鈣蛋白酶抑制劑Calpeptin對乳腺癌MDA-MB-231細胞遷移的影響

張夢曉，孫小錦，張智瑞，潘　瓊，趙素容，劉　浩

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·基礎醫(yī)學·

鈣蛋白酶抑制劑Calpeptin對乳腺癌MDA-MB-231細胞遷移的影響

張夢曉，孫小錦，張智瑞，潘瓊，趙素容，劉浩

目的：探討鈣蛋白酶抑制劑Calpeptin對乳腺癌MDA-MB-231細胞遷移能力的影響，為治療乳腺癌轉(zhuǎn)移提供思路。方法：MTT法檢測不同濃度Calpeptin對MDA-MB-231細胞增殖的影響；細胞劃痕實驗及Transwell遷移實驗檢測不同濃度的Calpeptin對MDA-MB-231細胞遷移的影響；Western blot法檢測不同濃度Calpeptin對MDA-MB-231細胞基質(zhì)金屬蛋白酶-2表達的影響。結果：Calpeptin可抑制MDA-MB-231細胞的增殖，其增殖抑制作用隨濃度的增大而增加(P<0.01)。Calpeptin作用MDA-MB-231細胞24 h后，細胞的遷移能力明顯下降(P<0.01)。Western blot結果顯示，Calpeptin可下調(diào)MDA-MB-231細胞中細胞基質(zhì)金屬蛋白酶-2的表達。結論：Calpeptin能夠抑制乳腺癌MDA-MB-231細胞遷移，其機制可能與下調(diào)MMP-2的表達有關。

乳腺腫瘤；MDA-MB-231細胞；鈣蛋白酶；Calpeptin；遷移；細胞基質(zhì)金屬蛋白酶-2

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，全身系統(tǒng)性轉(zhuǎn)移是乳腺癌發(fā)展的最終結果，也是導致患者死亡的主要原因，其具體機制仍不完全清楚。鈣蛋白酶(calpain)是依賴于Ca2+的蛋白水解酶，其在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用是近年來的研究熱點[1-2]，calpain抑制劑也是抗腫瘤藥物開發(fā)的重要方向[3]。本研究以乳腺癌MDA-MB-231細胞為對象，觀察了calpain抑制劑Calpeptin對MDA-MB-231細胞增殖及遷移能力的影響，并對其作用機制進行初步探討，以期為乳腺癌轉(zhuǎn)移的治療提供思路。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞人乳腺癌細胞系MDA-MB-231，購自美國ATCC，蚌埠醫(yī)學院生化藥理學實驗室凍存。

1.1.2主要試劑及耗材DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司；胎牛血清(FBS)購自杭州四季青工程材料有限公司；Calpeptin購自Sigma公司；兔抗人MMP-2抗體購自Abcam公司；鼠抗人β-actin抗體、山羊抗兔IgG、山羊抗鼠IgG購自Biosharp公司；Transwell小室、細胞培養(yǎng)瓶及培養(yǎng)板購自Corning公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)MDA-MB-231細胞培養(yǎng)于含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃、飽和濕度、5%CO2的條件下培養(yǎng)。

1.2.2MTT法檢測細胞存活率取處于對數(shù)生長期的細胞，以5×104/mL的密度接種于96孔板中，每孔100 μL，24 h后換用無血清DMEM培養(yǎng)。實驗設置調(diào)零組、對照組和不同濃度Calpeptin(10、20、50、100 μmol/L)處理組。培養(yǎng)24 h或48 h后，每孔加入MTT溶液 15 μL，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，棄上清，每孔加入DMSO 150 μL，振蕩10 min，490 nm波長處測定吸光度值。以(OD給藥組-OD調(diào)零組)/(OD對照組-OD調(diào)零組)×100%計算細胞存活率。

