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    川芎嗪對血管緊張素Ⅱ誘導的大鼠肝星狀細胞轉(zhuǎn)化生長因子-β1/S m a d s通路的影響

    2016-09-01 02:13:03魏國微李克躍
    中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志 2016年15期
    關(guān)鍵詞:星狀川芎嗪纖維化

    魏國微,李克躍

    (貴州省人民醫(yī)院 1.干部綜合病房,2.肝膽外科,貴州 貴陽 550002)

    論著

    川芎嗪對血管緊張素Ⅱ誘導的大鼠肝星狀細胞轉(zhuǎn)化生長因子-β1/S m a d s通路的影響

    魏國微1,李克躍2

    (貴州省人民醫(yī)院 1.干部綜合病房,2.肝膽外科,貴州 貴陽 550002)

    目的通過研究川芎嗪對體外培養(yǎng)的血管緊張素Ⅱ誘導的肝星狀細胞(H S C)轉(zhuǎn)化生長因子-β1(T G F-β1)/S m a d s通路的作用,探討其治療肝纖維化的機制。方法對大鼠H S C使用血管緊張素Ⅱ(1×10-5m ol/L)及血管緊張素Ⅱ(1×10-5m ol/L)聯(lián)合不同濃度的川芎嗪(0.04、0.20和1.00m g/m l)干預(yù)48 h,活細胞計數(shù)法(CC K-8)檢測各組細胞增殖水平的變化,實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)及W e s t e r n blot檢測各組細胞T G F-β1、S m a d2、S m a d4的mR NA及蛋白表達。結(jié)果血管緊張素Ⅱ明顯促進H S C的增殖,同時上調(diào)該細胞T G F-β1、S m a d2、S m a d4的mR NA及蛋白表達(P<0.01),而血管緊張素Ⅱ?qū) S C的誘導作用可被川芎嗪抑制(P<0.01),并呈現(xiàn)濃度依耐性。結(jié)論川芎嗪抗肝纖維化的機制之一可能是通過調(diào)控肝星狀細胞T G F-β1/ S m a d s通路實現(xiàn)的。

    肝星狀細胞;轉(zhuǎn)化生長因子-β1/S m a d s;川芎嗪;血管緊張素Ⅱ

    肝纖維化是指肝臟內(nèi)彌漫性細胞外基質(zhì)(特別是膠原物質(zhì))過度沉積,是機體對各種病因引起的慢性肝損傷后的一種損傷修復反應(yīng)[1],是肝硬化的早期可逆階段,如不及時治療則可能進展成為失代償期肝硬化并出現(xiàn)各種終末期肝病等并發(fā)癥[2]。我國是肝硬化的高發(fā)地區(qū),因此,肝纖維化的深入研究對緩解肝纖維化病情具有重要的臨床意義。研究發(fā)現(xiàn)肝星狀細胞(hepatic stellate cell,H S C)在肝纖維化發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用[3-5]。血管緊張素Ⅱ通過促進H S C發(fā)生,影響轉(zhuǎn)化生長因子β1(trans f ormin g g ro w th f actor-β1,T G F-β1),參與肝纖維化形成[6-8]。T G F-β1/S mads通路在H S C激活、增殖及肝纖維化過程中發(fā)揮重要作用[5,9]。報道顯示,活血化瘀中藥川芎嗪具有一定的抗組織纖維化作用[10-15],但其未徹底闡明抗肝纖維化的機制,對血管緊張素Ⅱ干預(yù)后H S C的T G F-β1/S mads通路作用也不清楚。為探索川芎嗪對血管緊張素Ⅱ干預(yù)后H S C的T G F-β1/S mads通路的作用,筆者使用血管緊張素Ⅱ及血管緊張素Ⅱ聯(lián)合不同濃度的川芎嗪對大鼠H S C細胞進行干預(yù),并檢測細胞增殖水平及細胞T G F-β1、S mad2、S mad4 的m R N A及蛋白表達。

