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    抗TNF-α與透明質酸共軛結合對抑制燒傷炎癥反應的效果

    2016-08-31 12:20:00胡強隋爽王國棟姚利民
    中國生化藥物雜志 2016年10期
    關鍵詞:共軛生理鹽水細胞因子

    胡強,隋爽,王國棟,姚利民

    (山東省煙臺市解放軍第107醫(yī)院 燒傷整形科,山東 煙臺 264000)

    抗TNF-α與透明質酸共軛結合對抑制燒傷炎癥反應的效果

    胡強,隋爽,王國棟,姚利民

    (山東省煙臺市解放軍第107醫(yī)院 燒傷整形科,山東 煙臺 264000)

    目的制備抗TNF-α與透明質酸(hyaluronic acid,HA)軛合物,研究其對燒傷炎癥反應的抑制效果。方法制備了抗TNF-α 抗體與HA共軛結合物,并將其燒傷抗炎效果與生理鹽水、HA、抗TNF-α 抗體以及HΑ與抗TNF-α非共軛混合物進行比較研究。結果該軛合物會減少無法存活的組織,并使巨噬細胞CD68減少,IL-1β濃度降顯著降低。結論研究結果表明,與直接運用非共軛抗體比較,抗TNF-α與高分子量 HΑ共軛結合應用能更持久的局部調節(jié)損傷后炎癥反應。

    TNF-α;傷口愈合;透明質酸;燒傷創(chuàng)面;炎癥

    研究證明促炎癥細胞因子的單克隆抗體與高分子量透明質酸(hyaluronic acid,HΑ)結合能保存抗體結合親和力,并使炎癥反應水平下調[1-2]。這種共軛結合會延緩細胞外環(huán)境中細胞因子的擴散,通過減緩信號級聯(lián)反應來調節(jié)炎癥反應的強度。燒傷可產生的強烈炎癥反應,并引起繼發(fā)性組織壞死。這種繼發(fā)性壞死的原因可能與炎癥介導機制有關[3],會使燒傷的深度和面積不斷加重,因此燒傷是這種軛合物的一種潛在臨床應用。

    急性炎癥的特征是促炎癥細胞因子增多,在傷口微環(huán)境中具有噬菌作用的巨噬細胞和單核細胞增多,以及血管的擴張能力和滲透性增加。在急性炎癥過程中,細胞因子能激活吞噬死亡細胞、殘骸的巨噬細胞和單核細胞,并阻止微生物的侵襲,腫瘤壞死因子-α(TNF-α)就是由上述這些活化的巨噬細胞釋放,并在該環(huán)境中一直保持激活狀態(tài)的調節(jié)因子[4]。TNF-α是一種炎癥反應的上游調節(jié)因子,具有多種生理作用,在燒傷創(chuàng)面組織和傷口液體中表達水平很高[5],因此TNF-α是燒傷創(chuàng)面中造成組織破壞的關鍵因子。TNF-α 能導致血管擴張,并增強中性粒細胞與內皮細胞的粘附性,可幫助液體轉移和具有噬菌作用的白細胞到達損傷部位。TNF-α也能與中性粒細胞相互作用從而加強組織破壞程度,中性粒細胞通過與內皮細胞粘附來抑制液體從血液流向組織,TNF-α會使中性粒細胞壽命延長,導致活性氧的釋放,從而造成血管破壞,促進液體從血液流向組織。TNF-α水平的升高還會引發(fā)角質細胞壞死,使愈合過程停止。許多研究發(fā)現(xiàn)[6-8],燒傷后的血清中TNF-α 水平并沒有明顯上升,但是在局部燒傷皮膚中,其水平顯著升高。因此,局部控制性調節(jié)TNF-α 信號可能會改善創(chuàng)面愈合結果。

    作為表皮下葡萄糖胺聚糖的主要成分,HΑ具有良好的生物相容性和生物活性,已被廣泛應用于傷口敷料、皮膚替代產品以及其它再生醫(yī)學應用品中[9]。高分子量HΑ具有多種功能,不僅能夠促進成纖維細胞的遷移、增殖和細胞因子生成,還具有免疫抑制作用和清除自由基的作用。本研究旨在通過制備抗TNF-α 抗體與HA共軛結合物,并將其燒傷抗炎效果與生理鹽水、HA、抗TNF-α 抗體以及HΑ與抗TNF-α非共軛混合物進行了比較,以進一步闡明局部抗體療法的效果。