1.2.3細胞劃痕實驗取對數(shù)生長期的細胞，以1×105/mL的密度接種于6孔板，每孔2 mL，培養(yǎng)24 h。待細胞生長至90%融合時，用200 μL的無菌槍頭沿孔中心刻痕，棄去原有培養(yǎng)基，用PBS漂洗3次。每孔加入含1% FBS的DMEM培基2 mL。實驗分為對照組和不同濃度的Calpeptin(10、20、50 μmol/L)處理組。分別于處理的0 h和24 h觀察劃痕愈合情況并拍照。采用Image J軟件分析劃痕愈合率。

1.2.4Transwell遷移實驗取對數(shù)生長期的細胞，消化后用無血清DMEM培養(yǎng)基重懸，Transwell小室的上室中加入200 μL含或不含藥物的細胞懸液，每孔5×104個細胞；下室加入600 μL含5%FBS的DMEM培養(yǎng)基。實驗分組同細胞劃痕實驗。于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后，取出小室，PBS漂洗3次，室溫下置于4%多聚甲醛固定15 min，濕棉棒擦除上室細胞后，1%結晶紫染液室溫下染色15 min，顯微鏡下每孔隨機取5個視野拍照，細胞計數(shù)。

1.2.5Western blot法檢測蛋白表達取對數(shù)生長期的細胞，接種于6 cm培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)至90%融合。實驗分組同細胞劃痕實驗。處理24 h后，消化收集細胞，加入含有蛋白酶抑制劑的細胞裂解液冰上裂解30 min，離心后吸取上清液，BCA法測定蛋白濃度。每組取20 μg蛋白，經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)至PVDF膜，5 %脫脂牛奶室溫封閉4 h后，一抗4 ℃孵育過夜，TPBS洗膜后，二抗室溫孵育2 h，ECL發(fā)光顯影，Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)獲取圖像。

1.3統(tǒng)計學方法采用方差分析和q檢驗。

2　結果

2.1不同濃度Calpeptin對MDA-MB-231細胞增殖的影響MTT結果顯示，與對照組比較， 10、20、50、100 μmol/L的Calpeptin作用于MDA-MB-231細胞24 h和48 h存活率均明顯降低(P<0.01)，且Calpeptin對MDA-MB-231細胞的增殖抑制作用均隨濃度和作用時間的增加而增強(見表1)。

q檢驗：與對照組比較**P<0.01；與10 μmol/L Calpeptin組比較△△P<0.01；與20 μmol/L Calpeptin組比較##P<0.01；與50 μmol/L Calpeptin組比較&&P<0.01

2.2不同濃度Calpeptin對MDA-MB-231細胞遷移的影響劃痕實驗結果顯示，經(jīng)不同濃度Calpeptin處理后，MDA-MB-231細胞的劃痕愈合率明顯低于對照組(P<0.01)，且隨著Calpeptin濃度增加，MDA-MB-231細胞劃痕愈合率顯著降低(P<0.01)(見圖1、表2)。

q檢驗：與對照組比較**P<0.01；與10 μmol/L Calpeptin組比較△△P<0.01；與20 μmol/L Calpeptin組比較##P<0.01

Transwell遷移實驗結果顯示，使用不同濃度Calpeptin處理MDA-MB-231細胞后，穿膜進入Transwell下室的細胞數(shù)目均較對照組明顯減少(P<0.01)，且下室細胞數(shù)目隨Calpeptin濃度的增加而減少(P<0.01)(見圖2、表3)。

2.3Calpeptin下調(diào)MDA-MB-231細胞中MMP-2的表達Western blot法結果顯示，采用Calpeptin處理24 h后，MDA-MB-231細胞中MMP-2的表達下降(見圖3)。

q檢驗：與對照組比較**P<0.01；與10 μmol/L Calpeptin組比較△△P<0.01；與20 μmol/L Calpeptin組比較##P<0.01