    1 材料與方法

    1.1實驗動物與主要試劑、儀器

    大鼠肝星狀細胞H S C-T6購自中國科學院細胞庫,達爾伯克必需基本培養(yǎng)基(d u lbecco's minim u m essential medi u m,D M E M)(高糖型,美國H yclone公司),0.25%胰酶(美國H yclone公司),胎牛血清(美國H yclone公司),S YB RR P remi x E x Ta qTM實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(q R T-PC R)試劑盒(日本Ta K a R a公司),T G F-β1、S mad2、S mad4及β肌動蛋白引物(美國I ntro g en公司),T G F-β1正向引物:T GG CG TT A CC TT GG T AA CC,反向引物:GG T G TT G A GCC C TTT CC A G;S mad2正向引物:CC A GG T C T C TT G A T G G T CG T,反向引物:GGCGGC A G TT C T G TT A G AA T;S mad4正向引物:C TTTT GC TT GGG T C AA C T C T C,反向引物:T GGGC T C A CGC A T A T A TTT CC;β肌動蛋白正向引物:A GGCC A T G T A CG T A GCC A T CC A,反向引物序列:T C T CCGG A G T CC A T C A C AA T G??筎 G F-β1抗體及抗S mad4抗體(英國A bcam公司),抗β肌動蛋白抗體(北京全式金生物技術(shù)有限公司),活細胞計數(shù)法(cell co u ntin g k it-8,CC K-8)試劑盒(上海生工生物技術(shù)有限公司),血管緊張素Ⅱ(美國S i g ma公司),注射用鹽酸川芎嗪(北京四環(huán)科寶有限公司)。

    1.2細胞的培養(yǎng)

    大鼠肝星狀細胞H S C-T6,調(diào)整細胞密度為4× 104~5×104個/ml,置于37℃、5%二氧化碳C O2培養(yǎng)箱內(nèi)用含10%胎牛血清的D M E M培養(yǎng)。每3天換培養(yǎng)液1次。5~7 d細胞布滿瓶底后使用0.25%胰蛋白酶消化傳代,取4~6代H S C進行實驗。

    1.3細胞的分組及其處理

    將培養(yǎng)好的4~6代細胞用于實驗??偣卜譃?個組,即對照組、血管緊張素Ⅱ1×10-5mol/L組(血管緊張素Ⅱ組)、血管緊張素Ⅱ(1×10-5mol/L)+川芎嗪0.04m g/ml組(血管緊張素Ⅱ+川芎嗪0.04組),血管緊張素Ⅱ(1×10-5mol/L)+川芎嗪0.20m g/ ml組(血管緊張素Ⅱ+川芎嗪0.20組),血管緊張素Ⅱ(1×10-5mol/L)+川芎嗪1.00m g/ml組(血管緊張素Ⅱ+川芎嗪1.00組)。待細胞長到50%左右后,各組細胞置入無血清的D M E M培養(yǎng)饑餓過夜,次日各組細胞加入上述含不同濃度的川芎嗪培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h。

    1.4觀察指標及測定方法

    1.4.1CC K-8法測定細胞增殖水平將成纖維細胞接種于96孔板,細胞濃度為2×104個/孔,每孔體積為100μl,每孔做5個復孔。各組細胞在37℃、5%C O2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h,加入不含或含有不同濃度的川芎嗪分別培養(yǎng)48 h,每孔加入10μl CC K-8試劑培養(yǎng)2.5 h,按細胞計數(shù)說明書在酶標儀上450 nm波長處測定其光密度值,采用目前普遍使用的扣除本底策略來消除誤差。

