奶粉中陰溝腸桿菌實(shí)時(shí)熒光PCR快速檢測(cè)方法建立

周慧平　　唐連飛　　蔡文杰　　譚建錫　　朱中武　　禹思宇*

（1.湖南出入境檢驗(yàn)檢疫局　　湖南長(zhǎng)沙　410004；2.湖南省畜牧獸醫(yī)研究所）

奶粉中陰溝腸桿菌實(shí)時(shí)熒光PCR快速檢測(cè)方法建立

周慧平1唐連飛1蔡文杰2譚建錫1朱中武1禹思宇1*

（1.湖南出入境檢驗(yàn)檢疫局湖南長(zhǎng)沙410004；2.湖南省畜牧獸醫(yī)研究所）

為建立快速有效的陰溝腸桿菌檢測(cè)方法，根據(jù)Genbank中的陰溝腸桿菌Amp C酶基因序列設(shè)計(jì)引物和探針，建立了奶粉中陰溝腸桿菌實(shí)時(shí)熒光PCR快速檢測(cè)方法。結(jié)果顯示，該方法只對(duì)陰溝腸桿菌Amp C酶基因呈陽(yáng)性反應(yīng)，而對(duì)其他常見非陽(yáng)性菌株基因組DNA均呈陰性反應(yīng)，檢測(cè)限為20 CFU/mL，對(duì)人工污染的奶粉樣品檢測(cè)驗(yàn)證了方法的實(shí)用性。建立的實(shí)時(shí)熒光PCR方法特異性強(qiáng)，靈敏度高，可以快速、準(zhǔn)確檢測(cè)奶粉中污染的陰溝腸桿菌。

陰溝腸桿菌；AmpC酶；實(shí)時(shí)熒光PCR；檢測(cè)

1　　前言

陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae）屬于腸桿菌科腸桿菌屬，為革蘭氏陰性粗短桿菌，能產(chǎn)生廣譜Amp C酶和β-內(nèi)酰胺酶（ESBLs），是一種條件致病菌，平時(shí)廣泛分布于自然界中，于人和動(dòng)物的腸道中普遍存在，既可引起食源性疾病，又是醫(yī)院內(nèi)感染和機(jī)會(huì)感染的重要致病菌［1］。在抗生素選擇性壓力下，陰溝腸桿菌的耐藥機(jī)制不斷發(fā)展，已產(chǎn)生多重耐藥性，給臨床治療帶來(lái)新的挑戰(zhàn)［2-5］。近年由陰溝腸桿菌引起嬰幼兒腹瀉的發(fā)病率有逐年增高的趨勢(shì)，作為嬰幼兒食源性疾病的致病菌，陰溝腸桿菌已引起廣泛關(guān)注。

食品中尤其是奶粉中陰溝腸桿菌的污染一直受到人們的關(guān)注。即使陰溝腸桿菌在嬰兒奶粉中含量很低，聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織的專家仍認(rèn)為陰溝腸桿菌引起新生兒致病的危險(xiǎn)性越來(lái)越大，是潛在的嬰兒奶粉病原菌。因此專家們?cè)谶M(jìn)行嬰兒配方奶粉中致病菌的風(fēng)險(xiǎn)分析時(shí)，將陰溝腸桿菌列為“B”類危險(xiǎn)性生物因子［6-8］。

目前對(duì)陰溝腸桿菌不論是定量還是定性檢測(cè)［9，10］，都需要經(jīng)過(guò)兩次增菌、分離和培養(yǎng)、純化，生化鑒定等長(zhǎng)達(dá)至少5 d的檢測(cè)周期。這類方法耗時(shí)長(zhǎng)，過(guò)程繁瑣，已無(wú)法滿足當(dāng)今食品安全快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)要求。本研究針對(duì)陰溝腸桿菌 Amp C酶基因設(shè)計(jì)引物和探針，建立了一種快速檢測(cè)陰溝腸桿菌的實(shí)時(shí)熒光PCR方法，其靈敏度高和特異性好，能有效縮短檢測(cè)時(shí)間，為奶粉中陰溝腸桿菌的風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)提供新手段。

2　　材料與方法

2.1材料

2.1.1菌株

試驗(yàn)用菌株來(lái)源見表1。

表1　　試驗(yàn)用菌株來(lái)源

2.1.2試劑

陰溝腸桿菌分離瓊脂 （ECIA）、腸桿菌增菌肉湯、胰化大豆蛋白瓊脂：北京陸橋公司；細(xì)菌基因組小量提取試劑盒、GoTaq Probe qPCR Master Mix熒光PCR試劑盒：購(gòu)自Promega公司；引物及探針：由寶生物（大連）工程有限公司合成。

2.2方法

2.2.1稀釋與計(jì)數(shù)

