T h1/T h2/T h17細胞在實驗性過敏性結膜炎中的作用研究*

張劍，王冬蘭，閆冬梅

（1.佳木斯大學附屬第一醫(yī)院 眼科，黑龍江 佳木斯 154003；2.佳木斯大學基礎醫(yī)學院，黑龍江 佳木斯 154003）

論著

T h1/T h2/T h17細胞在實驗性過敏性結膜炎中的作用研究*

張劍1，王冬蘭1，閆冬梅2

（1.佳木斯大學附屬第一醫(yī)院 眼科，黑龍江 佳木斯 154003；2.佳木斯大學基礎醫(yī)學院，黑龍江 佳木斯 154003）

目的探討T h1/T h2/T h17細胞在實驗性過敏性結膜炎發(fā)病中的可能作用。方法40只B ro w n N or way大鼠隨機分為3組：空白組、對照組和實驗組。應用雞卵清蛋白（O V A）復制大鼠過敏性結膜炎模型。取3組大鼠眼球及上下眼瞼進行病理學分析，計數(shù)穹隆部結膜嗜酸性粒細胞浸潤數(shù)。EL ISA法測定大鼠血清Ig E、Ig G1、Ig G2a和脾細胞培養(yǎng)上清液I L-17、I L-4、I L-6、I L-10、I F N-γ含量。流式細胞儀測定大鼠外周血和脾臟T h17細胞。結果實驗組大鼠穹隆部眼結膜嗜酸性粒細胞浸潤數(shù)較空白組和對照組升高（P＜0.01）。實驗組大鼠血清Ig E、Ig G1較空白組和對照組升高（P＜0.01），血清Ig G2a較空白組和對照組降低（P＜0.01）。實驗組大鼠血清脾細胞培養(yǎng)上清液I L-17、I L-4、I L-6、I L-10水平較空白組和對照組升高（P＜0.01），I F N-γ水平較空白組和對照組降低（P＜0.01）。實驗組大鼠外周血和脾臟T h17細胞均高于空白組和對照組（P＜0.01）。結論T h1/T h2/T h17細胞平衡失衡是大鼠實驗性過敏性結膜炎發(fā)病的主要原因?；謴蚑 h1/T h2/T h17失衡可能成為過敏性結膜炎治療的一條新途徑。

過敏性結膜炎；輔助性T細胞1/輔助性T細胞2/輔助性T細胞17；細胞因子

過敏性結膜炎是一種多見于兒童和青少年，易反復發(fā)作，常呈季節(jié)性加重的變態(tài)反應性眼表疾病，患病達人群的20%［1］。近年來隨著環(huán)境污染加重，變應原增加，發(fā)病率逐年增高。過敏性結膜炎確切的發(fā)病機制至今尚不十分清楚。以往的研究認為過敏性結膜炎是免疫球蛋白E（imm u no g lob u lin E，I g E）介導的體液免疫和細胞免疫機制［2］，但是I g E介導的過敏性結膜炎變態(tài)反應的病理生理過程并不完全清楚。本研究擬通過雞卵清蛋白（Ov alb u min，OV A）致敏、誘導大鼠實驗性過敏性結膜炎模型。檢測過敏性結膜炎大鼠1型輔助性T細胞（type 1 helper T cell，Th1）/2型輔助性T細胞（type 2 helper T cell，Th2）/17型輔助性T細胞（type 17 helper T cell，Th17）相關細胞因子白細胞介素17（I nterle uk in-17，I L-17）、白細胞介素4（I nterle uk in-4，I L-4）、白細胞介素6（I nterle uk in-6，I L-6）、白細胞介素10（I nter le uk in-10，I L-10）、γ-干擾素（I nter f eron-γ，I F N-γ）及相應抗體I g E、免疫球蛋白G1（imm u no g lob u lin G1，I g G1）、免疫球蛋白G2a（imm u no g lob u lin G2a，I g G2a）水平，揭示過敏性結膜炎的免疫學機制及發(fā)病的病理生理過程，為探討新的治療靶點和方法提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物B ro w n Nor w ay大鼠40只（S P F級），6～8周齡，體重150～200 g，由佳木斯大學實驗動物中心提供。

