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    Not c h1在肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化中的作用及表達(dá)變化*

    2016-09-01 02:13:04于秀文曾林祥
    關(guān)鍵詞:肌動(dòng)蛋白肺纖維化纖維細(xì)胞

    于秀文,曾林祥

    (1.浙江省杭州市蕭山區(qū)第一人民醫(yī)院 呼吸科,浙江 杭州 311200;2.南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院 呼吸科,江西 南昌 330006)

    論著

    Not c h1在肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化中的作用及表達(dá)變化*

    于秀文1,曾林祥2

    (1.浙江省杭州市蕭山區(qū)第一人民醫(yī)院 呼吸科,浙江 杭州 311200;2.南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院 呼吸科,江西 南昌 330006)

    目的探討在成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞過程中,N ot c h1表達(dá)的變化規(guī)律,以及γ-分泌酶抑制劑(DA P T)抑制N ot c h信號后,對細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響。方法取新出生2~3 d SD大鼠的肺組織,用胰酶消化法分離肺成纖維細(xì)胞,再將培養(yǎng)至第3代的細(xì)胞分為3組:對照組、轉(zhuǎn)化生長因子-β1(T G F-β1)組、T G F-β1+ DA P T組。對照組為空白對照,T G F-β1組加入5ng/m l T G F-β1,T G F-β1+DA P T組同時(shí)加入5 ng/m l T G F-β1及5μm ol/L DA P T。采用免疫細(xì)胞化學(xué)法對α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-S M A)的表達(dá)變化進(jìn)行檢測。同時(shí)通過逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(R T-P C R)及W e s t e r n blot檢測N ot c h1 mR NA和蛋白的表達(dá)變化。結(jié)果α-S M A免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果表明,對照組大部分細(xì)胞無染色,而T G F-β1組則可見大部分細(xì)胞內(nèi)有黃色和棕黃色顆粒及條紋,DA P T組和對照組無明顯差異。對照組、T G F-β1組、T G F-β1+DA P T組N ot c h1 mR NA表達(dá)量分別為(0.278±0.022)、(0.783±0.018)和(0.313±0.029),對照組與T G F-β1組、T G F-β1組與T G F-β1+DA P T組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),對照組與T G F-β1+DA P T組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。對照組、T G F-β1組、T G F-β1+DA P T組N ot c h1蛋白表達(dá)量分別為(0.312±0.019)、(0.701±0.026)和(0.345±0.022),組間比較結(jié)果同N ot c h1 mR NA。結(jié)論N ot c h1可以促進(jìn)成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化,進(jìn)而促進(jìn)肺纖維化。

    N ot c h1;α-平滑肌肌動(dòng)蛋白;肌成纖維細(xì)胞;肺纖維化

    Notch信號通路是一個(gè)調(diào)節(jié)細(xì)胞分化的經(jīng)典信號通路,1917年首次在果蠅體內(nèi)發(fā)現(xiàn),在多種動(dòng)物中都有其同源分子的存在,脊椎動(dòng)物細(xì)胞主要是對于4 種Notch受體及5種Notch配體有相應(yīng)的表達(dá)[1]。Notch信號通路生物學(xué)作用的發(fā)揮需要經(jīng)過3步酶切作用,以及多種信號分子的聯(lián)鎖反應(yīng),而γ-分泌酶復(fù)合體的酶切作用則是其中最關(guān)鍵的環(huán)節(jié),用γ-分泌酶抑制劑{N-[N-(3,5-di f l u orophenacetyl)-L-alanyl]-(S)-phenyl g lycinet-b u tylester,D A P T}能夠?qū)τ讦?分泌酶復(fù)合體進(jìn)行抑制,也就阻斷Notch信號通路。

    Notch信號通路在多種組織器官的發(fā)育和動(dòng)態(tài)平衡中發(fā)揮重要作用,可以通過控制呼吸系統(tǒng)中多種細(xì)胞的功能和分化的方式,來調(diào)節(jié)肺的發(fā)育和維持成人體內(nèi)呼吸道細(xì)胞種類的平衡[2],同時(shí)在慢性肺部疾病,如慢性阻塞性肺疾病、肺纖維化、肺動(dòng)脈高壓、哮喘和肺癌中發(fā)揮重要作用[3]。近年來,有關(guān)Notch信號通路在肺損傷及肺纖維化中的作用機(jī)制亦是研究的熱點(diǎn),但仍然不甚明確。本研究旨在探討成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞過程中,Notch1的作用及表達(dá)變化,為臨床治療肺纖維化提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1實(shí)驗(yàn)試劑