    1 材料與方法

    1.1 材料 HΑ(MW= 1.6 MDα)和 4-二甲氨基吡啶(Sigmα-Αldrich;St.Louis, MO);羥基硫代琥珀酰亞胺(sulfo-NHS)和N-(3-二甲基氨基丙基)-N’-乙基碳酰胺(EDC)(Pierce;Rockford, IL);抗rTNF-α 純化的鼠單克隆 IgG(R&D Systems;Minneαpolis,MN);CD68檢測試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司);光學顯微鏡(BX51,奧林巴斯中國有限公司);酶標儀(Multiskan FC 賽默飛);T-PER組織總蛋白抽提試劑購自美國賽默飛公司,大鼠IL-1β ELISA試劑盒購自上海西唐生物科技有限公司,所有試劑均按照使用說明保存和使用。

    1.2 方法

    1.2.1 單克隆抗體和HΑ結合[10]:HA(12 mg,7.5 nmol)分散于1 mL 緩沖液中(pH 7.4),然后加入EDC(240 μg,1.55 mol), sulfo-NHS (650 μg,3.00 μmol)和DMAP(10 μg)。室溫反應過夜,抗rTNF-α (1 mg,6.66 nmol)溶解于200 uL PBS中然后加入上述HA活化溶液,4 ℃下反應過夜。產物經過PBS透析24 h,在4 ℃下PBS洗滌4遍。最終得到的產物由約1%(w/v) HΑ 溶液組成。為了使結合物獲得更大的粘度以及更適合在開放創(chuàng)面應用,將3份共軛產物與4份8% HΑ溶液混合,得到含5%HΑ的共軛溶液,最終抗rTNF-α抗體的濃度約為400 μg/mL。見圖1。

    圖1 共軛結合原理圖(EDC活化HΑ,與抗體上的胺基形成酰胺鍵)Fig.1 Schematic of conjugation( HA was activated with EDC to form amide bond with an amine group on the antibody)

    1.2.2 大鼠深Ⅱ度燒傷模型:用焊接工具作為可控熱源,并對其烙鐵進行改進,使其尖端有一直徑17 mm、厚度2.5 mm、重量500 g的銅盤。銅盤非接觸的一邊與熱耦合器連接,以監(jiān)測銅盤的實際溫度。用20只剃毛的Wistar成年大鼠(山東省天然藥物工程技術研究中心實驗動物中心提供,動物合格證:魯動質字201507008號)(體質量200 g左右)后背部制造燒傷模型[11],隨機分為5組,每組4只。銅盤加熱到85 ℃,然后穩(wěn)定2 min,將其置于大鼠皮膚上10 s,在每只大鼠身上制造一個燒傷部位。第2天用手術剪刀切除焦痂,并盡可能使切口靠近焦痂邊緣。5個實驗組分別為:生理鹽水處理組、HA組、只運用抗TNF-α處理組、抗TNF-α與HΑ混合(抗TNF-α+ HΑ)處理組以及(抗TNF-α)-HΑ絡合物處理組。將大鼠隨機分配到不同的治療組和時間點(見圖2),規(guī)定去除焦痂的日期為第0天,并在同一天進行第1次處理。傷口用TegαdermTM覆蓋,并用氰基丙烯酸酯密封。分別在第0、2和4天進行干預,并在第7天實驗結束時將大鼠處死,用剪刀剪下燒傷灶周圍的組織。用10%甲醛浸泡組織以方便組織學分析或迅速冰凍以進行下一步的蛋白提取。

    圖2 燒傷實驗的時間軸有3個時間點, n=4 只大鼠,在第 1、4、7天接受了第1、2、3次處理Fig.2 Timeline of burn testThere were three times, n=4, rats were accept three treatments in the first, fourth, seventh days

