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    草魚(♀)×赤眼鱒(♂)雜交F1與其親本的肌肉特性比較研究

    2016-08-31 02:25:56肖調(diào)義褚武英何美鳳周智愚金生振鄧亞林
    湖南師范大學自然科學學報 2016年3期
    關(guān)鍵詞:肉質(zhì)父本母本

    李 迪,李 偉,肖調(diào)義,2*,褚武英,2*,何美鳳,周智愚,金生振,鄧亞林

    (1.湖南農(nóng)業(yè)大學,湖南省特色水產(chǎn)資源利用工程技術(shù)研究中心,中國 長沙 410128;2.湖南文理學院,水產(chǎn)高效健康生產(chǎn)湖南省協(xié)同創(chuàng)新中心,中國 常德 415000)

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    草魚(♀)×赤眼鱒(♂)雜交F1與其親本的肌肉特性比較研究

    李迪1,李偉1,肖調(diào)義1,2*,褚武英1,2*,何美鳳1,周智愚1,金生振1,鄧亞林1

    (1.湖南農(nóng)業(yè)大學,湖南省特色水產(chǎn)資源利用工程技術(shù)研究中心,中國 長沙410128;2.湖南文理學院,水產(chǎn)高效健康生產(chǎn)湖南省協(xié)同創(chuàng)新中心,中國 常德415000)

    為探討草魚(♀)×赤眼鱒(♂)雜交F1的肉質(zhì)特點,以同規(guī)格的草魚(♀)×赤眼鱒(♂)雜交F1和其親本草魚(母本)、赤眼鱒(父本)為材料,采用質(zhì)構(gòu)儀測定分析比較了三者肌肉質(zhì)構(gòu)特性,采用冷凍切片法和HE染色法統(tǒng)計分析比較了三者肌纖維數(shù)量和密度,采用實時熒光定量PCR的方法分析了與肉質(zhì)特性關(guān)聯(lián)緊密的鈣蛋白酶抑制蛋白(CAST)基因、Ⅰ型膠原蛋白α1基因(COL1A1)和α2基因(COL1A2).在雜交F1和親本肌肉中的表達量.結(jié)果顯示:雜交F1與母本草魚、父本赤眼鱒的肌肉黏附性、膠著性和回復(fù)性無顯著性差異(P>0.05);雜交F1的肌肉硬度、彈性、內(nèi)聚性和咀嚼性均顯著高于母本草魚(P<0.05),與父本赤眼鱒無顯著差異;雜交F1的肌纖維直徑和密度與其母本草魚無顯著差異(P>0.05),與其父本赤眼鱒差異顯著(P<0.05);COL1A1和COL1A2兩個基因在雜交F1肌肉組織中的表達量顯著高于其母本草魚(P<0.05),而與其父本赤眼鱒無顯著差異(P>0.05);CAST基因在雜交F1肌肉組織中的表達量顯著高于其母本草魚(P<0.05),與其父本赤眼鱒無顯著差異(P>0.05).

    草魚(♀)×赤眼鱒(♂)雜交F1;肉質(zhì);肌纖維;I型膠原蛋白α1;I型膠原蛋白α2;鈣蛋白酶抑制蛋白

    草魚是我國養(yǎng)殖產(chǎn)量最大的淡水經(jīng)濟魚類.由于生產(chǎn)上近親繁殖的影響,草魚種質(zhì)資源衰退較為嚴重,疾病頻發(fā),其品質(zhì)也呈下降趨勢,肉質(zhì)疏松、口感下降等問題嚴重影響其經(jīng)濟價值.提高草魚抗病力和改善草魚肉質(zhì)是目前急需解決的問題,遠緣雜交育種是實現(xiàn)這一目標的有效方法之一.

    赤眼鱒與草魚同屬雅羅魚亞科,不僅外形上與草魚相似,還具有抗草魚出血病毒(GCRV)強的優(yōu)點,本課題研究團隊在2010年完成了草魚與赤眼鱒的雜交試驗,獲得了正交F1和反交F1兩個雜交子代群體[1].基于日常生活中魚產(chǎn)品肉質(zhì)的口感是吸引消費者的重要原因,本實驗選取正交F1為試驗對象,結(jié)合其母本草魚和父本赤眼鱒的肉質(zhì)特點,對其進行了肌肉特性分析比較研究,并采用Real Time PCR技術(shù),從mRNA水平研究COL1A1,COL1A2,CAST三個基因在不同群體的表達水平,探索基因表達與肉質(zhì)性狀之間的關(guān)系,從分子水平對肌肉品質(zhì)差異的形成進行初步分析,從而系統(tǒng)評價正交F1.