1.1.2主要試劑及儀器OV A（美國S i g ma公司），G iemsa染色試劑（北京索萊寶科技有限公司），莫能菌素、P E標記的抗大鼠I L-17A、異硫氰酸熒光素（f l u orescein isothiocyanate，F(xiàn) I T C）標記的抗大鼠C D4+抗體（美國e B iloscience公司），R PMI 1640培養(yǎng)基（美國G ibo公司），大鼠變應原特異性I g E、I g G1、I g G2a、I L-17、I L-4、I L-6、I L-10、I F N-γE L I S A試劑盒（美國R D公司），B A C S C alib u r流式細胞儀（美國B D公司），全自動酶標儀（型號：R T-6000，美國R ayto公司）。

1.2方法

1.2.1實驗動物分組B ro w n Nor w ay大鼠40只，隨機分為空白組10只，對照組10只，實驗組20只。實驗組于實驗第1天給予OV A 100μg和佐劑A l 35m g磷酸鹽緩沖液（phosphate b uff er saline，P B S）200μl左足底部注射。第7天給同樣OV A P B S液200μl腹腔注射。第14天和第16天OV A P B S液（750μg/5μl/眼）點眼激發(fā)。對照組給予等量的P B S液，給藥時間和途徑同實驗組?？瞻捉M為正常大鼠不加任何處理。

1.2.2眼部病理學檢查末次激發(fā)24 h斷髓法處死大鼠，摘取眼球及上下眼瞼，10%福爾馬林溶液固定，石蠟包埋，矢狀位4μm厚連續(xù)切片，G iemsa染色觀察大鼠眼結膜病理變化。計數(shù)穹隆部結膜每高倍鏡下嗜酸性粒細胞浸潤數(shù)量。

1.2.3血清特異性Ig E、Ig G1、Ig G2a抗體測定采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗（en z ymelin k ed imm u nosorbent assay，E L I S A）法，在大鼠I g E、I g G1、I g G2a單抗包被的酶標板上分別加入標準品和樣品，37℃，90min，洗板4次。加入生物素化抗大鼠I g E、I g G1、I g G2a抗體，37℃，60min，洗板4次。加入辣根過氧化物酶標記的抗生物素蛋白鏈菌素37℃，30min。加入底物顯色。450 nm處測光密度值，根據(jù)標準曲線計算待測樣品I g E、I g G1、I g G2a濃度。

1.2.4外周血、脾臟T h17細胞的流式細胞術檢測肝素化抗凝大鼠外周血或脾細胞懸液，裂解紅細胞，分離淋巴細胞，調(diào)整細胞濃度1×107個/ml，取100μl加入佛波醇酯、離子霉素、莫能霉素，37℃，5%二氧化碳C O2培養(yǎng)5h，收集細胞用P E標記的抗大鼠I L-17A、F I T C標記的抗大鼠C D4+抗體進行細胞表面及細胞內(nèi)抗原染色。流式細胞儀進行檢測。

1.2.5脾細胞上清液細胞因子測定無菌條件下取出大鼠脾臟，經(jīng)100目鋼網(wǎng)研磨過濾成單個細胞，用R PMI 1640培養(yǎng)基（含100μg/L小牛血清、100μg/L青霉素及100μg/L鏈霉素）重懸脾細胞。用8.3 g/L N H4C l紅細胞裂解液裂解紅細胞，離心，收集細胞沉淀，R PMI 1640培養(yǎng)基重懸脾細胞，制成均質的脾細胞懸液，調(diào)整細胞濃度至2×106個/ml。臺昐藍染色觀察活細胞≥98%時可用于實驗。取脾細胞懸液100μl加到無菌96孔板中，加入OV A至質量終濃度100μg/L，并設立陰性對照組，37℃，5%C O2培養(yǎng)72 h。收集上清液E L I S A法測定I L-17、I L-4、I L-6、I L-10、I F N-γ含量。實驗操作程序與測定I g E、I g G1、I g G2a相同。

1.3統(tǒng)計學方法

采用S P SS 19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組間差異性測定用方差分析，多組間兩兩比較用S N K-q檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1眼病理切片結果