    1.2.3 組織學染色[12]:將燒傷部位的樣本置于載玻片上,用石蠟包埋,然后用二甲苯脫蠟,接著以不同濃度的酒精處理(70%~100%),運用曼森氏三色染色進行形態(tài)學評估。然后運用與脫蠟程序相反的步驟,使切片脫水,最后蓋玻片密封。

    1.2.4 CD68細胞染色:取燒傷部位的15個樣本首先進行脫蠟,用95 ℃~100 ℃檸檬酸抗原修復緩沖液浸泡切片20 min,之后冷卻到60 ℃。分別用TRIS-緩沖鹽水-Tween 20和PBS沖洗切片各2次。按檢測試劑盒操作,一抗為小鼠抗大鼠CD68,二抗為生物素化的馬抗-鼠IgG,4%二氨基聯(lián)苯胺染色,并用哈里斯蘇木精復染。利用顯微鏡分析免疫組化染色圖像,目測進行CD68陽性細胞計數(shù)。

    1.2.5 IL-1β 濃度測定:取切碎的快速冰凍組織0.1 g,加入到600 μL T-PER組織蛋白提取液中混勻,10000轉/分離心5 min,取上清液-80 ℃保存。按IL-1β ELISA試劑盒操作,分別設空白孔、標準孔、待測樣品孔??瞻卓准訕悠废♂屢?00 μL,余孔分別加標準品或待測樣品100 μL,將樣品加于酶標板孔底部,37 ℃反應120 min。棄去液體,每孔加生物素標記抗體工作液 100 μL,37 ℃反應60 min。棄去孔內液體,洗板3次。每孔加辣根過氧化物酶標記親和素工作液100 μL,37 ℃反應60 min。棄去孔內液體,洗板5次,依序每孔加底物溶液90 μL,37 ℃避光顯色30 min。依序每孔加終止溶液50 μl,終止反應。使用酶標儀分析450 nm 時的吸光度,計算IL-1β濃度。

    1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理,利用ANOVA法來分析結果的顯著性,IL-1β濃度經過了對數(shù)轉換后分析,以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

    2 結果

    2.1 組織學定性評估 曼森氏三色染色定性展現(xiàn)了傷口的大體表現(xiàn),第4天時,所有大鼠完好的皮膚和焦痂之下均發(fā)現(xiàn)有新形成的肉芽組織。但是在軛合物處理的傷口中,肉芽組織更牢固,表明軛合物處理組愈合反應發(fā)生較早。見圖3。

    圖3 燒傷邊緣的曼森氏三色染色圖像焦痂去除后4 d,在真皮深處開始出現(xiàn)肉芽組織,(抗TNF-α)-HΑ處理部位的肉芽組織最多。HΑ、抗TNF-α和抗TNF-α+ HΑ處理組肉芽組織形成緩慢,生理鹽水處理組肉芽組織的形成最緩慢。第4天時,大多數(shù)創(chuàng)面觀察到新生成的焦痂(#);第7天時,生理鹽水和抗TNF-α處理的燒傷部位出現(xiàn)明顯壞死。(抗TNF-α)-HΑ處理部位第7天時,毗組織(*)最健康。比例尺=1 mmFig.3 Msson’s trichrome images of burn edgesGranulation tissue started to appear 4 days after eschar removal in the deep dermal region,with the most robust granulation tissue in the(anti-TNF-a)-HA treated sites.HA, anti-TNF-a, and anti-TNF-a 1 HA treatments shows slower granulation tissue formation, while saline treated wound sites display the slowest granulation tissue formation.On day 4, newly forming eschar(#)is observed in most of the wound sites, and on day 7, necrosis has grown significantly particularly in saline and anti-TNF-a treated burn sites.Adjacent tissue( * ) appears healthiest day 7 in the(anti-TNF-a)-HA treated sites.Bar is 1 mm

    盡管第1天時焦痂已被去除,但在第4天和第7天時,大多數(shù)傷口中均出現(xiàn)新生成的焦痂。生理鹽水和混合抗TNF-α處理組中,該暗紅色層明顯更厚,這有可能是皮膚組織繼發(fā)性壞死的原因。第7天圖像顯示,生理鹽水和抗TNF-α 處理組中暗紅色層會顯著增厚,該現(xiàn)象在軛合物處理組中表現(xiàn)不明顯。

