蛋雞群沙門氏菌的監(jiān)測

呂殿紅，溫肖會，翟少倫，黃 忠，楊燕秋，周秀蓉，魏文康

(廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物衛(wèi)生研究所/廣東省畜禽疫病防治研究重點實驗室，廣東廣州 510640)

?

蛋雞群沙門氏菌的監(jiān)測

呂殿紅，溫肖會，翟少倫，黃 忠，楊燕秋，周秀蓉，魏文康*

(廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物衛(wèi)生研究所/廣東省畜禽疫病防治研究重點實驗室，廣東廣州 510640)

[目的]了解蛋雞場沙門氏菌的感染情況。[方法]采用沙門氏菌抗原和抗體檢測方法對2012～2015年采集的廣東省蛋雞場樣品進行檢測。采用ELISA方法對1784血清樣品進行了腸炎沙門氏菌和1 387份血清樣品進行了鼠傷寒沙門氏菌抗體檢測；采用凝集試驗方法對1 391份血清樣品進行了雞白痢沙門氏菌抗體檢測；采用細菌培養(yǎng)、PCR方法對采自廣東省的活雞/死雞、環(huán)境拭子等1 458份樣品進行了沙門氏菌檢測。[結(jié)果]腸炎、鼠傷寒、雞白痢3種血清型沙門氏菌抗體的陽性率分別為16.70%、10.09%和1.01%；沙門氏菌抗原檢測的陽性率為1.65%。[結(jié)論]蛋雞群中存在腸炎、鼠傷寒、雞白痢等3種沙門氏菌不同程度的感染，但是蛋雞群的總體感染率不高。

沙門氏菌；感染；抗體；陽性率

沙門氏菌是常見的腸道病原菌之一，在自然界分布廣泛、種類繁多，目前已檢測出沙門氏菌血清型2 500余種，據(jù)報道在我國存在的血清型有292種[1]。沙門氏菌所導(dǎo)致的疾病統(tǒng)稱沙門氏菌感染。沙門氏菌不僅能引起動物發(fā)生急性、慢性或隱性感染，而且還能通過污染食物導(dǎo)致人的食物中毒，引發(fā)敗血癥等，對人類健康造成很大的威脅。在世界各國的各類細菌性食物中毒事件中，沙門氏菌引起的食物中毒常居榜首。2000年，在科技部和衛(wèi)生部的支持下，中國疾病預(yù)防控制中心營養(yǎng)與食品安全所建立的全國食品污染物監(jiān)測體系對食品中的污染物進行了連續(xù)主動監(jiān)測，食源性致病菌的監(jiān)測指標選取沙門氏菌，這是因為在我國內(nèi)陸地區(qū)細菌性食物中毒的暴發(fā)例數(shù)和發(fā)病人數(shù)多年來排第1位就是沙門氏菌感染。沙門氏菌是公共衛(wèi)生意義上具有重要意義的人獸共患病原菌之一，最為常見的人獸共患的沙門氏菌有鼠傷寒沙門氏菌、腸炎沙門氏菌、都柏林沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌等。我國城鄉(xiāng)居民對雞蛋的消耗量占禽蛋消費量的85%以上，近十多年來年消耗量都超過2 000萬t[2]，如果蛋雞場存在沙門氏菌的污染，將直接影響到雞蛋的質(zhì)量，對人民健康存在巨大的威脅，因此加強蛋雞場的沙門氏菌監(jiān)測十分重要。筆者于2012年7月至2015年12月對廣東省部分地區(qū)蛋雞群進行沙門氏菌監(jiān)測，以期為沙門氏菌的凈化和預(yù)防提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1樣品采集 來自廣東省的不同雞場115批次樣品，采集時間為2012年7月至2015年12月底。用于檢測腸炎沙門氏菌抗體的雞血清樣品1 784個，用于檢測鼠傷寒沙門氏菌抗體的樣品1 387份，用于檢測雞白痢沙門氏菌抗體1 391份；供檢測沙門氏菌的樣品1 458份，包括1日齡～56周齡的活雞1 222只、死亡雞48只、雞場環(huán)境拭子16份、環(huán)境和雞糞混合樣品128份、墊紙44份。以上商品代雞場均為存欄量超過10萬只以上的雞場。樣品來源和數(shù)量等具體見表1。