    兔抗山羊Notch1多克隆二抗(美國S anta cr uz公司),山羊抗鼠Notch1多克隆一抗(美國S anta cr uz公司),免疫組織化學(xué)法試劑(北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司),鼠α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth m u scle actin,α-S M A)單克隆抗體(武漢博士德公司),鼠β-肌動(dòng)蛋白多克隆抗體、蛋白抽提試劑盒、二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,B C A)法蛋白定量試劑盒(美國P ierce公司),彩色預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)(上海碧云天生物技術(shù)研究所),DN A M ar k er(北京天根生物科學(xué)技術(shù)有限公司),逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(re v erse transcription-polymerase chain reaction,R T-PC R)試劑盒(大連寶生生物工程有限公司),轉(zhuǎn)化生長因子-β1(trans f ormin g g ro w th f actor-β1,T G F-β1)(美國P eproTech公司),D A P T(美國S i g ma公司),總R N A提取試劑。

    1.2細(xì)胞分組

    試驗(yàn)動(dòng)物為江西中醫(yī)學(xué)院動(dòng)物房所提供的出生2~3 d的S D大鼠乳鼠(批號:J Z D W N O:2011-0093)。取其肺組織培養(yǎng)為肺成纖維細(xì)胞,具體培養(yǎng)方法參照文獻(xiàn)并加以改進(jìn)[4]。取第3代成纖維細(xì)胞,接種于6孔板,細(xì)胞密度達(dá)到85%~90%時(shí),無血清同步24h。把細(xì)胞分為對照組、T G F-β1組和T G F-β1+D A P T組。其中,對照組為空白對照,在T G F-β1組中,T G F-β1的量為5 n g/ml,T G F-β1+D A P T組先加入終濃度為5μmol/l的D A P T,30min后再加入終濃度為5 n g/ml的T G F-β1,每組復(fù)孔3個(gè),觀察24 h后,分別用于提取細(xì)胞總R N A及總蛋白。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

    1.3α-SM A免疫細(xì)胞化學(xué)實(shí)驗(yàn)

    將18mm×18mm蓋玻片置于6孔板內(nèi),同時(shí)在六孔板中進(jìn)行第3代成纖維細(xì)胞的接種,其密度為每孔約1×105個(gè)細(xì)胞,按上述方法將細(xì)胞分為3組,每組復(fù)孔3個(gè),觀察24 h后取出蓋玻片,4%多聚甲醛固定細(xì)胞,再用3%雙氧水H2O2處理細(xì)胞10 min,封閉內(nèi)源性過氧化物酶活性,磷酸鹽緩沖溶液(phosphate b uff er saline,P B S)沖洗3次,10%動(dòng)物血清封閉10min,降低非特異性結(jié)合,一抗4℃過夜,P B S沖洗3次,室溫下孵育二抗1 h,鏈霉親和素-生物素復(fù)合物(strept a v idin-biotin comple x,S A B C)復(fù)合物室溫下30min,二氨基聯(lián)苯胺顯色,蘇木素復(fù)染,中性樹膠封片后,光鏡下觀察各組染色變化,α-S M A陽性標(biāo)準(zhǔn)以出現(xiàn)棕黃色顆?;驐l紋為依據(jù),隨機(jī)觀察10個(gè)高倍視野,計(jì)算陽性率。

    1.4RT-PCR反應(yīng)檢測Not c h1 m RN A

    通過胰酶消化法實(shí)現(xiàn)對于六孔板內(nèi)細(xì)胞的提取,Tri z ol法提取細(xì)胞總R N A并逆轉(zhuǎn)錄成cDN A。Notch1引物由美國I n v itro g en生命技術(shù)公司設(shè)計(jì)并合成,正向引物為:5'-G AA GG AA CG A GCC T GGG T GC C T G T A-3',反向引物為:5'-T GGC T GGG A GC A T C T C AA GCC T-3',擴(kuò)增引物268 bp。反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性5 min,94℃變性30 s,59℃退火30 s,72℃延伸1min,共30次循環(huán),總時(shí)間8min。在進(jìn)行電泳時(shí),取6μl PC R產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳,對于結(jié)果通過凝膠成像分析系統(tǒng)的紫外分光成像進(jìn)行相應(yīng)分析,對于積分吸光度進(jìn)行記錄。