    1.4.2q R T-P C R檢測T G F-β1、S m a d2及S m a d4 mR NA的表達各組細胞提取R N A,將純度好、完整性高的R N A合成cDN A。按2×S YB RR P remi x 10μl,正向引物0.4μl,反向引物0.4μl,cDN A 2μl,dd H2O 7.2μl配成總量20μl體系進行q R T-PC R。反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性30 s,95℃變性5 s,60℃退火30 s,共計40個循環(huán)。目的基因的表達使用相對定量法,以β肌動蛋白作為內(nèi)參計算△C t,以2-△△ct計算目的基因的相對表達量。

    1.4.3W e s t e r n blot法檢測T G F-β1及S m a d4的蛋白表達提取各組細胞總蛋白,采用二喹啉甲酸法定量蛋白濃度,所得蛋白于聚丙烯酰胺凝膠中電泳,電轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜后以足量的封閉液封閉,用一抗稀釋液按1∶5 000比例稀釋檢測蛋白的一抗,4℃冰箱內(nèi)孵育過夜。去掉一抗孵育液后以足量三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽溶液(tris b uff ered saline and t w een 20,T B S T)搖床洗滌3次,每次10min,用二抗稀釋液按1∶5 000比例稀釋辣根過氧化物標記的二抗后室溫振蕩孵育2 h,倒掉二抗孵育液后以足量T B S T洗滌3次,每次10 min,以電化學發(fā)光,顯影和定影方法對膠片進行拍照和掃描,以β肌動蛋白為內(nèi)參照,Q u antity one系統(tǒng)分析目標條帶的相對灰度值。

    1.5統(tǒng)計學方法

    采用S P SS 16.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析,計量資料用均數(shù)±標準差(x±s)表示,多組的比較用單因素方差分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

    2 結(jié)果

    2.1血管緊張素Ⅱ?qū) SC-T6增殖水平的影響

    血管緊張素Ⅱ干預(yù)后的H S C增殖水平較正常值上升(t=-18.703,P=0.000),使用不同濃度的川芎嗪干預(yù)后,血管緊張素Ⅱ?qū) S C增殖的刺激作用受到抑制(川芎嗪濃度為0.04m g/ml時,t=5.630,P=0.000;川芎嗪濃度為0.20m g/ml時,t=8.628,P=0.000;川芎嗪濃度為1.00m g/ml時,t=17.508,P=0.000),且呈現(xiàn)濃度依耐性。見圖1及表1。

    2.2血管緊張素Ⅱ及 TMP對 H SC-T6細胞T GF-β1、S m a d2、S m a d4 m RN A表達的影響

    使用血管緊張素Ⅱ(1×10-5mol/L)干預(yù)后,H S CT6的T G F-β1、S mad2、S mad4 m R N A表達均上調(diào)(T G F-β1:t=-58.751,P=0.000;S mad2:t=-36.644,P=0.000;S mad4:t=-80.719,P=0.000),但血管緊張素Ⅱ?qū) S C的調(diào)控作用被川芎嗪不同程度地抑制:①川芎嗪濃度為0.04m g/ml時,T G F-β1:t=1.905,P=0.105;S mad2:t=1.180,P=0.283;S mad4:t=2.417,P=0.052。②川芎嗪濃度為0.20m g/ml時,T G F-β1:t= 10.870,P=0.000;S mad2:t=9.092,P=0.000;S mad4:t=22.739,P=0.000。③T MP濃度為1.0m g/ml時,T G F-β1:t=15.187,P=0.000;S mad2:t=14.011,P= 0.000;S mad4:t=27.299,P=0.000。表現(xiàn)為濃度依耐性。見圖2及表2。

    2.3血管緊張素Ⅱ及TMP對T GF-β1、S m a d4蛋白表達的影響

    圖1 各組細胞增殖水平 (n=5,x±s)

    表1 各組細胞增殖水平方差分析

    圖2 各組細胞各基因m RN A相對表達量 (n=3,x±s)