1.2樣品處理對用于抗原檢測的活雞、死亡雞樣品無菌取內(nèi)臟及腸內(nèi)容物剪碎，加入滅菌的PBS充分研磨；將環(huán)境拭子直接置于滅菌的PBS中混勻；環(huán)境和雞糞混合樣品以及墊紙搗碎后與無菌PBS充分混合，過濾后取上清待用。

對上述PBS混合液進行增菌處理：取1 mL接種于10 mL四硫磺酸鈉煌綠增菌液(TTB)內(nèi)，于(42±1)℃培養(yǎng)18～24 h。同時，另取1 mL接種于10 mL亞硒酸鹽胱氨酸增菌液(SC)內(nèi)，于(36±1)℃培養(yǎng)18～24 h。

1.3試劑/試劑盒、引物和沙門氏菌陽性菌 腸炎沙門氏菌抗體(SE-Ab)和鼠傷寒沙門氏菌抗體(ST-Ab)試劑盒均為荷蘭Biochek公司產(chǎn)品(由北京天之泰生物科技有限公司提供)；雞白痢凝集抗原、陽性血清、陰性血清，均購自北京中海科技有限公司；沙門氏菌培養(yǎng)基TTB和SC、顯色培養(yǎng)基均為廣東環(huán)凱微生物科技有限公司產(chǎn)品。針對沙門氏菌侵襲蛋白 A(invasionprotein A，invA)基因，參考文獻[3]方法設(shè)計PCR引物，由上海英濰捷基生物有限公司合成。沙門氏菌陽性菌株，購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.4抗體水平檢測

1.4.1腸炎沙門氏菌抗體和鼠傷寒沙門氏菌抗體的ELISA檢測。 血清樣品按1∶100的比例進行稀釋，將100 μL稀釋后的樣品添加到相應(yīng)的酶標板孔內(nèi)，室溫孵育30 min，倒出孔內(nèi)容物，洗滌4次，最后1次倒轉(zhuǎn)反應(yīng)板，在吸水紙上輕輕拍打。然后，每孔添加100 μL酶標二抗，室溫孵育30 min，洗滌4次；每孔加入100 μL底物，室溫下孵育15 min；加入100 μL終止液，終止反應(yīng)，調(diào)零，使用酶標儀于405 nm波長處測定各孔吸光值。檢測時設(shè)置陽性和陰性對照，當陰性對照的平均吸光度小于0.3，陽性對照的平均吸光度大于等于0.3，二者之間的差值大于0.15，說明檢測結(jié)果可靠。S/P值=(待檢樣品的平均吸光度-陰性樣品的平均吸光度)/(陽性樣品的平均吸光度-陰性樣品的平均吸光度)。若S/P值≤0.499，說明樣品抗體為陰性；若S/P值≥0.500，說明樣品抗體值為陽性。

1.4.2雞白痢抗體檢測。采用平板凝集方法，用吸管吸取抗原50 μL，垂直滴加在潔凈玻璃板上，然后吸取50 μL雞血清,與抗原充分混合均勻，并使其散開至直徑為2 cm。不斷搖動玻璃板，計時判定結(jié)果，同時設(shè)置強陽性血清、弱陽性血清、陰性血清對照。

1.5抗原檢測取增菌液在沙門氏菌鑒別培養(yǎng)基上劃線，結(jié)合培養(yǎng)特性，取可疑菌落接種至LB液體培養(yǎng)基內(nèi)，提取DNA。以提取的DNA為模板，采用PCR方法[3]進行驗證試驗，擴增的目的片段為403 bp。

2　結(jié)果與分析

對采集的血清樣品進行腸炎沙門氏菌抗體、鼠傷寒沙門氏菌抗體、雞白痢抗體檢測，不同時期幾種抗體的陽性率不同(表1)。沙門氏菌在沙門氏菌鑒別培養(yǎng)基上呈現(xiàn)特征的紫紅色圓形菌落(圖1)，挑取疑似菌落進行PCR驗證，均出現(xiàn)目的條帶。沙門氏菌PCR鑒定的結(jié)果見圖2，沙門氏菌的分離情況及分離率見表1。