    第7天時軛合物處理組與其他組比較,毗鄰傷口的有活性組織似乎最健康,保持了表皮和真皮結構。軛合物處理組中該區(qū)域的毛囊是完好的,然而在其它組中是受損的,尤其是在生理鹽水對照組。生理鹽水處理組焦痂去除后1天,毗鄰傷口的組織中,血管發(fā)生擴張, 但相比較而言,抗TNF-α、抗TNF-α+HΑ混合組和軛合物處理組的血管擴張不明顯??筎NF-α和軛合物處理組第7天時目測觀察血管擴張的程度比生理鹽水處理組第1天小。

    2.2 巨噬細胞浸潤 利用CD68免疫組化染色來評估創(chuàng)面以及深達200~500 μm的健康和受損組織連接處在燒傷后不同時間點活化巨噬細胞的總數(shù)目。選取3個放大40×倍的顯微鏡視野,進行CD68陽性細胞計數(shù),計算CD68陽性細胞在細胞中的百分率,最后進行平均,結果如圖4、表1所示??筎NF-α或(抗TNF-α)-HΑ軛合物處理組與生理鹽水處理組相比,巨噬細胞計數(shù)顯著減少(第1天時,P<0.001;第4天時,P<0.05;第7天時,P<0.001);抗TNF-α +HΑ混合處理組的巨噬細胞計數(shù)也顯著減少(第4天時,P<0.05;第7天時,P<0.001)。(抗TNF-α)-HΑ軛合物或抗TNF-α+HΑ混合處理與生理鹽水比較,第7天時會使巨噬細胞明顯減少約20%??筎NF-α 處理第4天和第7天時,巨噬細胞數(shù)目減少最明顯,與生理鹽水處理比較減少約40%,與(抗TNF-α)-HΑ處理比較減少約20%。在巨噬細胞浸潤減少方面,非共軛抗TNF-α處理效果最明顯,而(抗TNF-α)-HΑ軛合物和抗TNF-α + HΑ混合處理對巨噬細胞浸潤的影響效果相似。

    圖4 巨噬細胞浸潤百分比第1天時,巨噬細胞計數(shù)受到(抗TNF-α)-HΑ的影響最大,受到抗TNF-α影響較小。第4天和第7天時,抗TNF-α處理使巨噬細胞計數(shù)減少最明顯。第7天時,(抗TNF-α)-HΑ 處理會使巨噬細胞計數(shù)輕度減少,與生理鹽水對照組比較仍具有顯著差異*P<0.001,*P<0.05,與生理鹽水組比較Fig.4 Macrophage infiltration countsOn day 1, macrophage count appears to be most affected by(anti-TNF-a)-HA, and slightly by anti-TNF-a treatment.Anti-TNF-a treatments appeared to decrease macrophage counts the most by days 4 and 7.(Anti-TNF-a)-HA treatment attenuated slightly by day 7, but was still significantly decreased compared to saline control*P<0.001, *P<0.05,compared with saline group

    表1 巨噬細胞浸潤百分比Tab.1 Macrophage infiltration counts

    2.4 IL-1β 濃度 選取細胞因子IL-1β作為整體炎癥微環(huán)境的標志物的原因是它參與了炎癥反應,并且與燒傷后1-3h活化TNF-α的水平有關[13-14]。正如圖5、表2所示,與生理鹽水比較,抗TNF-α處理第1天時,IL-1β濃度減少最明顯。非共軛抗TNF-α 早期效果明顯,但隨著時間推移其效果下降,第7天時,抗TNF-α處理和生理鹽水對照組相似。第4天時和第7天時,與生理鹽水比較,(抗TNF-α)-HΑ 處理后IL-1β濃度顯著下降(第4、7天時,P<0.05)。