    表2 各組細胞各基因m RN A相對表達量方差分析

    使用血管緊張素Ⅱ(1×10-5mol/L)干預(yù)后,H S C-T6的 T G F-β1及 S mad4蛋白表達均上調(diào)(T G F-β1:t=-49.025,P=0.000;S mad4:t=-32.745, P=0.000),但血管緊張素Ⅱ?qū) S C的調(diào)控作用被川芎嗪不同程度地抑制:①川芎嗪濃度為0.04m g/ml時,T G F-β1:t=2.380,P=0.055;S mad4:t=2.130,P= 0.077。②川芎嗪濃度為0.20m g/ml時,T G F-β1:t= 12.983,P=0.000;S mad4:t=11.202,P=0.000。③川芎嗪濃度為1.00m g/ml時,T G F-β1:t=17.259,P=0.000;S mad4:t=16.362,P=0.000。表現(xiàn)為濃度依耐性,與各基因m R N A的變化趨勢一致。見圖3、4和表3。

    圖3 各組細胞各蛋白相對表達量 (n=3,x±s)

    表3 各組細胞各蛋白相對表達量的方差分析

    3 討論

    肝纖維化是各種慢性肝病共有的病理改變,其特點是以膠原為主的細胞外基質(zhì)在肝內(nèi)過度沉積。肝星形細胞又稱I to細胞、維生素A儲存細胞、竇周細胞等,其約占肝內(nèi)細胞總數(shù)的5%~8%,正常情況下具有貯存脂肪和維生素A、維持肝竇細胞外基質(zhì)平衡、肝竇膠原及微生態(tài)平衡等功能[16]。當肝臟受到物理、化學及生物因素刺激時,通常靜止的H S C被“激活”或“活化”。而活化的H S C是肝纖維化時細胞外基質(zhì)的主要來源細胞,與細胞外基質(zhì)相互作用,在肝纖維化中起關(guān)鍵作用[5,9,17]。

    T G F-β1作為一種細胞因子,在活化的H S C中的表達明顯增強,T G F-β1反過來又能激活H S C,使其增殖旺盛。如果作用過度或持續(xù)表達,將會導致肝纖維化形成,是目前已知的與肝纖維化形成最密切的細胞因子[2,5,9]。一般情況下,T G F-β1是通過與其相應(yīng)受體TβRⅠ、TβRⅡ、內(nèi)皮蛋白結(jié)合形成復合物后調(diào)控S mad2/S mad3、S mad4、S mad6/S mad7等蛋白形成T G F-β1/S mads信號傳導通路發(fā)揮作用[18]。在肝纖維化過程中,H S C中的 T G F-β1、S mad2、S mad4等的表達均明顯增強[19-20],干預(yù)H S C中T G F-β1/S mads信號傳導通路中的T G F-β1、S mad2、S mad4等的表達已經(jīng)成為治療肝纖維化的主要策略之一[19-23]。

    研究發(fā)現(xiàn),在肝纖維化的H S C中,血管緊張素Ⅱ的表達明顯增強[24]。血管緊張素Ⅱ通過促進H S C發(fā)生,影響T G F-β,參與肝纖維化形成,在肝纖維化過程中發(fā)揮主要作用[9]。也有報道顯示,血管緊張素Ⅱ?qū) S C的調(diào)控作用與J A K2及R ho-R oc k通路有關(guān)[25-26]。血管緊張素Ⅱ引起的的肝纖維化可能與誘導N A D P H氧化酶依賴的氧化應(yīng)激作用有關(guān),而血管緊張素(1-7)能夠抑制血管緊張素Ⅱ引起的肝纖維化[27]。在機體肝纖維化過程中血管緊張素Ⅱ主要是通過腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)發(fā)揮作用[24]。干預(yù)H S C中腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)的表達已經(jīng)成為治療肝纖維化的策略之一[28]。筆者的體外實驗研究提示血管緊張素Ⅱ能夠上調(diào)H S C 中T G F-β1、S mad2及S mad4的m R N A及蛋白表達(P<0.01),從而促進H S C的增殖(P<0.01)。

