尿路感染大腸埃希菌耐藥和基因型的流行病學(xué)分析

徐志剛，高　宇，陳秋媛，姜笑笑，李雪梅

(1.重慶市紅十字會醫(yī)院江北區(qū)人民醫(yī)院，重慶 400020；2.第三軍醫(yī)大學(xué)附屬西南醫(yī)院，重慶 400038)

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尿路感染大腸埃希菌耐藥和基因型的流行病學(xué)分析

徐志剛1，高宇2，陳秋媛2，姜笑笑2，李雪梅2

(1.重慶市紅十字會醫(yī)院江北區(qū)人民醫(yī)院，重慶 400020；2.第三軍醫(yī)大學(xué)附屬西南醫(yī)院，重慶 400038)

目的探討尿路感染大腸埃希菌的耐藥性及基因型，為抗感染治療提供理論依據(jù)。方法收集56株尿路感染大腸埃希菌，采用多位點序列分型方法對細(xì)菌進(jìn)行基因分型，采用瓊脂平板倍比稀釋法檢測細(xì)菌的最低抑菌濃度，雙紙片協(xié)同法檢測超廣譜β-內(nèi)酰胺酶，采用PCR擴(kuò)增ESBLs基因。結(jié)果56株大腸埃希菌共分為21個基因型，其中ST405基因型最多占30.4%(17株)，其次為ST301基因型。56株大腸埃希菌除對碳青霉烯類、阿米卡星敏感性較高外，對其他抗菌藥物均具有較高的耐藥性。ST405型菌株對青霉素類藥物的耐藥率顯著高于其他分型菌株(P<0.05)。大腸埃希菌ESBLs檢出率為51.8%。PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示CTX-M和OXA的陽性率分別為48.2%和19.6%，未擴(kuò)增出其他耐藥基因。結(jié)論尿路感染大腸埃希菌中對大多數(shù)抗菌藥物具有較高的耐藥性，ST405是最多的基因型。

大腸埃希菌；尿路感染；耐藥；基因型；多位點序列分型

尿路感染是最常見的醫(yī)院感染之一，而大腸埃希菌是尿路感染的最常見病原菌[1]，近年來隨著抗菌藥物的廣泛應(yīng)用，其耐藥性也呈增高趨勢[2]，給臨床治療帶來了很大困難。分析醫(yī)院尿路感染大腸埃希菌的基因分型及耐藥性則有益于分析感染細(xì)菌的來源，對于感染控制方案的制訂和抗菌藥物的合理使用都具有重要的臨床意義和價值，而目前國內(nèi)研究多集中在細(xì)菌的耐藥性方面，很少關(guān)注細(xì)菌的基因分型[3-4]。因此，本研究以臨床尿液分離的大腸埃希菌為研究對象，通過多位點序列分型(multilocus sequence typing, MLST)方法對大腸埃希菌進(jìn)行基因分型，并分析尿路感染大腸埃希菌的感染特征及耐藥性，以期為尿路感染的治療提供有力的數(shù)據(jù)支持。

1　研究資料

1.1材料

1.1.1菌株來源及鑒定實驗所用56株大腸埃希菌均來源于第三軍醫(yī)大學(xué)附屬西南醫(yī)院泌尿外科2012年1月—2013年6月患者的尿液標(biāo)本，標(biāo)本收集均在入院48 h，且患者入院前無尿路感染癥狀。所有菌株均采用梅里埃VITEK2全自動細(xì)菌鑒定儀(生物梅里埃公司)進(jìn)行鑒定。質(zhì)控菌株大腸埃希菌ATCC 25922和肺炎克雷伯菌ATCC 700603由第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院藥劑科提供。

1.1.2試劑及設(shè)備氨曲南、氨芐西林、哌拉西林、頭孢他啶、頭孢哌酮、頭孢吡肟、阿米卡星、亞胺培南、美羅培南、慶大霉素、妥布霉素、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星和復(fù)方新諾明購自中國食品藥品檢定研究院；頭孢他啶、頭孢他啶/克拉維酸、頭孢噻肟、頭孢噻肟/克拉維酸紙片購自英國Oxoid公司；MH培養(yǎng)基購自北京陸橋生物技術(shù)有限公司；胰蛋白胨、酵母提取物購自英國Oxoid公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒和瓊脂糖購自Promega公司；引物由Invitrogen公司合成；2×Es Taq MasterMix購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。多點接種儀購自日本佐久間公司；PCR擴(kuò)增儀、電泳儀和凝膠成像系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司。

