促血管生成素重組腺病毒對糖尿病鼠腎血管新生的影響*

張子陽，譚州科，曹明燕，楊亦彬

（遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院 腎病風濕科，貴州 遵義 563003）

·論著·

促血管生成素重組腺病毒對糖尿病鼠腎血管新生的影響*

張子陽，譚州科，曹明燕，楊亦彬

（遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院 腎病風濕科，貴州 遵義 563003）

目的通過SD大鼠糖尿病腎病（DN）模型，觀察經(jīng)腺病毒外源性表達Ang-1對腎臟血管新生的作用，以期為DN的臨床治療提供參考。方法SD大鼠DN造模選用鏈脲佐菌素（STZ），設(shè)計兩個大的組別，即正常對照組和DN模型組，并將DN模型組進一步劃分為3個亞組，即糖尿病組、空白載體組、Ang-1腺病毒組。STZ造模成功后的第8周開始，從尾靜脈注入Ang-1腺病毒載體以及空白載體，在8、12、20和28周，檢測各組大鼠的尿蛋白水平，實時定量聚合酶鏈法分析腎臟Ang-2 mR NA水平。結(jié)果①DN模型組大鼠的尿蛋白水平較正常對照組升高（P＜0.01），且只有在20周前，空白載體組及糖尿病組的尿蛋白水平才低于Ang-1腺病毒組（P＜0.01）；②在正常對照組大鼠腎組織中未檢測到尿蛋白和Ang-2 mR NA表達，而其他DN模型組（糖尿病、空白載體、Ang-1腺病毒組）大鼠12周后的尿蛋白和Ang-2 mR NA表達升高，特別是Ang-1腺病毒組升高（峰值在20周）更為明顯（P＜0.05），在28周時降低，糖尿病、空白載體和Ang-1腺病毒組的Ang-2 mR NA表達比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；③Ang-2與尿蛋白排泄量呈負相關(guān)（r=-0.601，P＜0.05）。結(jié)論外源性給予Ang-1對糖尿病腎臟新生微血管生成有保護作用。

促血管生成素；糖尿病腎??；血管生成；腺病毒載體

糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）屬于糖尿病嚴重微血管并發(fā)癥，也是導致患者發(fā)生終末期腎臟病的重要原因［1］。研究表明，糖尿病腎病患者的血管調(diào)控因子普遍存在表達異常，患者的腎小球中存在新生血管［2］，糖尿病腎病的發(fā)生與微血管病變密切相關(guān)，其發(fā)病機制復雜［3］。如何減少血管內(nèi)皮損傷和促進修復已成為研究熱點［4］。促血管生成素-1（A n g iopoietin-1，A n g-1）是近年來發(fā)現(xiàn)的促血管生長細胞因子，有促血管發(fā)生以及組織修復的重要功能，同時也有抗炎、緩解血管滲漏、抗內(nèi)皮細胞凋亡等作用，越來越受到研究者的關(guān)注。另有實驗發(fā)現(xiàn)，A n g-1下調(diào)可能導致糖尿病腎病后期新生血管消失［5］，本實驗通過給予糖尿病大鼠A n g-1腺病毒載體，觀察其28周的尿蛋白、腎臟促血管生成素-2（A n g iopoietin-2，A n g-2）m R N A和蛋白表達變化，評估A n g-1對糖尿病大鼠腎臟新生血管的影響。

1　材料與方法

1.1研究動物

本研究動物為南京模式生物研究所購買的雄性S pra g u e-Da w ley大鼠，共140只。

1.2研究方法

1.2.1構(gòu)建Ang-1腺病毒載體A n g-1腺病毒載體由大連寶生物工程有限公司構(gòu)建，滴度為2.5× 1010p fu/ml。

1.2.2造模和分組采用鏈脲佐菌素（S trepto z otocin，S T Z）（55m g/k g）腹腔注射復制糖尿病模型，連續(xù)3 d血糖≥16.65mmol/L示造模成功。實驗動物隨機分為：①A n g-1腺病毒組。造模完成后8周，根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果以及參考文獻［6］決定A n g-1腺病毒的實際注射量，本研究采用4×1011p fu/ml；②空白載體組，與A n g-1腺病毒同病毒低毒的陰性對照組，注射劑量同A n g-1腺病毒；③糖尿病組，腹腔注射S T Z造模，劑量為55m g/k g；④正常對照組，不做處理。分組完成后的第8、12、20和28周，每組分別選擇6只大鼠在不同時間點進行觀察及分析，每組35只。

