5-Aza-dC、TSA腹腔注射治療小鼠子宮內(nèi)膜異位癥療效觀察

沈芳華，呂弘道，高紅，徐彩英，王利明，顧蓮萍

(1南通大學(xué)附屬吳江醫(yī)院，江蘇蘇州215200；2蘇州市吳江區(qū)第一人民醫(yī)院)

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5-Aza-dC、TSA腹腔注射治療小鼠子宮內(nèi)膜異位癥療效觀察

沈芳華1，2，呂弘道1，2，高紅1，2，徐彩英1，2，王利明1，2，顧蓮萍1，2

(1南通大學(xué)附屬吳江醫(yī)院，江蘇蘇州215200；2蘇州市吳江區(qū)第一人民醫(yī)院)

目的觀察5′-氮雜-2′-脫氧胞苷(5-Aza-dC)、曲古抑菌素A(TSA)腹腔注射治療小鼠子宮內(nèi)膜異位癥(內(nèi)異癥)的療效。方法取35只BALB/c小鼠，將子宮片段分別縫于雙側(cè)腹膜、雙角子宮起始處及腸系膜處制作內(nèi)異癥模型。建模3周后分為4組，5-Aza-dC組腹腔注射5-Aza-dC 0.5 mg/(kg·d)，TSA組腹腔注射TSA 0.5 mg/(kg·d)，達(dá)那唑組給予達(dá)那唑110 mg/(kg·d)灌胃，模型對(duì)照組腹腔注射等量生理鹽水。分別于給藥前及給藥3周測(cè)算各組異位內(nèi)膜病灶體積。8只小鼠正常飼養(yǎng)，設(shè)為正常對(duì)照組，采用醋酸扭體實(shí)驗(yàn)評(píng)估各組小鼠給藥1、3周時(shí)的疼痛反應(yīng)。結(jié)果5-Aza-dC組、TSA組及達(dá)那唑組給藥3周時(shí)異位內(nèi)膜病灶體積較給藥前明顯縮小(P均<0.01)。模型對(duì)照組與正常對(duì)照組相比，疼痛反應(yīng)時(shí)間縮短、扭體次數(shù)增加(P均<0.01)；5-Aza-dC組、TSA組組內(nèi)不同給藥時(shí)間的疼痛反應(yīng)時(shí)間、扭體次數(shù)相比，P均<0.05；5-Aza-dC組、TSA組疼痛反應(yīng)時(shí)間較模型對(duì)照組延長(zhǎng)、扭體次數(shù)減少(P均<0.05)。結(jié)論5-Aza-dC、TSA治療小鼠內(nèi)異癥有效，可減小異位病灶體積，同時(shí)減輕疼痛。

子宮內(nèi)膜異位癥；5′-氮雜-2′-脫氧胞苷；曲古抑菌素A；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

子宮內(nèi)膜異位癥(以下簡(jiǎn)稱內(nèi)異癥)是一種婦科常見病，至今尚無根治藥物。多項(xiàng)研究[1，2]發(fā)現(xiàn)，內(nèi)異癥可能是一種表觀遺傳學(xué)疾病。DNA甲基化及組蛋白去乙酰化是表觀遺傳學(xué)改變的重要表現(xiàn)方式，這些過程可逆。5′-氮雜-2′-脫氧胞苷(5-Aza-dC)是一種嘧啶類去甲基化藥物。曲古抑菌素A(TSA)是一種組蛋白去乙?；敢种苿?。有學(xué)者[3～6]通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，5-Aza-dC、TSA可通過多種機(jī)制抑制異位內(nèi)膜細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡。2014年10月～2015年2月，我們制作了小鼠內(nèi)異癥模型，觀察了5-Aza-dC、TSA治療內(nèi)異癥的效果，現(xiàn)報(bào)告如下。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與材料健康、雌性、未孕、6～8周齡BALB/c小鼠45只(上海動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究所提供)，體質(zhì)量20～24.2 g，飼以高壓滅菌飼料及無菌水，實(shí)驗(yàn)前在飼養(yǎng)室飼養(yǎng)2周以適應(yīng)環(huán)境。5-Aza-dC，TSA，苯甲酸雌二醇，達(dá)那唑，戊巴比妥鈉，青霉素，冰醋酸，相差顯微鏡(型號(hào)Olympus CKX41)。