空白組大鼠眼結膜無充血，固有層無或偶見粒細胞浸潤，每高倍鏡下嗜酸性粒細胞浸潤數(shù)（15.92± 5.97）個。對照組大鼠眼結膜無明顯充血水腫，固有層沒有或偶見粒細胞浸潤，每高倍鏡下嗜酸性粒細胞浸潤數(shù)（17.36±6.02）個。實驗組大鼠結膜組織疏松，充血水腫明顯，固有層內(nèi)嗜酸性粒細胞及中性粒細胞浸潤，肥大細胞增加，并有脫顆?，F(xiàn)象。實驗組每高倍鏡下嗜酸性粒細胞數(shù)（78.27±15.96）個。3組大鼠眼結膜嗜酸性粒細胞浸潤數(shù)比較，經(jīng)單因素方差分析差異有統(tǒng)計學意義（F=128.193，P=0.000）。大鼠結膜嗜酸性粒細胞浸潤數(shù)經(jīng)S N K-q兩兩比較，對照組與空白組比較差異無統(tǒng)計學意義（P=0.596），實驗組較對照組增多（P=0.000）。病理改變證明實驗組大鼠發(fā)生過敏性結膜炎。見圖1。

2.2大鼠血清I g E、I g G1、I g G2a水平的變化

大鼠血清I g E、I g G1、I g G2a水平比較，經(jīng)單因素方差分析差異有統(tǒng)計學意義（P=0.000）。大鼠血清I g E、I g G1水平經(jīng)S N K-q兩兩比較，對照組與空白組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＜0.05），實驗組較對照組升高（P=0.000），血清I g G2a水平經(jīng)S N K-q兩兩比較，對照組與空白組比較差異無統(tǒng)計學意義（P=0.405），實驗組較對照組降低（P=0.000）。見表1和圖2。

圖1　空白組、對照組與實驗組病理切片結果

表1　大鼠血清I g E、I g G1、I g G2a水平比較 （μg/m l，x±s）

圖2　大鼠血清I g E、I g G1、I g G2a水平比較

2.3大鼠外周血、脾臟組織T h17細胞檢測結果

外周血Th17細胞流式細胞儀檢測結果顯示，大鼠外周血Th17細胞含量空白組為（0.70±0.05）%，對照組為（0.71±0.09）%，實驗組為（3.98±0.13）%。3組大鼠外周血Th17細胞含量，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=456，P=0.000）。大鼠外周血Th17細胞含量經(jīng)S N K-q兩兩比較，對照組與空白組差異無統(tǒng)計學意義（P=0.760），實驗組較對照組升高（P=0.001）（見圖3A）。脾臟組織Th17細胞檢測中選擇代表性的流式細胞儀分析。結果顯示大鼠脾細胞懸液Th17細胞空白組含量為（0.81±0.07）%，對照組為（0.82±0.11）%，實驗組為（4.86±0.17）%，3組大鼠脾細胞懸液Th17細胞含量，經(jīng)單因素方差分析差異有統(tǒng)計學意義（F=439，P=0.000）。經(jīng)S N K-q兩兩比較對照組與空白組無統(tǒng)計學意義（P=0.813），實驗組較對照組升高（P=0.001）（見圖3B）。

2.4大鼠脾細胞培養(yǎng)上清液I L-17、I L-4、I L-6、I L-10、IF N-γ水平

3組大鼠脾細胞培養(yǎng)上清液I L-17、I L-4、I L-6、I L-10、I F N-γ水平經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.000）。大鼠脾細胞培養(yǎng)上清液I L-17、I L-4、I L-6、I L-10水平經(jīng)S N K-q兩兩比較，對照組與空白組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。實驗組較對照組升高（P=0.000），大鼠脾細胞培養(yǎng)上清液I F N-γ水平經(jīng)S N K-q檢驗，對照組與空白組比較差異無統(tǒng)計學意義（P=0.317）。實驗組較對照組降低（P=0.000）。見表2和圖4。