1.2.3樣品處理于實驗的第8、12、20和28周腹腔注射麻醉，取部分腎組織（兼顧皮、髓質(zhì)）迅速放入液氮中，以備后續(xù)實驗使用；另取部分腎組織置于4%多聚甲醛液固定，24 h后轉(zhuǎn)入95%酒精溶液中，并進行后續(xù)的梯度脫水、石蠟包埋和切片處理。

1.2.424 h尿蛋白定量檢測采用7150型全自動生化分析儀（日本日立公司）進行24 h尿蛋白定量檢測。

1.2.5腎組織Ang-2、血栓調(diào)節(jié)蛋白（T hro m bom odul in-1，T M-1）檢測采用免疫熒光鏈霉親和素-生物素復合物-異硫氰酸熒光素法檢測腎組織A n g-2、血栓調(diào)節(jié)蛋白，按說明書及參考文獻操作步驟操作。

1.2.6腎組織Ang-2 mR NA檢測R N A提取及純化按說明書及參考文獻操作步驟操作。引物采用P R IM E R 5軟件設(shè)計，并經(jīng)上海生物工程有限公司合成。β肌動蛋白（β-actin）的正向引物：5'-GG A G A TT A C T GCCC T GGC T CC T A-3'，反向引物：5'-G A C T C A T CG T A C T CC T GC TT GC T G-3'；A n g-2正向引物：5'-C T CC T G T G A GC A T C T GGG AA C-3'，反向引物：5'-GCG GGC AAAA T C A G T A GC A-3'。

1.3統(tǒng)計學方法

采用S P SS 20.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組間數(shù)據(jù)比較用單因素方差分析，不同時間點數(shù)據(jù)比較用重復測量方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

2.124 h尿蛋白

①正常對照組大鼠各時間點24 h尿蛋白比較差異無統(tǒng)計學意義（與8周比較：t12周=0.256，P12周= 0.800；t20周=0.198，P20周=0.844；t28周=1.686，P28周= 0.100）。②各組大鼠不同時間點的24 h尿蛋白經(jīng)重復測量方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=5.731，P=0.005）。與正常對照組比較，A n g-1腺病毒組、空白載體組和糖尿病組不同時間點的尿蛋白均高于正常對照組（t8周=15.122、15.298和45.559，P8周=0.000、0.000 和0.000；t12周=17.928、19.904和16.962，P12周=0.000、0.000和0.000；t20周=32.680、19.904和28.918，P20周= 0.000、0.000和0.000；t28周=21.090、20.685和28.222，P28周=0.000、0.000和0.000）。A n g-1腺病毒組尿蛋白在第12周后逐漸減少，在第20周以后低于空白載體組（t20周=5.002，P20周=0.000）和糖尿病組（t20周=2.682，P20周=0.010），差異有統(tǒng)計學意義。見表1和圖1。

2.2腎臟Ang-2 m RN A及Ang-2水平（灰度值）

2.2.1Ang-2 mR NA表達①各組大鼠腎組織A n g-2 m R N A經(jīng)重復方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=3.981，P=0.020）。②A n g-2 m R N A在正常對照組中不表達；其余3組A n g-2 m R N A表達在12周開始上調(diào)，峰值均在20周。A n g-1腺病毒組A n g-2 m R N A表達普遍上調(diào)，其中在12、20和28周時A n g-2 m R N A表達高于空白載體組（t12周=22.718，P12周=0.000；t20周= 14.406，P20周=0.000；t28周=7.659，P28周=0.000）和糖尿病組（t12周=23.197，P12周=0.000；t20周=13.201，P20周= 0.000；t28周=24.882，P28周=0.000）；另外，在不同時間點，空白載體組的A n g-2 m R N A表達與糖尿病組比較，差異無統(tǒng)計學意義（t12周=0.642，P12周=0.262；t20周= 1.645，P20周=0.052；t28周=0.254，P28周=0.400）。見表2和圖2。