1.2方法

1.2.1大腸埃希菌MLST分析采用MLST(包括adk, fumC, gyrB, icd, mdh, purA 和recA 7對管家基因)對大腸埃希菌進(jìn)行基因分型[5]。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，54～60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。反應(yīng)產(chǎn)物以1%瓊脂糖凝膠電泳，然后回收純化并測序。測序結(jié)果與PubMLST database(http://mlst.warwick.ac.uk/mlst/dbs/Ecoli)進(jìn)行比對，確定其等位基因譜型及菌株序列型(Sequence type，ST)。

1.2.2大腸埃希菌最低抑菌濃度(MIC)檢測采用標(biāo)準(zhǔn)瓊脂平板倍比稀釋法測定細(xì)菌MIC。大腸埃希菌劃線接種于M-H瓊脂平板，37 ℃培養(yǎng)過夜。挑取細(xì)菌菌落于滅菌生理鹽水稀釋比濁至0.5麥?zhǔn)蠁挝?約108 CFU/mL)，然后以多點接種儀將1～2 μL菌液接種至含藥物的M-H瓊脂平板，37 ℃孵育18 h。以能夠完全抑制細(xì)菌生長的最低藥物濃度作為MIC。結(jié)果判讀參照美國國家臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)委員會(CLSI，2010)標(biāo)準(zhǔn)。大腸埃希菌ATCC25922作為質(zhì)控菌株。

1.2.3超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)檢測采用雙紙片協(xié)同法檢測。將大腸埃希菌過夜培養(yǎng)物比濁至0.5麥?zhǔn)蠁挝?，以無菌棉簽將菌液均勻涂布于M-H平板，然后將藥敏紙片(頭孢他啶、頭孢他啶/克拉維酸、頭孢噻肟、頭孢噻肟/克拉維酸)平貼于培養(yǎng)基表面，37 ℃孵育16～18 h進(jìn)行結(jié)果判讀。頭孢他啶抑菌環(huán)≤22 mm或頭孢噻肟抑菌環(huán)≤27 mm為可疑ESBLs菌株；頭孢他啶/克拉維酸抑菌環(huán)≥5 mm或頭孢噻肟/克拉維酸抑菌環(huán)≥5 mm可確認(rèn)為ESBLs陽性菌株。同時以肺炎克雷伯菌ATCC 700603和大腸埃希菌ATCC 25922作為陽性和陰性對照。

1.2.4常見ESBLs耐藥基因的PCR分析常見ESBLs耐藥基因引物序列見表1[6-7]?；蚪MDNA的提取按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒操作說明進(jìn)行。PCR反應(yīng)體系(20 μL)：2×Es Taq MasterMix 10 μL，引物各0.3 μL，DNA 0.4 μL，ddH2O 9 μL。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃，5 min；94 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35個循環(huán)；末次循環(huán)后于72 ℃延伸10 min。反應(yīng)產(chǎn)物以1%瓊脂糖凝膠(含EB 0.5 μg/mL)電泳，采用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法ST405型菌株和非ST405型菌株的耐藥差異性比較采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1　大腸埃希菌常見ESBLs耐藥基因引物序列

2　結(jié)　　果

2.1大腸埃希菌MLST分析MLST分析顯示56株大腸埃希菌分為21個分型，其中ST405最高，其余基因型均小于5株。見表2。

表2　大腸埃希菌MLST分析　株

2.2大腸埃希菌MIC檢測結(jié)果大腸埃希菌除對碳青霉烯類、阿米卡星敏感率較高外，對其他抗菌藥物均具有較高的耐藥性。此外，ST405型菌株對青霉素類藥物的耐藥率均顯著高于其他分型菌株(P均<0.05)。見表3。

2.3大腸埃希菌ESBLs及耐藥基因檢測結(jié)果大腸埃希菌ESBLs檢出率為51.8%(29/56)。ESBLs耐藥基因結(jié)果顯示CTX-M 和OXA的陽性率分別為48.2%(27/56)和19.6%(11/56)，且攜帶OXA的菌株均攜帶CTX-M(11/56)。未擴(kuò)增出其他耐藥基因。

表3　大腸埃希菌對常見抗菌藥物的耐藥情況　株(%)