    1 材料與方法

    1.1實驗材料

    選取18月齡雜交F1(體重953.09±23.63 g,體長36.24±0.31 cm)、赤眼鱒(體重235.71±9.81 g,體長20.54±0.35 cm)和草魚(體重2 215.65±69.65 g,體長47.56±0.45 cm)健康個體各10尾,所有樣品均由瀏陽烏龍漁場養(yǎng)殖基地提供.

    1.2 樣品的采集和處理

    每種魚各取10尾,取魚體側(cè)線上部的背部肌肉,在下面放有冰塊的解剖盤內(nèi)按橫縱方向修好組織塊(1 cm×1 cm×0.5 cm).采下后放于30%的蔗糖溶液中脫水24 h.采取背中部肌肉樣品用于質(zhì)構(gòu)實驗.另采取部分背肌放入已滅菌的1.5 mL離心管中,迅速放入液氮中帶回實驗室,置于-80 ℃冰箱保存,用于實時定量PCR分析.

    1.3實驗方法

    1.3.1肌肉質(zhì)構(gòu)特性的測定采取魚背中部肌肉切成厚20 mm×15 mm×15 mm的小塊,利用TA.XT.Plus型物性測試儀(英國Stable Micro Systems公司),使用平底柱形探頭P/36,模擬人牙齒咀嚼食物,對樣品進行兩次壓縮TPA測試,測試條件如下:測試前速率5 mm/s,測試速率1 mm/s,測試后速率5 mm/s,壓縮程度60%,停留間隔時間5 s,負重探頭類型:Auto-5g,數(shù)據(jù)收集率200 pps.樣品在室溫下進行TPA測試,每尾魚取4個平行樣進行測定.

    1.3.2冷凍切片的制備將樣品修整好后放入樣品托上,均勻抹上OCT,迅速放入冰凍切片機內(nèi).待OCT均變?yōu)榘咨?,用刀片休整組織塊并切片.其后再進行HE染色.切片制作完成后,在倒置顯微鏡下觀察并拍照(如圖1).

    1.3.3相關(guān)肉質(zhì)基因表達采用Trizol法提取肌肉RNA,按照Fermentas pure公司提供的cDNA試劑盒產(chǎn)品說明書完成cDNA第一鏈的合成.使用Primer 5.0軟件設(shè)計COL1A1,COL1A2以及CAST的定量引物(如表1),送于鉑尚公司合成.用于熒光定量表達實驗,反應(yīng)程序如表2.

    表1 本文所用的引物序列

    表2 熒光光定量反應(yīng)條件

    1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

    用Image-pro plus 6.0進行肌纖維統(tǒng)計,熒光定量數(shù)據(jù)用EXCEL進行整理,采用SPSS軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析,以各組平均值和標準差表示,P<0.05為差異顯著,P<0.01為差異極顯著.

    2 結(jié)果

    2.1質(zhì)構(gòu)特性

    通過質(zhì)構(gòu)儀對雜交F1及其親本的測定,得到結(jié)果見表3.雜交F1和母本草魚、父本赤眼鱒的肌肉黏附性、膠著性和回復(fù)性無顯著性差異(P>0.05);雜交F1肌肉硬度和彈性(分別為4 791.02±427.89 g和0.65±0.05),顯著高于母本草魚的肌肉硬度和彈性(分別為2 348.82±194.69 g和0.42±0.02) (P<0.05).與其父本赤眼鱒肌肉硬度和彈性(分別為4 658.51±564.32 g和0.64±0.03),無顯著差異.

    表3 草魚(♀)×赤眼鱒(♂)F1與其親本的質(zhì)構(gòu)指標

    注:同列上標小寫字母不同表示二者之間有顯著差異(P<0.05).

    2.2肌肉組織學分析

    在倒置顯微鏡下觀察兩種魚的肌肉切片,可以看出雜交F1和母本草魚的肌纖維紋理清楚,排列緊密,基本結(jié)構(gòu)相同(圖1,彩圖見封三).肌纖維直徑的測量:參考陳璐等[2]的計算方法,選取一定視野范圍內(nèi)的肌纖維進行統(tǒng)計,圖像分析系統(tǒng)計算出每根肌纖維的面積,并默認為“圓”的面積,根據(jù)s=πr2(r為半徑)自動計算出每根肌纖維的等效直徑,統(tǒng)計結(jié)果顯示,如圖2所示,肌纖維直徑大小在30~60 μm范圍內(nèi)的雜交F1占61%,母本草魚占68%,父本赤眼鱒占38%;纖維直徑在60~80 μm范圍內(nèi)的雜交F1占28%,母本草魚占25%,赤眼鱒占41%;80 μm以上的肌纖維直徑雜交F1占11%,母本草魚占7%,父本赤眼鱒占21%. 用SPSS軟件進行單因素方差分析,用平均值±標準差來表示,見表4.結(jié)果表明,雜交F1的肌纖維直徑與其母本草魚肌纖維直徑差異不顯著(P>0.05),但顯著小于其父本赤眼鱒;雜交F1的肌纖維密度與其母本草魚的肌纖維密度無顯著差異(P>0.05),但顯著大于其父本赤眼鱒.