表1　各組大鼠不同時間點24 h尿蛋白比較

表1　各組大鼠不同時間點24 h尿蛋白比較

組別2 8周正常對照組　1 2 . 1 2 ± 1 . 3 8 　1 2 . 2 3 ± 2 . 1 4 1 2 . 2 3 ± 2 . 9 8 1 2 . 8 7 ± 2 . 2 4 A n g -1腺病毒組5 2 . 3 3 ± 1 5 . 6 7 6 6 . 8 3 ± 1 7 . 8 9 5 7 . 1 7 ± 7 . 5 7 　4 0 . 5 0 ± 7 . 4 2空白載體組　5 2 . 2 3 ± 1 5 . 4 5 7 0 . 3 1 ± 1 7 . 1 3 6 8 . 5 5 ± 1 1 . 1 3 7 1 . 5 4 ± 1 6 . 6 3糖尿病組　3 9 . 2 4 ± 3 . 2 4 5 7 . 1 5 ± 1 5 . 5 2 6 6 . 0 1 ± 1 4 . 2 1 7 5 . 8 0 ± 1 3 . 0 0 8 周1 2 周2 0 周

圖1　各組大鼠不同時間點24 h尿蛋白變化趨勢

表2　各組大鼠不同時間點腎組織Ang-2 m RN A表達比較

表2　各組大鼠不同時間點腎組織Ang-2 m RN A表達比較

組別2 0 周2 8周正常對照組　-　-　-A n g -1腺病毒組　2 . 3 4 ± 0 . 4 8 　4 . 7 9 ± 1 . 5 1 　1 . 1 9 ± 0 . 2 0空白載體組　0 . 4 2 ± 0 . 1 4 　1 . 2 1 ± 0 . 3 5 　0 . 2 6 ± 0 . 6 9糖尿病組　0 . 4 0 ± 0 . 1 2 　1 . 3 4 ± 0 . 3 1 　0 . 2 3 ± 0 . 1 1 1 2 周

圖2　各組大鼠不同時間點腎組織Ang-2 m RN A表達變化趨勢

表3　各組大鼠不同時間點Ang-2水平（灰度值）比較

表3　各組大鼠不同時間點Ang-2水平（灰度值）比較

組別2 8周正常對照組　-　-　-A n g -1腺病毒組　5 1 . 2 5 ± 1 . 2 3 　9 5 . 2 1 ± 2 . 2 4 　4 2 . 1 1 ± 0 . 7 2空白載體組　3 9 . 8 0 ± 0 . 7 2 　7 9 . 3 3 ± 1 . 0 3 　3 5 . 0 9 ± 0 . 7 3糖尿病組　4 0 . 1 2 ± 1 . 4 1 　6 9 . 7 9 ± 1 . 6 2 　3 6 . 3 6 ± 0 . 9 0 1 2 周2 0 周

圖3　各組大鼠不同時間點Ang-2水平（灰度值）變化趨勢

2.2.2Ang-2水平（灰度值）①各組大鼠腎組織A n g-2水平灰度值，經(jīng)重復方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=4.751，P=0.001）。②正常對照組未發(fā)現(xiàn)A n g-2熒光表達，其余3組在第12周后腎小管周圍出現(xiàn)熒光，A n g-1腺病毒組熒光強于空白載體組（F12周=1.685，t12周=48.222，P12周=0.000；F20周=1.440，t20周= 38.662，P20周=0.000；F28周=1.440，t28周=41.096，P28周= 0.000）和糖尿病組（F12周=1.632，t12周=35.705，P12周= 0.000；F20周=1.861，t20周=55.195，P20周=0.000；F28周= 1.341，t28周=29.515，P28周=0.000）。見表3和圖3、4。

2.3指標的相關(guān)性分析

尿蛋白和A n g-2的測定結(jié)果表明，A n g-2熒光灰度值與尿蛋白呈負相關(guān)（t=28.507，r=-0.601，P= 0.000）。見圖5。

圖4　3組大鼠腎組織Ang-2表達熒光圖 （20周，×200）

圖5　Ang-2熒光灰度值與尿蛋白散點圖

3　討論

慢性腎臟疾病的發(fā)病機制較為復雜，其中慢性缺氧以及微血管病變起重要作用，可誘發(fā)腎臟周圍血管調(diào)控因子失衡及微血管結(jié)構(gòu)受到破壞，同時與微血管內(nèi)皮細胞發(fā)生損傷及修復也有密切關(guān)系。近年來，慢性疾病藥物開發(fā)及治療的熱點開始轉(zhuǎn)向治療血管生成。目前，慢性腎臟疾病重要的病因為糖尿病腎病相關(guān)的慢性進展性腎臟疾病。研究表明，該病患者的腎臟微血管出現(xiàn)結(jié)構(gòu)異常，且與管周毛細胞的缺少存在緊密關(guān)系［7］。血管新生是指從原有的血管上以發(fā)芽或嵌入的方式形成新的毛細血管的過程［8］。一般認為A n g-1具有保持血管穩(wěn)定和完整性、調(diào)節(jié)血管功能的作用，而A n g-2使血管的穩(wěn)定性消失，主要表達在血管修復時的血管［9-10］，并涉及血管病變級炎癥性疾病的病理生理過程［11］。

