、mi R-155的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，曲張靜脈組織中mi R-599的表達(dá)低于正常靜脈組織（F=73.012，P=0.001）（見圖1A）。兩組m i R-200、mi R-145、mi R-146b、mi R-155的表達(dá)量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。W estern blot檢測(cè)曲張靜脈和正常靜脈組織中S M-actin、S M-22、S M-MC H、O P N的表達(dá)，相比對(duì)正常靜脈組織，曲張靜脈組織中S M-22、S M-MC H表達(dá)減少，O P N表達(dá)增多（F=56.414，P=0.009）；兩組S M-actin表達(dá)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見圖1B）。

2.2m i R-599對(duì)V SMCs增殖和遷移的影響

mi R-599minic轉(zhuǎn)染V S MC s后，R eal-time q PC R反應(yīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)mi R-599組中mi R-599的表達(dá)較對(duì)照組和空質(zhì)粒升高（F=65.753，P=0.001）（見圖2A）。12 h時(shí)3組V S MC s的增殖比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；干預(yù)24 h后，相比于對(duì)照組和空質(zhì)粒組，mi R-599組中V S MC s增殖減少（F=37.824，P=0.0161）（見圖2B）。干預(yù)48 h后，相比于對(duì)照組和空質(zhì)粒組，mi R-599組中V S MC s遷移減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=69.365，P=0.001）（見圖2C）。

2.3m i R-599對(duì)V SMCs中SM-a c t i n、SM-22、SM-MC H、OPN、PD GF-BB表達(dá)的影響

圖1　曲張靜脈和正常靜脈組織中V SMC去分化相關(guān)的m i RN A s以及蛋白質(zhì)表達(dá)

圖2　M i R-599抑制V SMCs的增殖和遷移

mi R-599mimic轉(zhuǎn)染V S MC s后，W estern blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，相比于對(duì)照組和空質(zhì)粒組，mi R-599組V S MC s中S M-22、S M-M H C表達(dá)增多，O P N表達(dá)減少（F=27.353，P=0.022）。3組S M-actin表達(dá)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖3。

2.4m i R-599對(duì)V SMCs形態(tài)的影響

M i R-599mimic轉(zhuǎn)染V S MC s后，免疫熒光結(jié)果顯示，mi R-599組V S MC s形態(tài)細(xì)長(zhǎng)，呈典型的血管平滑肌細(xì)胞形態(tài)，對(duì)照組和空質(zhì)粒組中平滑肌細(xì)變圓變寬，失去原有的細(xì)胞形態(tài)。見圖4。

2.5m i R-599通過識(shí)別3'-UTR抑制PD GF-BB的表達(dá)

分別構(gòu)建包含P D G F-BB-3'-U T R和其突變序列的熒光素酶質(zhì)粒（見圖5A），與mi R-599-mimic對(duì)照共轉(zhuǎn)V S MC s細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后，檢測(cè)各組細(xì)胞熒光素酶活性，結(jié)果顯示，mi R-599-mimic+W T-P D G FBB-3'-U T R組熒光素酶活性低于空質(zhì)粒+W TP D G F-BB-3'-U T R組（F=21.429，P=0.036）（見圖5B）。W estern blot檢測(cè)結(jié)果顯示，相比于對(duì)照組和空質(zhì)粒組，mi R-599組V S MC s中P D G F-BB表達(dá)降低（F= 55.345，P=0.004）（見圖5C）。

圖3　M i R-599對(duì)V SMCs中細(xì)胞分化狀態(tài)標(biāo)志蛋白表達(dá)的影響

圖4　細(xì)胞免疫熒光法觀察各組的細(xì)胞形態(tài) （×200）

圖5　m i R-599通過識(shí)別3'-UTR抑制PD GF-BB的表達(dá)

3　討論

在不同的外界因素影響下，V S MC s處于不同的分化狀態(tài)，具有很強(qiáng)的可塑性。在正常血管膜中的V S MC s是一種高分化的細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)呈梭形，主要起維持血管形狀和收縮血管的作用，具有低增殖、低遷移、低蛋白分泌等特征［17-18］。當(dāng)發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化、靜脈擴(kuò)張、動(dòng)脈瘤等血管疾病時(shí)，V S MC s可以去分化為未分化成熟的細(xì)胞，形態(tài)變圓，細(xì)胞收縮性能下降，表現(xiàn)出高增殖、高遷移、高蛋白分泌等特征［19-22］。

靜脈曲張時(shí)靜脈管腔明顯擴(kuò)張，局部管壁厚薄不均，管壁硬度增加而順應(yīng)性減低，目前認(rèn)為血管重塑是靜脈曲張的基本病理生理過程［23］。V S MC s去分化作為血管重塑的關(guān)鍵和始動(dòng)環(huán)節(jié)，在靜脈曲張的發(fā)生、發(fā)展發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。J I A N G等［21］發(fā)現(xiàn)在靜脈曲張發(fā)生時(shí)，位于靜脈管壁的收縮型V S MC s去分化為合成型細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，靜脈曲張組織中S M-22、S M-MC H等V S MC s分化狀態(tài)標(biāo)志性蛋白表達(dá)減少，而合成型細(xì)胞標(biāo)志蛋白O P N表達(dá)增多，同樣證實(shí)靜脈曲張的病理機(jī)制中有V S MC s去分化的參與。