    1.5Wester n blot檢測Not c h1蛋白

    使用單去污細(xì)胞裂解液提取6孔板內(nèi)細(xì)胞總蛋白,沸水煮10min使蛋白變性,冷卻至室溫后,置入-20℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆?。B C A法進(jìn)行蛋白定量,取變性后的蛋白質(zhì)樣品行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(sodi u m dodecyl s u l f ate-polyacrylamide g elelectrophoresis,S D S-P A G E)電泳,每個(gè)泳道上樣量為30μg,用垂直電泳儀進(jìn)行電泳后取下凝膠,將蛋白轉(zhuǎn)移至0.45mm醋酸纖維膜上,依次進(jìn)行封閉、洗膜,加一抗在4℃孵育過夜(稀釋至1∶200),二抗室溫孵育2 h(稀釋至1∶5 000)。通過化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行顯影,將Notch1和β-肌動(dòng)蛋白的灰度值進(jìn)行相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)化后,計(jì)算Notch1蛋白表達(dá)的相對半定量比值。

    1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    采用S P SS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,計(jì)量分析用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,多個(gè)樣本均數(shù)比較用單因素方差分析,組間比較用LS D-t檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1α-SM A免疫細(xì)胞化學(xué)

    在對照組中,染色的細(xì)胞只占一小部分,能夠看到少部分細(xì)胞中有淡黃色的顆?;蛘呤菞l紋,但是黃色以及棕黃色的顆粒和條紋卻是極少的。但是T G F-β1組出現(xiàn)黃色以及棕黃色顆粒及條紋的細(xì)胞占據(jù)大多數(shù)。對照組、T G F-β1組、T G F-β1+D A P T組的α-S M A免疫細(xì)胞化學(xué)陽性率分別為(0.314± 0.019)%、(0.704±0.022)%和(0.339±0.026)%,經(jīng)方差分析,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=10.172,P=0.072)。T G F-β1組與對照組和T G F-β1+D A P T組比較,經(jīng)LS D-t檢驗(yàn),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=23.176和18.354,P=0.023和0.034),T G F-β1組較對照組和T G F-β1+ D A P T組的α-S M A表達(dá)增加。T G F-β1+D A P T組與對照組比較,經(jīng)LS D-t檢驗(yàn),差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t= 2.573,P=0.112)。見圖1。

    圖1 α-SM A細(xì)胞免疫化學(xué)電鏡圖 (×30)

    2.2Not c h1 m RN A的表達(dá)

    在對于R T-PC R產(chǎn)物進(jìn)行電泳時(shí),在268和207bp處,Notch1與β-肌動(dòng)蛋白有著一定的表達(dá)條帶。對照組、T G F-β1+D A P T組、T G F-β1組的 Notch1 m R N A表達(dá)量分別為(0.278±0.022)、(0.313±0.029)和(0.783±0.018),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,T G F-β1組Notch1 m R N A表達(dá)量升高,而對照組與D A P T組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見附表和圖2。

    2.3Not c h1蛋白的表達(dá)

    Notch1蛋白在120 k D處表達(dá),在對照組(0.312±0.019)僅有少量Notch1表達(dá)。T G F-β1+D A P T組(0.345±0.022)與對照組的Notch1蛋白表達(dá)比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。T G F-β1組(0.701±0.026)較對照組及T G F-β1+D A P T組中Notch1表達(dá)升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見附表和圖3。