取陰溝腸桿菌凍干粉接種于增菌肉湯，于37℃振蕩培養(yǎng)22 h，在600 nm波長(zhǎng)下測(cè)定培養(yǎng)液吸光度。當(dāng)吸光度達(dá)到1.0時(shí)，取1 mL菌液涂胰蛋白大豆瓊脂平板進(jìn)行計(jì)數(shù)（濃度單位為CFU/mL），另取1 mL菌液用作模板DNA的提取。

2.2.2DNA的提取

取陰溝腸桿菌培養(yǎng)物，按細(xì)菌基因組小量提取試劑盒說(shuō)明書方法進(jìn)行DNA提取。

2.2.3引物設(shè)計(jì)

以耐藥基因AmpC為檢測(cè)靶基因，在GenBank中查找不同陰溝腸桿菌AmpC基因序列，經(jīng)多序列同源性分析后找出保守區(qū)段，并以此保守區(qū)段設(shè)計(jì)引物和探針序列，用Blastn進(jìn)行同源性匹配分析后確定引物和探針。上下游引物序列分別為：5’-TCAGCTGTTTGTCCGGGTTT-3’和3’-ATCATC CA G CTGCG CGAATA-5’；探針序列為：5’-FAMCAC CGA CGG CGA GAC CGA CTTT-TAMRA-3’

2.2.4反應(yīng)體系和反應(yīng)條件

反應(yīng)體系（共 25 μL）：GoTaq Probe qPCR Master Mix（2×）12.5 μL；上下游引物（10mM）各1 μL；探針（10mM）1 μL；DNA 2 μL；ddH2O 5 μL。反應(yīng)條件：95℃ 2 min；95℃變性 3 s，65℃30 s，同時(shí)收集FAM熒光，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。

2.2.5特異性和靈敏度實(shí)驗(yàn)

取標(biāo)準(zhǔn)菌株陰溝腸桿菌和大腸桿菌、嗜水氣單胞菌、金黃色葡萄球菌、阪崎腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌、福氏志賀氏菌、奇異變形桿菌、普通變形桿菌、幽門螺桿菌，制備DNA模板分別進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增，確定檢測(cè)方法的特異性；取添加陰溝腸桿菌奶粉樣品的增菌培養(yǎng)液，平板計(jì)數(shù)法測(cè)定結(jié)果為：陰溝腸桿菌（2×108CFU/mL），作10倍梯度稀釋（菌液濃度為2×108-2），取1 mL提取DNA，再取每個(gè)稀釋度的DNA 2 μL進(jìn)行熒光PCR檢測(cè)。

2.2.6樣品的檢測(cè)

參考呂敬章的方法［9］，分別無(wú)菌稱取未污染陰溝腸桿菌的嬰兒配方奶粉200 g，溶于預(yù)熱到45℃的1800mL滅菌蒸餾水中。以ATCC 23355陰溝腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株為試驗(yàn)菌株，制成菌濃度為105CFU/mL的純菌液，取20 μL分別加入到已溶解的奶粉中充分混勻，制成試驗(yàn)原樣。照同樣方法制作未污染陰溝腸桿菌的全脂奶粉、脫脂奶粉及嬰兒水解奶粉的試驗(yàn)原樣。各取50 mL的試驗(yàn)原樣，每份試驗(yàn)原樣加入等體積預(yù)熱到45℃的滅菌蒸餾水，振搖使樣品充分混勻，36℃±1℃培養(yǎng)18-22 h。應(yīng)用上述建立的陰溝腸桿菌實(shí)時(shí)熒光PCR法檢測(cè)未添加和添加陰溝腸桿菌陽(yáng)性菌株奶粉樣品：嬰兒配方奶粉、全脂奶粉、脫脂奶粉、嬰兒水解奶粉，以評(píng)價(jià)該方法的實(shí)用性。

3　　結(jié)果

3.1實(shí)時(shí)熒光PCR特異性檢測(cè)結(jié)果

以陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)菌株陰溝腸桿菌和非陽(yáng)性菌株 （大腸桿菌、嗜水氣單胞菌、金黃色葡萄球菌、阪崎腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌、福氏志賀菌、奇異變形桿菌、普通變形桿菌、幽門螺桿菌）制備DNA模板分別進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增，結(jié)果見圖1。

圖1　　實(shí)時(shí)熒光PCR特異性檢測(cè)結(jié)果

圖1顯示，5株陰溝腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株均出現(xiàn)典型的熒光PCR擴(kuò)增曲線，而所有對(duì)照菌株（非陽(yáng)性菌株）均未出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，表明建立的實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系適用于陰溝腸桿菌檢測(cè)，且特異性良好。