3　討論

Calpain是一類鈣依賴性的半胱氨酸蛋白酶，已知有16種亞型，其中calpain-1和calpain-2是最主要的同工酶。calpain通過有限的蛋白水解作用調(diào)控多種蛋白質(zhì)的生物學活性，在細胞骨架重構、神經(jīng)發(fā)育、細胞周期調(diào)控與凋亡、葡萄糖轉(zhuǎn)運、細胞信號轉(zhuǎn)導等生理過程中有重要作用。惡性腫瘤細胞中calpain的表達或活性常明顯升高，如calpain在膽囊癌組織內(nèi)呈高表達，且表達陽性率明顯高于癌旁組織，提示其可能與癌癥的疾病進展正相關[4]；而乳腺腫瘤中，calpain的活性明顯增高，可剪切乳腺癌細胞表面的人表皮生長因子受體2，降低腫瘤細胞對內(nèi)分泌治療的敏感性[5]。以往的研究結果顯示，抑制calpain的活性可導致多種腫瘤細胞的死亡[1]，因此calpain抑制劑的開發(fā)是抗腫瘤藥物研發(fā)的重要方向。calpeptin是一種人工合成的高效、具有細胞滲透性的、廣泛的calpain抑制劑，其在動物實驗中顯示出較好的對腦缺血再灌注損傷的保護作用，提示其有可能被開發(fā)成藥物應用于臨床。MATAGA等[6]的研究結果表明，calpeptin可將MDA-MB-231細胞阻滯在S期并增加其早期凋亡。本研究結果證實，calpeptin可濃度依賴地抑制MDA-MB-231細胞的增殖(P<0.01)。

腫瘤轉(zhuǎn)移是一個多因素調(diào)控、多階段、連續(xù)復雜的生物學過程，細胞遷移能力的大小被認為是腫瘤轉(zhuǎn)移的限速環(huán)節(jié)。腫瘤細胞在細胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)中的運動可分為4個步驟：(1)細胞前緣偽足形成與延伸；(2)細胞前段局部黏著斑形成；(3)肌動-肌球蛋白復合體介導細胞體收縮；(4)細胞尾部黏著斑解離。calpain的活化是導致細胞遷移能力增強的重要原因。已證實，參與黏著斑形成的多種蛋白，如黏著斑激酶、整合素、ezrin、talin等均是calpain的底物[2]，calpain通過蛋白水解作用，切斷整合素與肌動蛋白細胞骨架的聯(lián)結，使細胞尾部黏著斑解體，促進細胞的遷移。此外，CORTESIO等[8]發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌細胞中，calpain-2的活化對于偽足的形成是必需的，使用RNA干擾降低calpain-2的表達后，偽足的形成及細胞的侵襲能力被明顯抑制。因此，抑制calpain的活性可能成為抑制腫瘤細胞遷移的重要手段。本研究采用細胞劃痕實驗及Transwell遷移實驗證明，calpeptin能夠抑制MDA-MB-231細胞的遷移，且其抑制作用隨藥物濃度的增大而增加(P<0.01)。

在腫瘤轉(zhuǎn)移的過程中，ECM的降解和基膜的破壞是一個關鍵步驟?；|(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)是一類鋅離子依賴的蛋白水解酶，能降解幾乎所有ECM成分。一般認為MMP-2與腫瘤轉(zhuǎn)移的關系十分密切。多個研究表明calpain可增加MMP-2的表達。calpain的小亞基(Capn4)可通過磷酸化FAK及Src激活FAK-Src信號通路，進而上調(diào)肝癌細胞中MMP-2的表達[8]，使用siRNA下調(diào)calpain的表達后，肝癌細胞的MMP-2和MMP-9的分泌顯著降低；而在鼻咽癌細胞中，Capn4通過活化核因子-κB增加MMP-2的表達，增加腫瘤細胞的侵襲遷移能力[9]。本研究結果表明，Calpeptin能降低MDA-MB-231細胞中MMP-2的表達。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)，鈣蛋白酶抑制劑Calepetin對MDA-MB-231細胞遷移具有明顯的抑制作用，其機制可能與其下調(diào)靶細胞內(nèi)MMP-2的表達有關。本研究為calpeptin抗腫瘤作用的開發(fā)提供了理論基礎，也為以calpain為抗腫瘤治療靶點提供了思路。

[1]STORR SS,CARRAGHER NN,FRAME MM,etal.The calpain system and cancer[J].Nat Rev Cancer,2011,11(5):364.