    圖2 RT-PCR反應(yīng)檢測各組細(xì)胞中Not c h1 m RN A表達(dá)的變化

    附表 Not c h1 m RN A積分吸光度值比較 (n=3

    附表 Not c h1 m RN A積分吸光度值比較 (n=3

    組別蛋白對照組 0 . 2 7 8 ± 0 . 0 2 2  0 . 3 1 2 ± 0 . 0 1 9 T G F -β1組 0 . 7 8 3 ± 0 . 0 1 8  0 . 7 0 1 ± 0 . 0 2 6 T G F -β1+ D A P T組 0 . 3 1 3 ± 0 . 0 2 9  0 . 3 4 5 ± 0 . 0 2 2 F值 1 2 . 8 2 9  9 . 7 5 4 P值 0 . 0 6 9  0 . 0 8 0 t1值 2 7 . 6 7 0  2 1 . 3 4 4 P1值 0 . 0 1 5  0 . 0 2 8 t2值 1 . 8 1 3  1 . 9 1 7 P2值 0 . 2 0 2  0 . 1 8 7 t3值 2 5 . 7 4 3  1 9 . 5 1 2 P3值 0 . 0 1 7  0 . 0 3 0 m R N A

    圖3 Wester n blot檢測各組細(xì)胞中Not c h1蛋白表達(dá)的變化

    3 討論

    肺纖維化是多種肺部疾病的共同結(jié)局,其主要病理特征是細(xì)胞外基質(zhì)的沉積,以及肺泡結(jié)構(gòu)的破壞,如肺泡囊腫的形成。而細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分是Ⅰ型膠原蛋白。研究表明,肌成纖維細(xì)胞是產(chǎn)生Ⅰ型膠原蛋白的主要細(xì)胞,也是肺纖維化的責(zé)任細(xì)胞[5],而對于肌成纖維細(xì)胞來說,其表型的標(biāo)志就是α-平滑肌肌動(dòng)蛋白。而T G F-β1主要的作用是能夠促進(jìn)肺內(nèi)成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化,將其轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞[6],這在本研究中亦得到證實(shí)。α-S M A免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示,T G F-β1組可見大部分細(xì)胞內(nèi)有黃色和棕黃色顆粒及條紋,α-S M A表達(dá)較對照組明顯增加,電鏡下細(xì)胞內(nèi)亦可見大量微絲束,提示T G F-β1可以促使成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞。

    Notch信號通路與肺纖維化的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[7],其通過多種途徑干預(yù)肺纖維化的病理生理過程,同時(shí)可以直接促進(jìn)Ⅰ型膠原蛋白的表達(dá)。在肺纖維化患者的肺組織中,可見明顯呈蜂巢樣改變的肺泡囊腫,同時(shí)可以檢測到Notch信號的過度表達(dá)。肺損傷后的結(jié)局是自我修復(fù),還是發(fā)展為肺纖維化,可能部分取決于譜系陰性上皮干/祖細(xì)胞中的Notch信號通路[8]。P A U L等[9]證實(shí)活性氧簇(reacti v e o x y g en species,R O S)通過轉(zhuǎn)錄因子Nr f2依賴的方式激活Notch信號通路,從而促進(jìn)氣道基底干細(xì)胞的自我更新,啟動(dòng)清除細(xì)胞內(nèi)活性氧的抗氧化程序。而這種氧化還原機(jī)制對肺內(nèi)干細(xì)胞的生物學(xué)功能具有重要意義,比如肺損傷、肺纖維化、肺癌等。HU等[10]利用基因敲除及報(bào)告基因等方法證實(shí)在小鼠L929細(xì)胞及人胚肺成纖維細(xì)胞(H u man l u n g f ibroblasts,M R C-5)中,Notch信號通過H es1依賴方式調(diào)控成纖維細(xì)胞表達(dá)C ol1α1及C ol1α2,從而上調(diào)Ⅰ型膠原蛋白的表達(dá),促進(jìn)肺纖維化。