A n g是一種能夠針對血管內(nèi)皮細胞發(fā)揮作用的細胞因子，能夠?qū)π律艿纳杉跋嚓P(guān)調(diào)控發(fā)揮重要作用。從種類進行分類，A n g家族可以分為4個亞類，即A n g-1、A n g-2、A n g-3及A n g-4，內(nèi)皮細胞Tie-2受體可與這4類因子結(jié)合并發(fā)揮生理功能。其中，A n g-2是內(nèi)皮細胞產(chǎn)生，與促血管生成素受體Tie-2結(jié)合后較為特殊，即不產(chǎn)生磷酸化反應(yīng)而發(fā)揮對A n g-1競爭性抑制作用，是啟動血管再次重構(gòu)的主要因子，在血管新生的后期尤其血管的構(gòu)建、成熟與穩(wěn)定需要A n g-2家族的參與。A n g-2是內(nèi)皮細胞炎癥反應(yīng)的自分泌調(diào)節(jié)因子。有實驗表明，在高血糖情況下，A n g-2在心臟及視網(wǎng)膜等內(nèi)皮細胞中高表達，并使血管受損傷級內(nèi)皮細胞凋亡［12］。

本實驗中作者采用重組腺病毒A n g-1干預(yù)后發(fā)現(xiàn)A n g-1腺病毒組A n g-2 m R N A和蛋白表達較糖尿病和空白載體組上調(diào)。A n g-1可通過募集血管周細胞和平滑肌細胞重塑血管，促進內(nèi)皮細胞增殖和修復，形成完整、功能正常的血管網(wǎng)，是維持成熟血管穩(wěn)定的重要因子；而A n g-2是啟動血管再次塑型的關(guān)鍵因子，主要表達于重塑或修復時的血管，A n g-1在糖尿病中后期表達下調(diào)，通過外源性A n g-1干預(yù)形成更加成熟穩(wěn)定的血管。A n g-2升高表明糖尿病腎病中后期有血管不完整及不穩(wěn)定性，表明它是啟動血管再次重構(gòu)的主要因子；糖尿病腎病后期有血管破壞，重塑新生的血管。提示A n g-1對糖尿病腎臟血管新生產(chǎn)生保護效應(yīng)。另外，研究顯示，在腹膜的新生血管形成期間，A n g-1出現(xiàn)下調(diào)，這是誘發(fā)新生血管后續(xù)消失的重要因素；通過給予A n g-1（外源性），有助于減輕糖尿病并發(fā)癥，諸如能夠有效緩解患者血-視網(wǎng)膜屏障紊亂，延緩腎臟纖維化進展［13-14］。

目前采用A n g-1干預(yù)性治療慢性腎臟病尤其是糖尿病腎病的研究報道較少，且多為短期實驗觀察。本實驗旨在探討促進血管新生和穩(wěn)定對DN進展的影響，實驗中如重組腺病毒A n g-1給予時間、劑量、途徑僅參照國外文獻，評價血管新生的指標，還有待進一步繼續(xù)研究。

［1］M O GI L I N S，K R I S H N A S W A M Y V R，J A Y A R A M A N M，et al. A ltered an g io g enic balance in k eloids:a k ey to therape u tic interv ention［J］.Transl R es，2012，159（3）:182-189.

［2］劉琳，謝志明.血管生成素-1在小鼠腎臟發(fā)育中的表達及作用［J］.中國生化藥物雜志，2012，33（4）:430-432.

［3］馮國慶，魏凱，楊萬杰，等.血管粘附蛋白-1在糖尿病腎病患者體內(nèi)水平變化及意義［J］.臨床研究，2013，21（21）:2461-2462.

［4］R E I NDE RS E J，R A B E L I N K T J，B R I S C O E D M.A n g io g enesis and endothelial cell repair in renal disease and allo g ra f t re j ection［J］. J A m S oc Nephrol，2006，17（4）:932-942.

［5］尤巧英，黃迪華.血管生成素2及血管內(nèi)皮生長因子與2型糖尿病大血管病變的關(guān)系［J］.中國糖尿病雜志，2014，22（3）:252-254.