3.2實(shí)時(shí)熒光PCR靈敏度試驗(yàn)結(jié)果

取添加陽(yáng)性陰溝腸桿菌樣品增菌培養(yǎng)液1 mL提取DNA，作10倍梯度稀釋，取每個(gè)稀釋度（2 μL）的DNA進(jìn)行熒光PCR檢測(cè)，結(jié)果見圖2。

圖2實(shí)時(shí)熒光PCR敏感性檢測(cè)結(jié)果

圖2顯示，陰溝腸桿菌液在稀釋倍數(shù)為10-7時(shí)仍然能檢測(cè)到FAM熒光信號(hào)，表明陰溝腸桿菌熒光PCR擴(kuò)增體系能檢測(cè)出濃度為20 CFU/mL的陰溝腸桿菌。

3.3樣品檢測(cè)結(jié)果

應(yīng)用上述建立的陰溝腸桿菌實(shí)時(shí)熒光PCR方法檢測(cè)未添加和添加陰溝腸桿菌陽(yáng)性菌株的奶粉樣品，結(jié)果見圖3。

圖3　　人工污染樣品中的熒光PCR檢測(cè)

圖3顯示：未添加陰溝腸桿菌陽(yáng)性菌株的奶粉樣品均未檢測(cè)到陰溝腸桿菌FAM熒光信號(hào)；添加了陰溝腸桿菌陽(yáng)性菌株的奶粉樣品均檢測(cè)到陰溝腸桿菌FAM熒光信號(hào)。說(shuō)明建立的陰溝腸桿菌實(shí)時(shí)熒光PCR方法適用于奶粉樣品的快速檢測(cè)。

4　　討論

盡管人們對(duì)陰溝腸桿菌越來(lái)越重視，但對(duì)其生物學(xué)性狀、毒力、傳播途徑和流行病學(xué)仍然了解甚少。目前對(duì)陰溝腸桿菌的研究主要集中在其耐藥基因、耐藥機(jī)制和臨床分布方面［11-13］，對(duì)陰溝腸桿菌的快速檢測(cè)未見新的研究報(bào)道，實(shí)際工作中往往采用傳統(tǒng)的檢測(cè)方法：增菌培養(yǎng)、分離、用VITEK全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)和API進(jìn)行生化鑒定［14-17］。這些傳統(tǒng)的檢測(cè)方法已經(jīng)不能滿足食品安全快速、準(zhǔn)確檢測(cè)的需求，而熒光PCR技術(shù)作為快速、準(zhǔn)確的診斷手段早已廣泛應(yīng)用于食品中致病微生物的檢測(cè)［18］。

5　　結(jié)論

本研究根據(jù)陰溝腸桿AmpC基因設(shè)計(jì)特異性引物及探針，成功建立了奶粉品中陰溝腸桿菌的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法，并且經(jīng)過(guò)了實(shí)際樣品的檢測(cè)結(jié)果驗(yàn)證，填補(bǔ)了奶粉中陰溝腸桿菌檢測(cè)方法及標(biāo)準(zhǔn)的空白。本方法具有快捷（全過(guò)程約30 h）、靈敏度高（20 CFU/mL）、特異性好的特點(diǎn)，適用于臨床診斷、食品衛(wèi)生監(jiān)督及進(jìn)出口食品中病原微生物檢測(cè)等各個(gè)領(lǐng)域，可以為食品中新的致病菌檢測(cè)提供技術(shù)支持，同時(shí)為食品安全風(fēng)險(xiǎn)預(yù)警提供依據(jù)。

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Rapid Detection of Enterobacter Cloacae in Powdered Milk by Real-Time PCR

ZHOU Huiping1，TANG Lianfei1，CAI Wenjie2，TAN Jianxi1，ZHU Zhongwu1，YU Siyu1*，
（1.Hunan Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Changsha，Hunan，410004；2.Hunan Institute of Animal&Veterinary Sciences）

The specific primers and probe for the real-time PCR according to the Enterobacter cloacae Amp C nucleotide sequence were designed and real-time PCR method was established to detect DNA of Enterobacter cloacae.The results showed that Enterobacter cloacae genes were positive by real-time PCR while other common non-positive strains genomic DNA was negative.Milk powder samples of artificial pollution test the practicality of the method is validated and the detection limit of Enterobacter cloacae were20CFU/mL.Theaboveresults demonstratedthatthemethodcouldbeusedforrapidly and accurately detect the Enterobacter cloacae contamination in powdered milk with high specificity and sensitivity.

Enterobacter Cloacae；Amp C；Real-Time PCR；Detection

TS207.4

E-mail：zhouhp@hnciq.gov.cn；*通訊作者E-mail：ysy2003de1@qq.com

湖南省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2014SK3082）

2015-11-12