腫瘤壞死因子-α基因多態(tài)性與中國漢族人群乙肝病毒感染的相關性研究*

劉麗軍

（西藏民族大學醫(yī)學院，陜西 咸陽 712082）

論著

腫瘤壞死因子-α基因多態(tài)性與中國漢族人群乙肝病毒感染的相關性研究*

劉麗軍

（西藏民族大學醫(yī)學院，陜西 咸陽 712082）

目的探討中國漢族人群腫瘤壞死因子-α（TN F-α）基因單核苷酸多態(tài)性（r s1800629和r s361525）與乙型肝炎病毒（H B V）感染的相關性。方法用T a q M a n探針對納入的1 097例樣本進行TN F-α、r s1800629和r s361525位點多態(tài)性檢測，血樣本包括429例慢性H B V感染者（C H組）、429例乙肝感染后自發(fā)清除者（S R組）及239例健康對照者（H C組）。結(jié)果①C H組與S R組比較，r s1800629 G A基因型與G等位基因與感染后病毒的自發(fā)清除有關［基因型：O R＾=0.369，P=0.000；等位基因：O R＾=2.210，P=0.000；顯性模型（GG v s G A+AA）：O R＾=0.536，P=0.000］。②C H組與S R組比較，SN P r s361525 G A基因型或A等位基因與感染后病毒的自發(fā)清除密切相關［基因型：O R＾=0.288，P=0.000；等位基因：O R＾=0.549，P=0.000；顯性模型（GG v s G A+AA）：O R＾=0.634，P=0.000］。結(jié)論TN F-α基因多態(tài)性與中國漢族人群H B V病毒感染后的自發(fā)清除密切相關。

乙型肝炎；單核苷酸多態(tài)性；腫瘤壞死因子-α基因

慢性乙型肝炎病毒（hepatitis B v ir u s，HBV）感染是我國面臨的一個嚴峻的衛(wèi)生問題。盡管大部分的感染者能自發(fā)清除病毒，但仍有約5%～10%的感染者發(fā)展為慢性感染［1］。半數(shù)以上慢性HBV感染患者病情穩(wěn)定，可表現(xiàn)為無癥狀攜帶或輕度慢性肝炎。部分患者則會進展為肝硬化或肝癌等嚴重的肝?。?］。影響HBV感染結(jié)局的因素主要是宿主、病毒及環(huán)境3大因素，越來越多的證據(jù)表明宿主遺傳因素在慢性HBV感染中發(fā)揮重要作用［3］。

腫瘤壞死因子-α（t u mor necrosis f actor-α，TN F-α）作為一種重要的細胞因子，被證實參與HBV病毒清除的過程［4］。近年來有報道稱，TN F-α啟動子區(qū)單核苷酸多態(tài)性位點rs1800629與rs361525與HBV慢性感染有關［5-7］，但結(jié)論不一致。因此，本研究通過病例對照方法來探討TN F-α啟動子區(qū)基因多態(tài)性（rs1800629和rs361525）與乙型肝炎病毒感染結(jié)局的相關性。

1　資料與方法

1.1研究對象

選取2011年1月-2015年6月就診于西藏民族大學附屬醫(yī)院的無血緣關系的患者。其中包括正常對照組（H C組）、自發(fā)清除組（SR組）、慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，C HB）（C H組）、乙肝肝硬化（cirrhosis o f li v er，L C）、乙肝肝癌（hepatocell u lar carcinoma，H CC）。診斷標準參見《慢性乙型肝炎防治指南》。排除標準：①HBV血清兩對半標志物不明確者；②僅有乙型肝炎表面抗體陽性（+）的HBV疫苗接種者；③艾滋病或其他非HBV肝炎病毒感染者；④嚴重的系統(tǒng)性疾病如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、非H CC腫瘤等其他肝臟疾??；⑤如自身免疫型肝病、原發(fā)性膽汁性肝硬化等；⑥非漢族人。本研究得到西藏民族大學附屬醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會的批準，所有受試者簽署書面的知情同意書。

1.2樣本及生化指標的采集

采集每個受試者血液約3ml，置于-80℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆?。通過問卷調(diào)查方式收集其年齡、性別等基本情況。乙肝兩對半、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotrans f erase，A L T）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotrans f erase，A S T）、血清總膽紅素（total bilir u bin，T B I L）及乙肝病毒的脫氧核糖核酸（hepatitis B v ir u s-deo x yribon u cleic acid，HBV-DN A）水平的測定由本院檢驗科完成。