1.2內(nèi)異癥小鼠模型制作取35只BALB/c小鼠，戊巴比妥鈉80 mg/kg腹腔注射麻醉，將小鼠左側(cè)子宮卵巢端及陰道端兩側(cè)結(jié)扎，剪下左側(cè)子宮，縱剖及橫斷成4個(gè)片段，分別縫于雙側(cè)腹膜、雙角子宮起始的“V”形處及腸系膜處。術(shù)后1～3 d肌注青霉素170萬U/(kg·d)，分別于術(shù)后第2、5、8、11天肌注苯甲酸雌二醇0.5 mg/kg促進(jìn)異位內(nèi)膜生長(zhǎng)。建模第3周末，剖腹探查異位內(nèi)膜生長(zhǎng)情況，以移植物體積增大呈透明結(jié)節(jié)狀或囊狀、內(nèi)有液體集聚、表面有結(jié)締組織覆蓋及血管形成視為建模成功。取部分組織做病理檢查證實(shí)。

1.3動(dòng)物分組與5-Aza-dC、TSA用法將建模成功的32只小鼠隨機(jī)分為4組，每組8只。5-Aza-dC組腹腔注射5-Aza-dC 0.5 mg/(kg·d)[7]；TSA組腹腔注射TSA 0.5 mg/(kg·d)；達(dá)那唑組以達(dá)那唑110 mg/(kg·d)灌胃；模型對(duì)照組腹腔注射等量生理鹽水。

1.4異位病灶體積測(cè)算分別于給藥前及給藥3周時(shí)測(cè)量各組小鼠異位內(nèi)膜病灶的長(zhǎng)、寬、高并以長(zhǎng)×寬×高計(jì)算病灶體積，每只小鼠取四個(gè)病灶的均值。同時(shí)收集異位內(nèi)膜組織，室溫固定24 h，脫水后石蠟包埋，做5 μm厚切片，進(jìn)行HE染色，顯微鏡下觀察病理變化。

1.5小鼠疼痛反應(yīng)觀察分別于給藥1、3周時(shí)進(jìn)行醋酸扭體實(shí)驗(yàn)。各組小鼠腹腔注射0.6%醋酸0.2 mL/只，用秒表記錄小鼠出現(xiàn)疼痛反應(yīng)時(shí)間及20 min內(nèi)的扭體次數(shù)。另取正常飼養(yǎng)的8只小鼠設(shè)為正常對(duì)照組，與各建模組同時(shí)進(jìn)行醋酸扭體實(shí)驗(yàn)。

2　結(jié)果

2.1各組小鼠給藥前后異位病灶體積比較5-Aza-dC組給藥前及給藥3周時(shí)異位病灶體積分別為(69.25±25.19)、(13.91±16.09)mm3，TSA組分別為(60.19±22.38)、(14.20±19.44)mm3，達(dá)那唑組分別為(68.25±13.13)、(24.06±9.28)mm3，模型對(duì)照組分別為(68.63±16.53)、(67.13±26.56)mm3。5-Aza-dC組、TSA組及達(dá)那唑組給藥前后異位病灶體積相比，P均<0.01；5-Aza-dC組、TSA組及達(dá)那唑組給藥3周時(shí)異位病灶體積相比，P均>0.05。

2.2各組小鼠疼痛反應(yīng)比較模型對(duì)照組與正常對(duì)照組相比，疼痛反應(yīng)時(shí)間縮短，扭體次數(shù)增加(P均<0.01)；5-Aza-dC組、TSA組組內(nèi)不同給藥時(shí)間的疼痛反應(yīng)時(shí)間、扭體次數(shù)相比，P均<0.05；5-Aza-dC組、TSA組疼痛反應(yīng)時(shí)間較模型對(duì)照組延長(zhǎng)、扭體次數(shù)減少(P均<0.05)。見表1。