2.5大鼠脾細胞培養(yǎng)上清液I L-17/IF N-γ、I L-4/ IF N-γ、I L-6/IF N-γ、I L-10/IF N-γ比值

圖3　3組大鼠外周血、脾細胞懸液T h17細胞流式細胞儀檢測結果比較

表2　大鼠脾細胞培養(yǎng)上清液I L-17、I L-4、I L-6、I L-10、IF N-γ水平比較 （p g/ml，）

表2　大鼠脾細胞培養(yǎng)上清液I L-17、I L-4、I L-6、I L-10、IF N-γ水平比較 （p g/ml，）

注：1）與空白組比較，P＞0.05；2）與對照組比較，P＜0.01

組別I F N -γ空白組（n = 1 0）　2 . 5 6 ± 0 . 0 4 　5 . 9 8 ± 1 . 0 9 　4 . 9 6 ± 0 . 5 1 　5 . 4 9 ± 0 . 9 8 　2 2 . 8 5 ± 3 . 6 3對照組（n = 1 0）　2 . 5 9 ± 0 . 0 61）　6 . 1 2 ± 1 . 1 31）　4 . 9 1 ± 0 . 4 81）　5 . 6 6 ± 1 . 0 21）　2 3 . 4 5 ± 3 . 8 91）實驗組（n = 2 0）　1 7 . 6 8 ± 2 . 5 62）　6 7 . 0 4 ± 6 . 1 22）　5 4 . 6 2 ± 4 . 3 72）　6 2 . 9 2 ± 5 . 8 92）　7 . 9 6 ± 1 . 0 12）F值　3 3 9 . 1 2 5 　4 3 8 . 6 1 9 　4 4 5 . 0 9 9 　4 9 7 . 6 0 9 　1 5 6 . 1 2 0 P值　0 . 0 0 0 　0 . 0 0 0 　0 . 0 0 0 　0 . 0 0 0 　0 . 0 0 0 I L -1 7 I L -4 I L -6 I L -1 0

3組大鼠脾細胞培養(yǎng)上清液I L-17/I F N-γ、I L-4/I F N-γ、I L-6/I F N-γ、I L-10/I F N-γ 比值經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.000）。大鼠脾細胞培養(yǎng)上清液I L-17/I F N-γ、I L-4/I F N-γ、I L-6/ I F N-γ、I L-10/I F N-γ比值經(jīng)S N K-q兩兩比較，對照組與空白組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。實驗組較對照組升高（P=0.000）。見表3。

圖4　大鼠脾細胞培養(yǎng)上清液I L-17、I L-4、I L-6、I L-10、IF N-γ水平比較

表3　脾細胞I L-17/IF N-γ、I L-4/IF N-γ、I L-6/IF N-γ、I L-10/IF N-γ比較 （）

表3　脾細胞I L-17/IF N-γ、I L-4/IF N-γ、I L-6/IF N-γ、I L-10/IF N-γ比較 （）

注：1）與空白組比較，P＞0.05；2）與對照組比較，P＜0.01

組別I L -1 0 / I F N -γ空白組（n = 1 0 ） 0 . 2 9 ± 0 . 0 5 　0 . 7 6 ± 0 . 0 6 　0 . 5 8 ± 0 . 0 5 　0 . 6 9 ± 0 . 0 4對照組（n = 1 0 ） 0 . 2 8 ± 0 . 0 41）　0 . 7 9 ± 0 . 0 81）　0 . 5 9 ± 0 . 0 71）　0 . 7 1 ± 0 . 0 61）實驗組（n = 2 0 ） 2 . 4 5 ± 0 . 1 32）　8 . 0 1 ± 1 . 1 62）　7 . 6 4 ± 1 . 0 72）　7 . 9 6 ± 1 . 0 82）F值　6 7 7 . 7 6 8 　3 7 7 . 1 2 4 　4 2 3 . 2 5 2 　4 4 2 . 1 5 8 P值　0 . 0 0 0 　0 . 0 0 0 　0 . 0 0 0 　0 . 0 0 0 I L -1 7 / I F N -γ I L -4 / I F N -γ I L -6 / I F N -γ

3　討論

過敏性結膜炎是眼部結膜組織對過敏原發(fā)生了廣泛的抗原特異性輔助T細胞反應引起的過敏性疾病。輔助性T細胞按其分化和功能分為Th1、Th2、Th17和調(diào)節(jié)性T細胞［3］。