    圖5 燒傷組織中IL-1β的濃度生理鹽水和(抗TNF-α)-HΑ 處理組中, IL-1b 濃度在第1天時達到高峰,第4天時降低;但整個實驗階段,IL-1β濃度仍顯著低于生理鹽水處理組(*P<0.01第4天時,*P<0.05第7天時)。抗TNF-α 處理與生理鹽水和(抗TNF-α)-HΑ處理的效應相反,第1天時能抑制 IL-1β濃度,但隨后在第4天和第7天時效應減弱Fig.5 IL-1b concentration in extracted burn tissue IL-1b concen-tration peaks at day 1, and attenuates on day 4 in saline and(antiTNF-a)-HA treated wound sites, however, IL-1b levels are significantly lower than those in saline treated sites throughout the experimental period( *P<0.01 day 4, and *P<0.05 day 7).Anti-TNF-a treatment exhibited the opposite response to saline and(anti-TNF-a)-HA, inhibiting IL-1b day 1 compared to saline, but then steadily loses effect by days 4 and 7

    表2 燒傷組織中IL-1β的濃度Tab.2 Concentration of IL-1β in burn tissues

    3 討論

    由于急性炎癥反應與燒傷愈合過程有關,所以調節(jié)炎癥是改善燒傷預后的一個有效策略,但與對燒傷患者全身性抗炎癥藥物給藥有一定的風險,最有效安全的方式是局部療法。抗體結合到生物聚合物會通過兩種途徑使效果增加:一是將抗體置于傷口中的時間延長,而不擴散進入血流中,二是阻斷抗體的Fc區(qū),后者對于抑制 TNF-α來說非常重要[15-17]。

    抗TNF-α與高分子量HΑ共軛后,抗TNF-α 的滯留時間會顯著延長。(抗TNF-α)-HΑ滯留時間的延長會顯著減少繼發(fā)性壞死,這是IL-1β濃度下降和巨噬細胞CD68減少的共同結果。(抗TNF-α)-HΑ比只運用抗TNF-α 或抗TNF-α+ HΑ更有效,只運用抗TNF-α 或抗TNF-α+ HΑ處理會使巨噬細胞CD68計數(shù)減少,但不能顯著減少無法存活的組織或IL-1β濃度,并且抗TNF-α和抗TNF-α + HΑ 處理組中無法存活的組織的量明顯多于(抗TNF-α)-HΑ 處理組。實驗結果表明,HΑ與抗TNF-α 共軛結合物與抗TNF-α、HΑ或抗TNF-α+HΑ混合處理相比,會減少無法存活的組織以及降低相關的炎癥指標。

    綜上所述,與直接運用非共軛抗體比較,抗TNF-α與高分子量 HΑ共軛結合應用能更持久的局部調節(jié)損傷后炎癥反應,這對臨床上燒傷治療有一定的指導意義。但是抗體與 HA 結合能抑制炎癥反應和燒傷進展的機制目前還不清楚,未來還需要進一步的研究,還可以比較抗體和具有不同的生物學惰性或活性的多糖結合的效果。

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    (編校:吳茜)

    StudyontheinhibitoryeffectofantiTNF-alphaandhyaluronicacidconjugateontheinflammatoryresponseinburn

    HU Qiang, SUI Shuang, WANG Guo-dong, YAO Li-min
    (The Burn and Plastic Surgery Department, Shandong Yantai the People’s Liberation Army 107 Hospital, Yantai 264000, China)

    ObjectiveTo study the inhibitory effect of anti TNF- alpha and hyaluronic acid(HA) conjugate on the inflammatory response in burn.MethodsAnti TNF alpha antibody was prepared with HA conjugate, and compared the anti-inflammatory effects with HA, anti-TNF-α antibody and HΑ with anti-TNF-α unconjugated mixture.ResultsThe conjugate can reduce the survival of the tissues, reduced the CD68 of macrophages and decreased the IL-1β concentration.ConclusionThe results indicate that, compared with direct use of Non-conjugated antibody, the application of anti-TNF-α conjugated to high molecular weight HΑ can adjust the inflammatory response after injury more lasting.

    TNF-α; wound healing; hyaluronic acid; burn wound; inflammation

    10.3969/j.issn.1005-1678.2016.10.009

    胡強,男,博士,主治醫(yī)師,研究方向:燒傷整形,E-mail:3285315279@qq.com。

    R644

    A

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