［6］汪琛穎，司馬義·薩依木，馬晴，等.糖尿病腎病大鼠胰基因組. DN A甲基化狀態(tài)的變化［J］.北京師范大學學報（自然科學版），2004，38（3）:395-398.

［7］N A R I S A F，P R A S I T F.R enal micro v asc u lar disease predicts renal fu nction in diabetes［J］.R enal F ail u re，2012，34（34）:126-129.

［8］M A S A BU MI S.V asc u lar endothelial g ro w th f actor and its receptor system:P hysiolo g ical fu nctions in an g io g enesis and patholo g ical roles in v ario u s diseases［J］.J B iochem，2013，153（1）:13-19.

［9］R A L U C A A C，A N C A M C，I V A N K A D，et al.E v erolim u s d u al e ff ects o f an area v asc u losaan g io g enesis and lymphan g io g enesis［J］. I n V i v o，2013，27（1）:61-66.

［10］何泉，羅海明，朱寶生，等.2型糖尿病腎病患者血管生成素2A1087G基因多態(tài)性的研究［J］.中國全科醫(yī)學，2013，4（16）: 1216-1220.

［11］A H M ED A，F(xiàn) UJ I S A W A T.M u ltiple roles o f an g iopoieetins in athero g enesis［J］.C u rr O pin L ipidol，2011，22（5）:380-385.

［12］尤巧英，黃迪華，諸葛福媛.血管生成素2及血管內(nèi)皮生長因子與2型糖尿病大血管病變的關(guān)系［J］.中國糖尿病雜志，2014，3（22）: 252-254.

［13］林文雄，王彪，蘇振民.促血管生成素-1、2及Tie2在血管瘤及血管畸形中的表達及意義［J］.中國美容整形外科雜志，2008，1（1）: 62-66.

［14］胡國恒，盛望，李旭華，等.益氣活血組方對大鼠缺血心肌血管新生因子A n g-1/A n g-2表達的影響［J］.中醫(yī)藥導報，2013，8（8）:71-74.

（申海菊 編輯）

Effect of recombinant adenovirus angiopoietin-1 on renal angiogenesis in diabetic rats*

Zi-yang Zhang，Zhou-ke Tan，Ming-yan Cao，Yi-bin Yang
（Department of Nephropathy and Rheumatology，the First Affiliated Hospital of Zunyi Medical School，Zunyi，Guizhou 563003，China）

Objective To establish diabetic nephropathy rat model and observe diabetic kidney exogenous expression of angiopoietin-1（Ang-1）by adenovirus and to study its effect on generation of new blood vessels inthe kidneys，inorder toprovidereference for clinical treatment of diabeticnephropathy.M ethods Streptozotocin（STZ）was chosen for diabetic nephropathy modeling of SD rats.The model rats were divided into two groups，namely normal control group and diabetic nephropathy group；and diabetic nephropathy model group was further divided into three subgroups as diabetic group，empty vector group and Ang-1 adenovirus group.Since the eighth week of successful rat modeling，Ang-1 adenovirus vector and empty vector were injected through tail vein.At different time，such as the 8th week，12th week，20th week and 28th week，the level of urine protein content of each group was detected，and kidney level of Ang-2 mRNA was analyzed using real-time quantitative PCR.Results Urinary proteins of the diabetic nephropathy model group were significantly higher than those in the healthy rats（P＜0.01），and only in the first 20 weeks，urine protein levels of the empty vector group and the diabetic group were significantly lower than those in the Ang-1treatment group（P＜0.01）.Urine protein content and Ang-2 mRNA were not detected in healthy kidney tissue of the control group；while those in the diabetes group，empty vector group and Ang-1 adenovirus group were significantly elevated after the 12th week，especially those of the Ang-1 adenovirus group with the peak values at the 20th week（P＜0.05）；and reduced in the 28th week，Ang-2 mRNA levels of the diabetic group，empty vector group and Ang-1adenovirus group were statistically different（P＜0.05）.Ang-2 and urinary protein excretion showed a negative correlation（r=-0.601，P＜0.05）.Conclusions The exogenous administration of Ang-1 in diabetic kidney has a protective effect on angiogenesis.

angiopoietin；diabetic nephropathy；angiogenesis；adenoviral vector

R 587.2

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.15.001

1005-8982（2016）15-0001-05

2015-12-07

國家自然科學基金（No：81260118）

楊亦彬，E-mail：yyb1011@sina.com；Tel：13765930909