Th1細胞產(chǎn)生I L-2、I F N-γ、TN F-α，Th2細胞產(chǎn)生I L-4、I L-5、I L-6、I L-10等細胞因子，近年研究證實Th17產(chǎn)生I L-17。Th1、Th2細胞分別產(chǎn)生特征性細胞因子，檢測I F N-γ可以了解Th1的功能狀態(tài)，檢測I L-4、I L-6、I L-10可以了解Th2的功能狀態(tài)［4］。研究發(fā)現(xiàn)，Th1、Th2細胞產(chǎn)生的細胞因子還與特異性抗體I g E、I g G亞類的表達密切相關，Th1細胞因子刺激I g G2a抗體的產(chǎn)生，而Th2細胞因子刺激I g E、I g G1的產(chǎn)生。比較血清I g G2a和I g G1水平的改變也可以了解Th1/Th2之間功能狀態(tài)的調(diào)節(jié)變化［5］。本研究結果顯示，過敏性結膜炎大鼠脾細胞培養(yǎng)上清液I L-4、I L-6、I L-10水平較對照組大鼠升高，I F N-γ水平降低。脾細胞培養(yǎng)上清液I L-4/I F N-γ、I L-6/ I F N-γ、I L-10/I F N-γ比值過敏性結膜炎大鼠較對照組大鼠升高。過敏性結膜炎大鼠血清I g E、I g G1水平較對照組大鼠升高，血清I g G2水平較對照組降低。提示過敏性結膜炎大鼠Th2細胞功能活動增強，Th1細胞活性降低。Th2/Th1比例升高，免疫狀態(tài)由Th1向Th2“克隆漂移”，表現(xiàn)為Th2型優(yōu)勢表達。表明Th1/Th2失衡與過敏性結膜炎的發(fā)病密切相關［6］，Th2細胞過多產(chǎn)生的細胞因子I L-4、I L-6、I L-10參與過敏性結膜炎發(fā)病的病理生理過程［7］。但是Th1/ Th2失衡并不能完全解釋過敏性結膜炎發(fā)病的全部機制。近年研究發(fā)現(xiàn)，在輔助性T細胞中還存在著一類新成員，由于這類效應C D4+T細胞分泌的細胞因子以I L-17為主，因此被命名為Th17［8］。Th17參與完成許多免疫反應，Th17發(fā)揮作用的關鍵是其分泌的細胞因子I L-17［9］。

近年研究發(fā)現(xiàn)，在花粉季節(jié)過敏性鼻炎患者外周血Th17細胞數(shù)量增多，血清I L-17水平升高，患者血清I L-17水平與過敏性鼻炎患者臨床癥狀嚴重程度呈正相關［10］。支氣管哮喘患者肺泡支氣管灌洗液中I L-17表達升高［11］。變應性鼻炎、支氣管哮喘均為細胞介導的變態(tài)反應。有研究證明，在OV A誘導的小鼠支氣管哮喘模型致敏階段，中和I L-17抗體可增強過敏反應，使小鼠支氣管灌洗液中I L-5和嗜酸性粒細胞數(shù)增加。I L-17在抗原特異性細胞的活化、嗜酸性粒細胞聚集和血清I g E的生成過程中均發(fā)揮作用［12］。I L-17參與Th1/Th2失調(diào)過敏性疾病的發(fā)病過程［13］。I L-17能誘導人支氣管上皮細胞、纖維細胞、氣道平滑肌細胞和靜脈內(nèi)皮細胞釋放促炎因子TN F-α、I L-1β、C-C S F、I L-6以及趨化因子C X C L1/G roα、C X C L2和C X C L8/I L-8，增加中性粒細胞的生成。I L-17通過刺激固有免疫機制調(diào)節(jié)中性粒細胞聚集，I L-17的基本生物學功能就是促進趨化因子、促細胞炎癥因子和金屬蛋白酶的表達，刺激炎癥反應及中性粒細胞趨化［14］。本研究結果顯示，過敏性結膜炎大鼠外周血、脾臟Th17細胞增加，脾細胞培養(yǎng)產(chǎn)生I L-17增多。提示Th17細胞分泌I L-17增多參與了過敏性結膜炎發(fā)病的病理生理過程。