    中藥川芎嗪具有抗組織纖維化、抗氧自由基、改變血液流變學、免疫抗腫瘤等功效,尤其是它的抗組織纖維化作用越來越引起人們的重視[10-14]。報道顯示,川芎嗪抑制H S C的激活與其干擾血小板源生長因子β受體調(diào)控E R K及P38通路有關(guān)[29]。也有報道顯示,川芎嗪抑制H S C的激活與其抑制胰島素受體調(diào)控PI3K/A K T及E R K通路有關(guān)[30]。還有報道顯示,川芎嗪抑制H S C的激活與其對H ed g eho g信號轉(zhuǎn)導通路的調(diào)控有關(guān)[31]。體內(nèi)研究提示,川芎嗪的抗肝纖維化作用與其對H S C細胞內(nèi)P D G F-beta R/N LR P3/C aspase1通路進行調(diào)控從而抑制炎癥細胞因子的表達有關(guān)[32]。筆者的體外實驗研究提示,鹽酸川芎嗪能夠明顯抑制由血管緊張素Ⅱ誘導的H S C中T G F-β1、S mad4、S mad2的m R N A及蛋白上調(diào)(P<0.01,川芎嗪0.20~1.00m g/ml),從而抑制H S C的增殖(P<0.01,T MP0.04~1.00 m g/ml),且存在濃度依耐性。

    綜上所述,血管緊張素Ⅱ上調(diào)H S C中T G F-β1、S mad2、S mad4的m R N A及蛋白表達,從而促進H S C的增殖;而川芎嗪對血管緊張素Ⅱ誘導的H S C具有抑制作用,在一定范圍內(nèi)表現(xiàn)為濃度依賴性(0.2~1.0m g/ml),提示川芎嗪的抗肝纖維化作用可能是通過其對H S C中T G F-β1/S mads通路的調(diào)控產(chǎn)生的。

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    (申海菊 編輯)

    Effects of Tetramethylpyrazine and angiotensinⅡ on TGF-β1/ Smads signaling pathway in rat hepatic stellate cells

    Guo-wei Wei1,Ke-yue Li2
    (1.General Ward for Cadre,2.Department of Hepatobiliary Surgery,the People's Hospital of Guizhou Province,Guiyang,Guizhou 550002,China)

    Objective To investigate the effects of Tetramethylpyrazine and angiotensinⅡ on transforming growth factor-β1(TGF-β1)/Smads signaling pathway in rat hepatic stellate cells(HSCs).M ethods HSCs were cultured,and then treated by angiotensinⅡ(1×10-5mol/L)or angiotensinⅡ(1×10-5mol/L)combined with different concentrations of Tetramethylpyrazine(0.04,0.20 and 2.00mg/ml).The treated cells and control groups were incubated for 48 hours.Cell proliferation was assayed by CCK-8.Relative mRNA expressions of TGF-β1,Smad2 and Smad4 were assayed by quantitative real-time polymerase chain reaction.Relative protein expressions of TGF-β1,Smad2 and Smad4 were investigated by Western blot.Results AngiotensinⅡ significantly promoted HSC proliferation,significantly up-regulated both the mRNA and protein expressions of TGF-β1,Smad2 and Smad4 in HSCs(P<0.01).The effects of angiotensinⅡ in HSCs were significantly inhibited by Tetramethylpyrazine in a dose-dependent manner(P<0.01).Conclusions This study suggested that the antiliver fibrosis effects of Tetramethylpyrazine maybe connect with modulation of TGF-β1/Smads signaling pathway.

    hepatic stellate cell;TGF-β1/Smads;Tetramethylpyrazine;angiotensinⅡ

    R 285.5

    A

    10.3969/j.issn.1005-8982.2016.15.009

    1005-8982(2016)15-0050-06

    2016-01-25

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