表1　不同來源樣品幾種沙門氏菌抗體和沙門氏菌的檢測結(jié)果

圖1　沙門氏菌在沙門氏菌鑒別培養(yǎng)基上的觀察結(jié)果Fig.1　Observation results of salmonella in differential mediums

注：M.DNA 標準DL2000；1～8.沙門氏菌鑒別培養(yǎng)基上疑似陽性樣品；9.陽性對照；10.陰性對照。Note：M.DNA marker DL2000; 1-8.Suspected samples in differential mediums; 9.Positive control; 10.Negative control.圖2　部分沙門氏菌陽性樣品的PCR驗證結(jié)果Fig.2　Results of PCR verification of salmonella positive samples

3　討論與結(jié)論

沙門氏菌是1885年由沙門氏等在霍亂流行時分離到豬霍亂沙門氏菌，因此定名為沙門氏菌屬。沙門氏菌的存在嚴重威脅著人民的身體健康和畜牧業(yè)的健康發(fā)展其在養(yǎng)殖場的存在也時有報道[4-9]，對養(yǎng)殖業(yè)的危害很大，另外由于獸藥的濫用，導(dǎo)致沙門氏菌耐藥性的增強[10-11]，給該病的防治帶來很大困難。實時跟蹤監(jiān)測對于有效防止沙門氏菌感染的擴散、為畜禽產(chǎn)品的安全提供有效保障。

該研究結(jié)果表明，廣東省部分地區(qū)蛋雞群中存在腸炎、鼠傷寒、雞白痢等幾種沙門氏菌的感染，但是雞群總體感染率不高。這可能與監(jiān)測樣品多數(shù)來自大型雞場有關(guān)，大型雞場管理相對完善、飼養(yǎng)條件相對較好使沙門氏菌的流行傳播受阻。相對而言，小型雞場及散養(yǎng)雞環(huán)境較差條件較簡陋，容易流行和爆發(fā)沙門氏菌[12]，因此對小型雞場沙門氏菌的監(jiān)測和防控將是今后工作的重點，建議相關(guān)部門和機構(gòu)加以重視。

2012年監(jiān)測結(jié)果表明，父母代的雞場環(huán)境中檢測到沙門氏菌，因此在2013年加大對雞場血清中3種沙門氏菌抗體的監(jiān)測力度，并且對雞群加強飼養(yǎng)管理、對雞場生物安全等方面加大防控力度，2015年已經(jīng)獲得改善。這充分說明了加強飼養(yǎng)管理和防控措施等對控制動物疫病的重要性。

該研究中檢出的沙門氏菌的24個陽性樣品，包括18個環(huán)境拭子和6個來自雛雞的肝臟和卵黃中的樣品。這與文獻[13-14]的報道相一致。筆者未對雞二蛋和蛋殼上的沙門氏菌進行監(jiān)測，但是蛋雞場沙門氏菌的存在必然導(dǎo)致雞蛋的污染機會增多，據(jù)報道雞蛋和雞蛋殼沙門氏菌的污染率不低[15]，人們在食用雞蛋時接觸蛋殼，很容易造成間接感染，因此建議雞蛋食用前進行清潔處理。雖然我國人民習(xí)慣吃熟食，但是隨著中西文化的交流，一些外來飲食習(xí)慣(如生食等)逐漸被國人接受，因此加強沙門氏菌的控制十分重要，應(yīng)切斷其傳播途徑，保障人類和動物健康。

[1] 彭海濱，吳德峰，孔繁德，等.我國沙門菌污染分布概況[J].中國國境衛(wèi)生檢疫雜志，2006，29(2)：125-128.

[2] 王靜怡，陳玨穎，劉合光.中國雞蛋消費現(xiàn)狀和影響因素分析[J].農(nóng)業(yè)展望，2015(1)：75-80.

[3] 楊保偉.食源性沙門氏菌特性及耐藥機制研究[D].楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2010.

[4] 蔣培紅.沙門氏菌的危害及其對畜產(chǎn)品污染的控制策略[J].中國動物檢疫，2007，24(10)：22.