    圖1 雜交F1及其親本的肌肉冰凍切片圖Fig.1 The muscle frozen section of crossbreed F1 and his parents

    圖2 肌纖維分布圖Fig.2 The distribution graph of muscle fibers

    種類肌纖維平均直徑/μm肌纖維平均密度/mm2草魚72.43±9.61a243.89±10.57a赤眼鱒101.74±14.68b164.28±12.85b雜交F180.01±7.86a256.48±17.79a

    注:同列上標小寫字母不同表示二者之間有顯著差異(P<0.05).

    2.3相關(guān)肉質(zhì)基因表達分析

    以草魚RPL13作為內(nèi)參,考察COL1A1,COL1A2,CAST三個基因在F1和草魚肌肉中的表達,COL1A1和COL1A2兩個基因在父本赤眼鱒和雜交F1中的表達量無顯著差異(P>0.05),都較母本草魚高且差異顯著(P<0.05).CAST基因在母本草魚和雜交F1中的表達量無顯著差異(P>0.05),都比父本赤眼鱒低且差異顯著(P<0.05)(如圖3).

    注:字母不同表示差異顯著(P<0.05).圖3 COL1A1,COL1A2和CAST在雜交F1、草魚和赤眼鱒肌肉中的表達量Fig.3 The significance tests of COL1A1,COL1A2 and CAST in the muscle of the three fishes

    3 討論

    肌纖維是組織學特性中較為重要的物理參數(shù),是魚類肌肉品質(zhì)的重要評價指標[3-6].本實驗統(tǒng)計分析了雜交F1和母本草魚、父本赤眼鱒的肌纖維直徑和肌纖維密度.結(jié)果顯示,雜交F1的肌纖維直徑顯著小于父本赤眼鱒,與母本草魚的肌纖維直徑無顯著差異;雜交F1的肌纖維密度顯著大于父本赤眼鱒的肌纖維密度,與母本草魚的肌纖維密度無顯著差異.吳信生[7]等對我國7種地方雞種的組織學研究表明,肌纖維密度與肌肉的嫩度相關(guān)比較密切,7個地方雞種肌纖維密度與嫩度呈負相關(guān),肌纖維直徑與嫩度呈正相關(guān),即肌纖維愈細,肌纖維密度愈大,肉質(zhì)越鮮嫩.劉錚鑄[8]等對波爾山羊雜交后代肌肉組織學特性研究發(fā)現(xiàn)雜交后代羊與唐山奶山羊在眼肌肌纖維密度方面差異顯著,臂三頭肌肌纖維密度雖未達到顯著差異,但雜交后代明顯高于唐山奶山羊,說明雜交后代羊比唐山奶山羊的肉質(zhì)好.本實驗結(jié)果顯示,與父本赤眼鱒相比,雜交F1的肌纖維直徑更小,肌纖維密度更大,這表明雜交F1肉質(zhì)比親本赤眼鱒更鮮嫩.

    質(zhì)構(gòu)特性是決定其品質(zhì)的重要因素之一,儀器測定是質(zhì)構(gòu)特性的重要評價手段,一定程度上減少了人的主觀因素帶來的評價誤差.胡芬[9]等對5種淡水魚的質(zhì)構(gòu)特性進行了相關(guān)性分析,得出硬度和彈性是影響魚肉質(zhì)構(gòu)特性的主要因素.本實驗中雜交F1肌肉硬度和彈性,顯著高于母本草魚的肌肉硬度和彈性.雜交F1肉質(zhì)硬度和彈性增強,會使其口感更好.