1.3DN A的提取與基因型分析

使用W i z ard G enomic DN A純化試劑盒（美國P rome g a公司）提取外周血基因組DN A。NanoDrop 2000（美國Thermo S cienti f ic公司）測定DN A濃度及光密度值，并稀釋成30 n g/μl備用。單核甘酸多態(tài)性（sin g le n u cleotide polymorphism，S N P）rs1800629 與rs361525分型采用Ta q M an探針法（美國A pplied B iosystems公司）。Ta q M an等位基因鑒別實驗由A B I 7500快速實時熒光聚合酶鏈反應（real-time polymerase chain reaction，R eal-time q PC R）系統(tǒng)完成（美國A pplied B iosystems公司）。其中每96孔設置1個陰性對照和1個陽性對照。聚合酶鏈式反應擴增反應體系為20μl，含30n g/μl DN A2μl，master mi x 10μl，primer-probe mi x 0.5μl及DN A ase-f ree w ater 7.5μl。PC R反應條件：95℃預變性10 min，92℃變性15 s，60℃退火1min，共39個循環(huán)。隨機選取10%樣本用同一方法重復驗證以保證分型準確，基因分型錯誤率＜0.1%。

1.4統(tǒng)計學方法

采用S P SS 22.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，H ardy-W einber g遺傳平衡由 HW E軟件完成，用S t u dent't檢驗或M ann-W hitney U檢驗，3組計量資料比較用方差分析；計數(shù)資料以用百分比或率表示，用χ2檢驗；基因型及基因模型使用二分類L o g istic回歸校正年齡與性別后進行比較。使用H aplo v ie w so f t w are（v4.2）軟件進行單體型分析?？紤]到多重檢驗的問題，P＜0.0125（0.05/4）為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

2.1基本資料及H ar d y-We i n ber g遺傳平衡

2.1.1基本資料本研究共納入1 097例患者，其中C H組429例，SR組429例，H C組239例。各組年齡比較，經(jīng)方差分析，差異無統(tǒng)計學意義（F=0.080，P=0.923）。3組男女比較，經(jīng)χ2檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=63.210，P=0.000），C H組男性比例高于SR組與H C組。3組A L T、A S T、T B I L、HBV-DN A定量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=15.049，P=0.005；F=49.216，P=0.000；F=7.594，P=0.023；F= 15.004，P=0.005），C H組高于SR組及H C組。見表1。

2.1.2H a rd y-W e in b e r g遺傳平衡rs1800629與rs361525均符合H ardy-W einber g遺傳平衡（SR組：rs1800629位點P=0.085，rs361525位點P=0.199；H C組：rs1800629位點P=0.136，rs361525位點P= 0.451）。

2.2TN F-α rs1800629基因型與乙肝感染結(jié)局的關系

rs1800629 G是各組中最常見的等位基因。攜帶rs1800629 G A基因型與G等位基因有利于感染后病毒的自發(fā)清除，該保護性作用在顯性遺傳模型中仍存在［C H組v s SR組基因型：O R＾=0.369，P=0.000；等位基因：O R＾=2.210，P=0.000；顯性模型（GG v s G A+ AA）：O R＾=0.536，P=0.000］（見表2）。在疾病進展方面，未發(fā)現(xiàn)多態(tài)性與疾病相關（見表3）。

2.3TN F-α rs361525基因型與乙肝感染結(jié)局的關系

攜帶G A基因型或A等位基因有利于感染后病毒的自發(fā)清除［C H組v s SR組基因型：O R＾=0.288，P= 0.000；等位基因：O R＾=0.549，P=0.000；顯性模型（GG v s G A+AA）：O R＾=0.634，P=0.000］（見表2）。在疾病進展方面，未發(fā)現(xiàn)多態(tài)性與疾病相關（見表3）。

2.4TN F-α基因單體型與乙肝病毒感染結(jié)局的關系

表1　各組納入研究者的人口學及臨床特征比較

表2　慢性乙肝感染與TN F-α基因型的關系

表3　慢乙肝進展與TN F-α基因多態(tài)性的關系

考慮到單體型在解釋多態(tài)性與疾病相關性上有更好的說服力，本研究以TN F-α兩位點為基礎構(gòu)建單體型。但未發(fā)現(xiàn)兩個位點之間能夠構(gòu)建單體型。