對人類的研究發(fā)現(xiàn)，Th17/Th1細胞能同時分泌I L-17和I F N-γ［15］。I L-12不僅刺激Th17/Th1產(chǎn)生I L-23R和R O Rγδ而促進I L-17分泌，還上調(diào)Th1細胞轉錄因子Tbet表達，促進I F N-γ分泌［16］。在病理狀態(tài)下，Th1、I F N-γ可能影響Th17、I L-17，動物實驗發(fā)現(xiàn)，缺乏I F N-γ時Th17產(chǎn)生I L-17增多，可誘發(fā)實驗性自身免疫性葡萄膜炎的發(fā)生。I F N-γ缺失型小鼠實驗性自身免疫性葡萄膜炎模型外周血I L-17明顯增多［17］。本研究結果顯示，過敏性結膜炎大鼠脾細胞培養(yǎng)上清液I F N-γ減少，外周血、脾臟Th17細胞數(shù)量增多，脾細胞培養(yǎng)上清液I L-17含量增多。提示Th17/Th1失衡是大鼠過敏性結膜炎發(fā)病的重要原因。

本研究證明，Th1/Th2/Th17失衡，Th2、Th17細胞因子產(chǎn)生增多，Th1細胞功能降低、細胞因子分泌減少是大鼠過敏性結膜炎發(fā)病的重要原因。因此，在臨床上抑制Th2、Th17細胞因子產(chǎn)生，促進Th1細胞因子分泌，增強Th1反應，抑制Th2、Th17過度反應，恢復Th1/Th2/Th17平衡，可能成為治療過敏性結膜炎的一條新途徑。

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（申海菊 編輯）

Effect of Th1/Th2/Th17 balance on development of experimental allergic conjunctivitis*

Jian Zhang1，Dong-lan Wang1，Dong-mei Yan2
（1.Department of Ophthalmology，the First Affiliated Hospital of Jiamusi University，Jiamusi，Heilongjiang 154003，China；2.College of Basic Medical Sciences，Jiamusi University，Jiamusi，Heilongjiang 154003，China）

Objective To investigate the effect of Th1/Th2/Th17 balance on development of experimental allergic conjunctivitis.Methods Forty Brown Norway rats were randomly divided into three groups:normal group，control group and experimental allergic conjunctivitis group（experimental group）.Ovalbumin（OVA）-induced allergic conjunctivitis models were established.The eyes including eyelids and conjunctivae were harvested for histological analysis，and infiltrating eosinophils in fornical conjunctivae were counted.The serum levels of IgE，IgG1 and IgG2a and the concentrations of IL-17，IL-4，IL-6，IL-10 and IFN-γin spleen culture supernatant were measured by ELISA.The Th17 cells in peripheral blood and spleen tissue were detected using flow cytometry.Results The experimental group had significantly higher number of conjunctival eosinophils than the normal and control groups（P＜0.01）.The experimental group had significantly higher serum IgE and IgG1 levels and significantly lower serum IgG2a level than the normal and control groups（P＜0.01）.The concentrations of IL-17，IL-4，IL-6 and IL-10 in spleen culture supernatant were significantlyhigher but the IFN-γlevel was significantly lower in the experimental group than in the normal and control groups（P＜0.01）.The Th17 cells in the peripheral blood and spleen tissue of the experimental group were significantly more than those of the normal and control groups（P＜0.01）.Conclusions Th1/Th2/Th17 imbalance might play an important role in the development of experimental allergic conjunctivitis.To modulate the unbalanced Th1/Th2/Th17 reaction may contribute to treatment of allergic conjunctivitis.

allergic conjunctivitis；Th1；Th2；Th17；cytokine

R 777.3

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.15.006

1005-8982（2016）15-0032-06

2015-08-14

黑龍江省衛(wèi)生廳科研項目（No：2013248）；佳木斯大學青年基金（No：S q2014-006）

閆冬梅，E-mail：chaiyin g1975@soh u.com；Tel：0454-8623586