    根據(jù)以上實驗結(jié)果,作者選出了COL1A1,COL1A2和CAST三個與肌肉嫩度和彈性相關(guān)基因, 通過實時熒光定量PCR的方法從分子水平上進一步對上述組織學水平指標做出解釋.鈣蛋白酶系統(tǒng)在細胞內(nèi)普遍存在,是降解肌原纖維蛋白的主要酶系統(tǒng),是肌肉蛋白質(zhì)降解的限速環(huán)節(jié),在肌肉的嫩化過程中起著重要作用[10-12].蛋白酶CAST系統(tǒng)在魚類中的相關(guān)研究報道不多,只有斑馬魚[13]、虹鱒[14]和草魚的部分mRNA被克隆分離.Dutt等[15]研究表明,Calpastatin表達量的減少都會導致肌肉蛋白水解及肉質(zhì)嫩度的增加,表明鈣蛋白酶水解作用才是導致肉質(zhì)嫩化的主要因素.關(guān)磊[16]等研究表明鈣蛋白酶抑制蛋白 mRNA 的高表達水平可提高魚類肌肉生長率和魚肉硬度、堅韌性,CAST基因在肌肉中的表達可影響其肉質(zhì)硬度.本實驗中CAST基因在雜交F1肌肉上的表達量與父本赤眼鱒無顯著差異,但是顯著高于其母本草魚,通過質(zhì)構(gòu)實驗得出,雜交F1的肉質(zhì)變硬,彈性變大,可能也是和CAST基因在肌肉中的表達量提高有關(guān).

    Hatae[17]等人研究表明,魚類肌肉的堅韌性與膠原蛋白的含量密切相關(guān).在大西洋鮭[18]研究表明,肌肉中膠原蛋白含量的增加使肌肉具有較高的機械強度,凝聚性增大.李文倩[19]等的實驗中表明,膠原蛋白含量與質(zhì)構(gòu)參數(shù)均呈正相關(guān),膠原蛋白含量增加能夠改善肌肉質(zhì)構(gòu),較高的肌肉膠原蛋白含量,其肌肉的結(jié)構(gòu)、強度和品質(zhì)也相對較好.本實驗結(jié)果也顯示,COL1A1和COL1A2兩個基因在雜交F1肌肉上的表達量顯著高于在母本草魚肌肉上的表達量,肌肉硬度和彈性也顯著高于母本草魚.

    4 結(jié)論

    綜上所述,雜交F1肌肉彈性大、嫩度高,肉質(zhì)堅韌,這給人們在選擇水產(chǎn)品時提供了一種新的魚蛋白選擇,同時也豐富了魚類種質(zhì)資源.

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    (編輯WJ)

    Comparative Study on Muscle Texture Between the Crossbreed F1Generation from Grass Carp (CtenopharyngodonIdellus) (♀) × Barbel hub (SqualiobarbusCurriculus) (♂) and Their Parents

    LI Di1, LI Wei1, XIAO Tiao-yi1,2*, CHU Wu-ying1,2*, HE Mei-feng1,ZHOUZhi-yu1,JINSheng-zhen1,DENGYa-lin1

    (1. Hunan Engineering Research Center for Utilization of Characteristics of Aquatic Resources,Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China;2. Key Laboratory of Zoology in Hunan Higher Education, Hunan University of Arts and Science, Changde 415000, China)

    Objective:To explore the muscle texture of the crossbreed F1. Method: The female parent grass carp (Ctenopharyngodonidellus) (♀) × Barbel chub (Squaliobarbuscurriculus) (♂) F1(crossbreedF1) as well as their parents at the same specification were used for our research. The texture analyzer, the freezing sectioning technology and hematoxylin-eosin staining method were used for muscle characterization and fiber diameter. In addition, the spatio-temporal expression ofCOL1A1,COL1A2,CASTgenes were identified by RT-PCR. Our results show that hybrid F1muscle fiber diameter is less than that of the female parent grass carp. By using the real-time PCR technology, we found thatCOL1A1,COL1A2andCASTgenes expressions in hybrid F1muscle volume were slightly higher than the expression on grass carp muscle. Results: The muscle tenderness, cohesiveness, springiness and chewiness in crossbreed F1is significantly better than those of grass carp (P<0.05). No significant difference was found for barbell chub. The muscle adhesiveness, gumminess and resilience had no significant difference in hybrid F1, grass carp and barbell chub (P>0.05). The muscle fiber diameter and density of crossbreed F1when compared with grass carp had no significant difference (P>0.05). But they were significantly different when compared with barbell chub (P>0.05). The expression ofCOL1A1,COL1A2,CASTgenes in crossbreed F1was significantly higher than that grass carp (P<0.05), but was no significantly different in comparison with barbell chub (P>0.05).

    grass carp (♀)×barbel chub (♂) crossbreed F1; muscle texture; muscle fiber; COL1A1;COL1A2;CAST

    10.7612/j.issn.1000-2537.2016.03.006

    2015-09-10基金項目:現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項資金(CARS-46)*通訊作者,E-mail:tyxiao1128@163.com;chuwuying18@163.com

    S963.3

    A

    1000-2537(2016)03-0028-06

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