[5] FOLEY S L，LYNNE A M，NAYAK R． Salmonella challenges：Prevalence in swine and poultry and potential pathogenicity of such isolates[J]．Journal of animal science，2008，86(14)：149-162.

[6] 王亮，張元鵬，張榮武，等.雞源性腸炎沙門氏菌的流行病學(xué)調(diào)查[J].中國人獸共患病學(xué)報，2011，27(5)：455-458.

[7] 呂殿紅，張毓金.櫻桃谷鴨感染豬霍亂沙門氏菌的分離鑒定[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2002，24(4)：283-285.

[8] 蔣清蓉，張德勝，賴守勛，等.四川地區(qū)蛋雞孵化場沙門氏菌調(diào)查[J].四川畜牧獸醫(yī)，2012(4)：20-21.

[9] 陳玲，張菊梅，楊小鵑，等.南方食品中沙門氏菌污染調(diào)查及分型[J].微生物學(xué)報，2013，53(12)：1326-1333.

[10] 黃凱，陳素娟，黃駿，等.動物源性沙門氏菌的耐藥性分析及氟苯尼考類耐藥基因的鑒定[J].中國畜牧獸醫(yī)，2015，42(2)：459-466.

[11] CHIU C H，WU T L，SU L H，et al.The emergence in Taiwan of fluoroquinolone resistance inSalmonellaentericaserotype Choleraesuis[J]．New England journal of medicine，2002，346(6)：413-419．

[12] 尹曉楠，陳晶，田祥宇，等.北京郊區(qū)散養(yǎng)雞及雞蛋沙門氏菌帶菌情況調(diào)查[J].中國動物檢疫，2013，23(10)：61-65.

[13] SANTOS D M，BERCHIERI J A，F(xiàn)ERNADES S A，et al.Salmonellaem em carcacas de frongo congeldas[J].Pesquisa veterinaria brasileira，2000，20(1)：39-42.

[14] KANASHIRO A M I，STOPPA G C，CARDOSO A，et al.Serovars ofSalmonellaspp isolated from broiler chickens and commercial breeders in diverse regions in Brazil from July 1997 to December 2004[J].Revista brasileira de ciencia avicola，2005，7(3)：195-198.

[15] 王晶鈺，董睿，王利勤，等.市售鮮雞蛋中沙門氏菌的分離鑒定及毒力島基因檢測[J].食品科學(xué)，2012(16)：154-158.

Monitoring of Salmonella in Laying Hens

LU Dian-hong, WEN Xiao-hui, ZHAI Shao-lun, WEI Wen-kang*et al

(Institute of Veterinary Medicine, Guangdong Academy of Agricultural Sciences/Guangdong Provincial Key Laboratory of Livestock Disease Prevention, Guangzhou, Guangdong 510640)

[Objective] To study infection of laying hens with salmonella. [Method] The antigen and antibody of salmonella in laying hens collected from Guangdong Province during 2012-2015 were detected. ELISA method and aggregation test were used to detect the antibody titer of serum samples aboutSalmonellaenteritidis,SalmonellatyphimuriumandSalmonellapullorum, and then germiculture and PCR were used to check out salmonella from chickens and environment swabs. [Result] Positive rates of three kinds of antibody were 16.70%, 10.09% and 1.01% respectively, while the positive rate of salmonella antigen was 1.65%. [Conclusion] The laying hens are infected with the three kinds of salmonella, but their infection rates were not high on the whole.

Salmonella; Infection; Antibody; Positive rate

廣東省促進科技服務(wù)業(yè)發(fā)展計劃項目(2012B040302010)；廣東省技術(shù)交易體系與科技服務(wù)網(wǎng)絡(luò)建設(shè)領(lǐng)域項目(2014B040404061，2016A040401012)；廣東省科技創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)人才服務(wù)領(lǐng)域項目(2014A070713020)。

呂殿紅(1969- )，女，安徽來安人，高級獸醫(yī)師，博士，從事預(yù)防獸醫(yī)學(xué)研究。*通訊作者，研究員，博士，碩士生導(dǎo)師，從事預(yù)防獸醫(yī)學(xué)研究。

2016-05-30

S 85

A

0517-6611(2016)19-163-03