mi R是一類進(jìn)化上高度保守的非編碼小分子單鏈R N A，越來越多的證據(jù)顯示，mi R參與對(duì)細(xì)胞增殖、遷移和細(xì)胞表型的調(diào)控［24］。目前經(jīng)證實(shí)的與V S MC s去分化相關(guān)的mi R主要包括：mi R-599、mi R-200、mi R-145、mi R-146b、mi R-155、mi R-146a、mi R-133、mi R-221、mi R-222、mi R-21和mi R-143［13］。在大鼠V S MC s離體實(shí)驗(yàn)中，mi R-143和mi R-145表達(dá)量較高，加入P D G F-BB后，這兩種mi R表達(dá)量驟減。在用球囊損傷血管后，mi R-143和mi R-145基因敲除的小鼠V S MC s分化受阻，說明上述mi R在血管損傷后的修復(fù)過程中發(fā)揮重要作用［25］。C H EN G等［26］的實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探明mi R-145是通過抑制K L F5的表達(dá)，從而減少球囊損傷后血管中V S MC s的增殖和遷移。最近X I E等［9］的研究在細(xì)胞和動(dòng)物兩個(gè)層面證實(shí)mi R-599是通過靶向結(jié)合T G F-βⅡ受體基因，從而抑制V S MC s的增殖。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，mi R-599在靜脈曲張組織中表達(dá)減少，并進(jìn)一步在離體實(shí)驗(yàn)中證實(shí)mi R-599可以抑制V S MC s的增殖、遷移及去分化。

P D G F-BB是最早發(fā)現(xiàn)的一種可以促進(jìn)V S MC s去分化的因素，是一種較強(qiáng)的促有絲分裂因子，具有促增殖和遷移的生物活性，能引起V S MC s的合成及分泌功能增強(qiáng)［27］。P D G F-BB通過誘導(dǎo)特定DN A的表達(dá)或沉默，最終導(dǎo)致V S MC s去分化。分化成熟的V S MC合成和分泌P D G F-BB的能力很弱。目前已知P D G F-BB主要通過M KK6/p38和M A P K M E K1/E R K兩條途徑發(fā)揮促V S MC s去分化的作用［28］。筆者用熒光素酶實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，mi R-599是通過與P D G FBB-3'-U T R靶向結(jié)合，減少P D G F-BB的表達(dá)，從而發(fā)揮其抑制V S MC s去分化的作用。

本實(shí)驗(yàn)通過q R T-PC R反應(yīng)檢測(cè)靜脈曲張組織及正常靜脈組織中mi R-599、mi R-200、mi R-145、mi R-146b、mi R-155的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)mi R-599在靜脈曲張組織中表達(dá)減少，同時(shí)發(fā)現(xiàn)靜脈曲張組織中P D G F-BB的表達(dá)增加，V S MC s分化表型的標(biāo)志性蛋白表達(dá)減少。在離體實(shí)驗(yàn)中證實(shí)mi R-599可以抑制V S MC s增殖、遷移、去分化，并進(jìn)一步通過螢光素酶實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其機(jī)制是通過靶向抑制P D G F-BB的表達(dá)，為闡明靜脈曲張的發(fā)病機(jī)制提供新的思路。

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（童穎丹 編輯）

M icroRNA-599 inhibits vascular smooth muscle cell dedifferentiation and its mechanism in varicose veins

Song-feng Zhao，Ling Hu，Li-ping Du
（Department of Vascular Surgery，Luoyang Central Hospital Affiliated to Zhengzhou University，Luoyang，Henan 471009，China）

Objective To verify whether microRNA-599（miR-599）could inhibit vascular smooth muscle cell（VSMC）dedifferentiation by targeting platelet-derived growth factor-BB（PDGF-BB）in varicose veins. M ethods Varicose veins and normal samples were collected from patients undergoing great saphenous vein transplantation surgery.qRT-PCR was used to test the expressions of miR-599，miR-200，miR-145，miR-146b and miR-155 in the varicose veins.Western blot was used to test the expressions of SM-actin，SM-22，SM-MCH and OPN.For in vitro experiment，after miR-599 was transfected into VSMCs，MTT was used to investigate the proliferation ability of VSMCs，wound healing was employed to test the migratory ability of VSMCs，Western blot was used to investigate the expressions of SM-actin，SM-22，SM-MHC，OPN and PDGF-BB in VSMCs.Luciferase assay was used to confirm whether PDGF-3'-UTR was the target gene of miR-599.Results Compared with the healthy control tissue，the expressions of miR-599，SM-actin，SM-22and SM-MHC in the varicose veins were significantly decreased（P＜0.05）；meanwhile the expression of OPN increased（P＜0.01）.The result of the in vitro experiment showed that compared with the control group，the expressions of SM-actin，SM-22 and SM-MHC were increased in the miR-599 group（P＜0.05），and the expression of OPN and PDGF-BB decreased（P＜0.05）.The luciferase activity of the PDGF-3'-UTR plasmid was suppressed by miR-599（P＜0.05）.Conclusions In varicose veins，the expression of miR-599 decreases. miR-599 inhibits VSMC dedifferentiation by targeting PDGF-3'-UTR.

varicose vein；miR-599；VSMC；dedifferentiation

R 654.4

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.15.017

1005-8982（2016）15-0091-07

2016-01-20