[2]MORETTI DD,DEL BELLO BB,ALLAVENA GG,etal.Calpains and cancer:friends or enemies?[J].Arch Biochem Biophy,2014,564:26.

[3]LELOUP LL,WELLS AA.Calpains as potential anti-cancer targets[J].Expert Opin Ther Targets,2011,15(3):309.

[4]LUO WW,REN ZZ,GAO SS,etal.Clinical correlation of calpain-1 and glypican-3 expression with gallbladder carcinoma[J].Oncol Letters,2016,11(2):1345.

[5]PU XX,STORR SS,AHMAD NN,etal.Calpain-1 is associated with adverse relapse free survival in breast cancer:a confirmatory study[J].Histopathology,2016,68(7):1021.

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[8]DAI ZZ,ZHOU SS,ZHOU ZZ,etal.Capn4 contributes to tumour growth and metastasis of hepatocellular carcinoma by activation of the FAK-Src signalling pathways[J].Pathol,2014,234(3):316.

[9]ZHENG PP,CHEN XX,ZHU HH,etal.Capn4 is a marker of poor clinical outcomes and promotes nasopharyngeal carcinoma metastasis via nuclear factor-κB-induced matrix metalloproteinase 2 expression[J].Cancer Sci,2014,105(6):630.

(本文編輯劉璐)

Effect of calpain inhibitor Calpeptin on the migration of MDA-MB-231 breast cancer cells

ZHANG Meng-xiao,SUN Xiao-jin,ZHANG Zhi-rui,PAN Qiong,ZHAO Su-rong,LIU Hao

(DepartmentofPharmacy,BengbuMedicalCollege,AnhuiEngineeringTechnologyResearchCenterofBiochemicalPharmaceuticals,BengbuAnhui233030,China)

Objective:To investigate the effects of calpain inhibitor Calpeptin on the migration of MDA-MB-231 breast cancer cells for providing an idea in treating the metastatic breast cancer.Methods:The effects of different concentrations of Calpeptin on the proliferation of MDA-MB-231 cells were determined using MTT assay.The effects of different concentrations of Calpeptin on the migration of MDA-MB-231 cells were detected using the wound healing assay and transwell migration assay.The effects of different concentrations of Calpeptin on the expression of matrix metalloproteinase-2(MMP-2) in MDA-MB-231 cells were detected using Western blot.Results:Calpeptin could suppress the proliferation of MDA-MB-231 breast cancer cells,the inhibiting effects of which increased with the increasing of the concentrations of Calpeptin(P<0.01).The migration ability of MDA-MB-231 cells decreased significantly after 24 h of treatment with Calpeptin(P<0.01).The result of Western blot showed that Calpeptin could down-regulate the expression of MMP-2 in MDA-MB-231 cells.Conclusions:Calpeptin can inhibit the migration of MDA-MB-231 cells,the mechanism of which may involve in the down-regulation of MMP-2.

breast neoplasms;MDA-MB-231;cells calpain;Calpeptin;migration;matrix metalloproteinase-2

2016-05-21

國家自然科學基金項目(81372899)；蚌埠醫(yī)學院自然科學基金項目(Byky1447)

單位] 蚌埠醫(yī)學院 藥學系，安徽省生化藥物工程技術研究中心，安徽 蚌埠 233030

[作者簡介] 張夢曉(1988-)，女，碩士，助教.

劉浩，博士，碩士研究生導師，教授.E-mail:liuhao6886@foxmail.com

1000-2200(2016)07-0841-04

R 737.9

A

10.13898/j.cnki.issn.1000-2200.2016.07.001