表1　各組小鼠疼痛反應(yīng)時(shí)間及扭體次數(shù)比較±s)

注：與同組給藥1周時(shí)相比，*P<0.05；與正常對(duì)照組相比，#P<0.01；與模型對(duì)照組相比，△P<0.05。

3　討論

內(nèi)異癥的現(xiàn)有藥物治療方案如孕激素、雄激素及促性腺激素釋放激素激動(dòng)劑等均只能暫時(shí)緩解癥狀，無法達(dá)到根治，手術(shù)治療后復(fù)發(fā)率也很高，所以，新的治療方式正在不斷探索中。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，表觀遺傳學(xué)改變?cè)趦?nèi)異癥的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。表觀遺傳學(xué)改變主要表現(xiàn)為DNA甲基化修飾和組蛋白的去乙酰化修飾等[8，9]。有學(xué)者[2，10]發(fā)現(xiàn)，內(nèi)異癥患者的許多基因均存在表觀遺傳學(xué)改變，此過程可逆，如采用甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑或去乙?；敢种苿型麖幕蛩侥孓D(zhuǎn)疾病進(jìn)展，進(jìn)行基因靶向治療[11]。

5-Aza-dC是一種嘧啶類去甲基化藥物。TSA為組蛋白去乙酰化酶抑制劑。研究[12]發(fā)現(xiàn)，5-Aza-dC在體外可通過不同途徑抑制多種腫瘤細(xì)胞增殖，而且，5-Aza-dC在復(fù)發(fā)性、頑固性白血病和慢性髓性白血病危象治療方面已進(jìn)入Ⅲ期臨床試驗(yàn)。TSA也可抑制多種腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，如白血病細(xì)胞、肝癌細(xì)胞、胃癌細(xì)胞等[13]。體外實(shí)驗(yàn)中已發(fā)現(xiàn)5-Aza-dC 、TSA可明顯抑制異位內(nèi)膜生長(zhǎng)[3～6，14]，這為內(nèi)異癥的治療提供了一條全新途徑。有學(xué)者[15]發(fā)現(xiàn)TSA可抑制小鼠異位病灶生長(zhǎng)，下調(diào)異位病灶中痛覺相關(guān)基因瞬時(shí)受體電位香草酸亞型1(TRPV1)的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)建立了小鼠內(nèi)異癥模型，并給予5-Aza-dC、TSA、達(dá)那唑，發(fā)現(xiàn)5-Aza-dC組、TSA組、達(dá)那唑組內(nèi)異癥病灶體積較模型對(duì)照組明顯縮小，可見5-Aza-dC及TSA治療內(nèi)異癥有一定效果。

內(nèi)異癥是一種疼痛相關(guān)疾病，該病最主要的臨床表現(xiàn)為疼痛，包括痛經(jīng)、慢性盆腔痛、性交痛等。有學(xué)者[16]發(fā)現(xiàn)內(nèi)異癥患者痛閾較正常人群降低。小鼠醋酸扭體實(shí)驗(yàn)是常用的鎮(zhèn)痛藥篩選方法。我們通過醋酸扭體實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，模型對(duì)照組與正常對(duì)照組相比，疼痛反應(yīng)時(shí)間有所縮短、扭體次數(shù)增加，提示內(nèi)異癥小鼠痛閾較正常小鼠有所降低，這與He等[16]的研究結(jié)論一致。5-Aza-dC組及TSA組與模型對(duì)照組相比，疼痛反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)、扭體次數(shù)減少，表明5-Aza-dC、TSA有一定的鎮(zhèn)痛作用。

總之，我們認(rèn)為，5-Aza-dC、TSA治療小鼠內(nèi)異癥有效，可減小異位病灶體積，同時(shí)減輕疼痛，5-Aza-dC、TSA有望成為治療內(nèi)異癥新的藥物，但兩藥的具體作用機(jī)制和不良反應(yīng)仍需進(jìn)一步研究。

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A

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2015-10-10)