    Notch信號通路可以促進(jìn)肌成纖維細(xì)胞的表達(dá)。A OY A GI-I K ED A等[11]用免疫組織化學(xué)法證實(shí),不管是在博來霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化模型中,還是在特發(fā)性肺纖維化的患者肺組織樣本中,Notch信號在肌成纖維細(xì)胞中的表達(dá)都明顯增強(qiáng)。研究還表明,Notch通過T G F-β-S mad3的途徑激活在肺泡上皮細(xì)胞中輻射敏感啟動(dòng)子(radiation sensiti v e promoter,C ar G)依賴性和 T淋巴細(xì)胞抗原表位(Tlymphocyteepitope,T C E)依賴性的平滑肌肌動(dòng)蛋白基因轉(zhuǎn)錄,以此來誘導(dǎo)肌成纖維細(xì)胞的分化[11]。本研究結(jié)果提示,在T G F-β1誘導(dǎo)生成的肌成纖維細(xì)胞中,Notch1表達(dá)較對照組明顯增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,說明Notch1與肌成纖維細(xì)胞的生成相關(guān)。同時(shí)當(dāng)D A P T抑制Notch1后,肌成纖維細(xì)胞表型標(biāo)志α-S M A表達(dá)明顯降低,提示抑制Notch1可以抑制肌成纖維細(xì)胞的生成。進(jìn)而筆者推測,T G F-β1可能通過活化Notch信號促進(jìn)成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化,阻斷Notch信號可以抑制這種轉(zhuǎn)化,即抑制肺纖維化的形成。

    綜上所述,T G F-β1可以促進(jìn)成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化,在肌成纖維細(xì)胞中,Notch1表達(dá)升高,D A P T阻斷Notch后,可以抑制肌成纖維細(xì)胞的生成,其表型標(biāo)志物α-S M A明顯降低。由此可見,Notch信號通路在肌成纖維細(xì)胞生成以及肺纖維化中發(fā)揮著重要作用,阻斷Notch信號可能成為治療肺纖維化的新靶點(diǎn)。

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    (童穎丹 編輯)

    Function and expressive change of Notch1 during transformation of m yofibroblasts*

    Xiu-wen Yu1,Lin-xiang Zeng2
    (1.Department of Respiratory Diseases,the First People's Hospital of Xiaoshan,Hangzhou,Zhejiang 311200,China;2.Department of Respiratory Diseases,the Second Affiliated Hospital,Nanchang University,Nanchang,Jiangxi 330006,China)

    Objective To study the law of changes of Notch1 expression in the transformative procession from fibroblasts to myofibroblasts and the effect of DAPT inhibition of Notch signal on cell transformation. M ethods The lung tissue was taken from new-born 2 or 3 day Sprague-Dawley rats.Fibroblasts were separated with pancreatin digestion method.The third-generation cultivated cells were divided into three groups: comparison group,TGF-β1group and TGF-β1+DAPT group.The comparison group was labeled as the control group,the TGF-β1group was added with 5 ng/m l TGF-β1,and the TGF-β1+DAPT group was added with 5 ng/m l TGF-β1and 5μmol/L DAPT.Immunocytochemistry was used to assess change ofα-smooth muscle actin(α-SMA)expression.RT-PCR was used to assess change of Notch1 mRNA expression.Western blot was used to assess change of Notch1 protein expression.Statistical software SPSS 18.0 was used for the dataanalysis with t-test.Resultsα-SMA immunocytochemistry demonstrated the majority of cells in the control group were not stained,the majority of cells in the TGF-β1group had yellow and brown-yellow granules and stripes,and there was no obvious difference between the DAPT group and the control group.The Notch1 mRNA expressive value of the control group,the TGF-β1group and the TGF-β1+DAPT group was(0.278± 0.022),(0.783±0.018)and(0.313±0.029)respectively;the Notch1 protein expressive value of the control group,the TGF-β1group and the TGF-β1+DAPT group was(0.312±0.019),(0.701±0.026)and(0.345± 0.022)respectively;there were significant differences in the mRNA and protein levels of Notch1 between the TGF-β1group and both the control and the TGF-β1+DAPT groups(P<0.05),while the control group and the TGF-β1+DAPT group had no statistical differences(P>0.05).Conclusions Notch1 can promote transformation of fibroblasts into myofibroblasts,and then promote pulmonary fibrosis.

    Notch1;α-smooth muscle actin;myofibroblast;lung fibrosis

    R 363

    A

    10.3969/j.issn.1005-8982.2016.15.011

    1005-8982(2016)15-0060-05

    2015-09-16

    江西省自然科學(xué)基金(No:20132B A B205014)

    曾林祥,E-mail:z en g lin x ian g@soh u.com;Tel:13037209570

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