注：①與非ST405型菌株比較，P<0.05。

3　討　　論

大腸埃希菌是人體腸道微生物群的重要成員，屬于革蘭陰性菌，為兼性厭氧菌，也是泌尿系統(tǒng)感染的常見致病菌。大腸埃希菌也是產(chǎn)ESBLs主要代表菌之一，其產(chǎn)酶率達(dá)到很高的水平且呈不斷上升的趨勢，應(yīng)引起醫(yī)生的足夠重視。本研究結(jié)果顯示，大腸埃希菌是第三軍醫(yī)大學(xué)附屬西南醫(yī)院泌尿外科尿路感染的最常見病原菌，與大部分研究報道結(jié)果相同[8-9]；而細(xì)菌耐藥結(jié)果顯示大腸埃希菌除對碳青霉烯類抗菌藥物全部敏感外，對喹諾酮類和β-內(nèi)酰胺酶類具有較高的耐藥性。本研究中大腸埃希菌ESBLs陽性率和耐藥率與文獻(xiàn)[9-10]研究報道相比處于較高水平，其原因可能是由于西南醫(yī)院是重慶最大的醫(yī)院之一，危重患者較多，抗菌藥物的使用頻率較高，多數(shù)轉(zhuǎn)院患者在入院前已經(jīng)使用抗菌藥物治療。另外流行的ESBLs主要是CTX和OXA型，未發(fā)現(xiàn)其他的ESBLs耐藥基因，其中CTX基因所占比例最高，為48.2%，與國內(nèi)報道相似[11]，但OXA型的攜帶比例高于文獻(xiàn)[12]報道。

MLST由Maiden等[13]于1998年首次運(yùn)用于腦膜炎奈瑟菌的分型，后廣泛應(yīng)用于其他細(xì)菌、真菌。它是一種基于核酸序列測定的細(xì)菌分型方法，結(jié)合生物信息學(xué)和基因序列測定的方法，通過PCR法擴(kuò)增多個(6～8個)管家基因內(nèi)部片段，通過對其序列的測定，來分析菌株的變異及遺傳相關(guān)性。該方法在流行病的監(jiān)測及細(xì)菌分型、進(jìn)化等方面的研究具有分辨率高的特點，簡便可行、高效可靠，被廣泛應(yīng)用。本研究中MLST結(jié)果顯示ST405是最多的基因分型，有17株，且所有攜帶OXA耐藥基因的菌株均為ST405，攜帶OXA耐藥基因ST405的流行可能是西南醫(yī)院OXA耐藥基因攜帶比例高的主要原因。

綜上所述，針對泌尿外科患者，應(yīng)該制定更為嚴(yán)格的細(xì)菌感染控制方案；對尿路感染患者，應(yīng)根據(jù)藥敏實驗結(jié)果選擇抗菌藥物，針對經(jīng)驗診療者應(yīng)根據(jù)患者前期抗菌藥物使用情況、患者的基本情況等作出綜合判斷，合理使用抗菌藥物；后續(xù)應(yīng)該建立更為完善的細(xì)菌耐藥分析計劃，以期為臨床治療提供更充分的證據(jù)。

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Epidemiology of drug resistance and genotype of Escherichia coli in urinary tract infection

XU Zhigang1, GAO Yu2, CHEN Qiuyuan2, JIANG Xiaoxiao2, LI Xuemei2

(1.Chongqing Red Cross Hospital, Chongqing 400020, China; 2.Southwest Hospital of The Third Military Medical University, Chongqing 400038, China)

Objective It is to investigate the resistance and genotypes of Escherichia coli (E.coli) from urinary tract infections, and provide the theoretical support for the anti-infective treatment.Methods 56 cases of E.coli form urinary tract infections were selected.The minimal inhibitory concentration of E.coli was detected using the agar double dilution method.Extended-spectrum β-lactamases (ESBLs) were detected by double-disk synergy method.The ESBLs genes were detected by PCR amplification.The genotypes of E.coli were determined using multilocus sequence typing.Results A total of 56 strains of E.coli were more sensitive to carbapenems and amikacin, whereas they were highly resistant to the other antimicrobial agents.The resistance rate of ST405 typed strains to penicillin was significantly higher than that of other typed strains (P<0.05).The ESBL-producing E.coli strains accounted for 51.8%.PCR amplification showed that the positive rates of CTX-M and OXA genes were 48.2% and 19.6%, and no other resistance genes were detected.MLST results showed that 56 isolated strains had 21 gene types.The ST405 was the most common genotype accounting for 30.4% (17), followed by the ST301.Conclusion E.coli isolates from urinary tract infections posses high resistance to most antibiotics.ST405 is the most common genotype.

Escherichia coli; urinary tract infections; resistance; genotypes; multilocus sequence typing

徐志剛，男，博士，主治醫(yī)師，主要研究方向為腫瘤分子遺傳學(xué)。

10.3969/j.issn.1008-8849.2016.24.007

R-33

A

1008-8849(2016)24-2642-03

2015-09-01