3　討論

TN F-α是由單核巨噬系統(tǒng)細胞產(chǎn)生的細胞因子，具有免疫調(diào)節(jié)作用，增加I L-1、I L-8和粒-巨噬細胞集落刺激因子的分泌，提高I L-2R基因表達的水平，促進T細胞增殖，增強抗體依賴細胞介導的細胞毒作用，促進B淋巴細胞增殖、分化和產(chǎn)生抗體等作用。

有研究發(fā)現(xiàn)，TN F-α 基因啟動子區(qū)域內(nèi)rs1800629和rs361525等S N P與丙型肝炎病毒感染、HBV感染及其抗病毒治療應答相關［8-10］。本研究主要探討 TN F-α 基因啟動子區(qū) rs1800629和rs361525位點多態(tài)性與HBV感染結(jié)局的相關性。

結(jié)果顯示，我國人群TN F-α基因rs1800629和rs361525位點基因型均以GG為主，等位基因頻率G＞A，與相關研究結(jié)果一致［6，11］。在HBV病毒感染后的自發(fā)清除方面，攜帶rs9275572 G等位基因表現(xiàn)出保護作用，且該效應在顯性模型中也有體現(xiàn)。攜帶rs361525 G A基因型或A等位基因有利于感染后病毒的自發(fā)清除，且該效應在顯性模型中同樣得到印證。本實驗結(jié)果與前人的研究一致［12-14］。rs1800629和rs361525位于TN F-α基因的啟動子區(qū)，不同的等位基因，可能會影響TN F-α啟動子的活性，進而影響TN F-α的表達，從而對HBV感染后的清除過程產(chǎn)生作用。

本研究將 rs1800629和 rs361525結(jié)合探討TN F-α基因多態(tài)性與乙肝感染結(jié)局的關系。然而，對于這2個位點來說，本研究較之其他研究仍有相悖之處［6，11］，考慮可能存在以下原因：①S N P受種族、地域等因素的影響，導致其遺傳差異顯著，這也是導致該研究與其他文獻報道差異的原因之一。②樣本量與其他混雜因素的存在，例如基因或者環(huán)境因素。本研究也存在一定的不足之處，例如納入研究的樣本量不夠多，這在一定程度上降低實驗的信度。今后需要更大樣本量、設計更嚴謹?shù)膶嶒炦M一步驗證。

總之，本研究表明，中國人TN F-α基因多態(tài)性與HBV病毒感染后病毒的自發(fā)清除有關，一定程度上為慢性乙型肝炎的早預防和高應答率的治療奠定基礎。

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（童穎丹 編輯）

Association between TNF-αgene polymorphism s and chronic hepatitis B virus infection*

Li-jun Liu
（Medical College of Xizang Minzu University，Xianyang，Shannxi 712082，China）

Objective To assess the relation between two single nucleotide polymorphisms（rs1800629 and rs361525）of TNF-αgene and the outcomes of HBV infection in Chinese Han population．M ethods TNF-α （rs1800629 and rs361525）was genotyped by TaqMan probe method in 1，097 subjects，including 429 patients with chronic HBV infection（CH），429 HBV spontaneous clearance subjects（SR）and 239 healthy control individuals（HC）.Results rs1800629 GA genotype and G allele showed significant protective effect on HBV spontaneous clearance［CH vs SR:genotype:O R＾=0.369，P=0.000；allele:O R＾=2.210，P=0.000；dominant model （GG vs GA+AA）:O R＾=0.536，P=0.000］.SNP rs361525 showed a significant association with HBV spontaneous clearance.The rs361525 GA genotype and A allele played a protective role［CH vs SR:genotype:O R＾= 0.288，P=0.000；allele:O R＾=0.549，P=0.000；dominant model （GG vs GA+AA）:O R＾=0.634，P=0.000］. Conclusions TNF-αgene polymorphisms are associated with HBV spontaneous clearance．

hepatitis B；single nucleotide polymorphism；tumor necrosis factor-αgene

R 512.6

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.15.016

1005-8982（2016）15-0087-04

2016-01-06

西藏自治區(qū)科技廳重點項目（No：Z2014A09G2-3）；西藏自治區(qū)科技廳項目（No：2015ZR-13-19）