白花前胡有效成分Pd-Ia對急性肺損傷的作用及機制研究

周曉霞,張建情,劉春曉,?！≠R,鄒　軍，薛茂強

(廈門大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)系，福建 廈門　361102)

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白花前胡有效成分Pd-Ia對急性肺損傷的作用及機制研究

周曉霞,張建情,劉春曉,常賀,鄒軍，薛茂強

(廈門大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)系，福建 廈門361102)

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2016.08.026

目的探討白花前胡甲素(dl-praeruptorin,Pd-Ia)對脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)誘導(dǎo)急性肺損傷的作用及其機制。方法氣管滴注LPS建立小鼠急性肺損傷模型，Pd-Ia腹腔注射進行干預(yù)治療，應(yīng)用組織細(xì)胞染色及定量PCR、ELISA等方法評估Pd-Ia對急性肺損傷的作用。結(jié)果病理形態(tài)學(xué)顯示，Pd-Ia治療組炎性細(xì)胞浸潤明顯減輕，細(xì)胞染色也顯示BALF中炎性細(xì)胞數(shù)量明顯減少，定量PCR及ELISA結(jié)果顯示，Pd-Ia治療組抑制了肺組織中細(xì)胞因子IL-6、TNF-α、IL-1β、趨化因子MIP-1α、MIP-2的表達。結(jié)論Pd-Ia治療可以明顯減輕肺部的炎癥反應(yīng)，從而改善肺損傷。

急性呼吸窘迫綜合征; 急性肺損傷;脂多糖; 白花前胡甲素;炎癥; 細(xì)胞因子

急性肺損傷(ALI)是由于肺內(nèi)外的多種因素如感染、創(chuàng)傷、休克及手術(shù)等引起的肺毛細(xì)血管炎癥損傷，通透性增加，并導(dǎo)致肺水腫和肺不張為病理特性的疾病，進一步發(fā)展可以形成急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)[1-2]。迄今為止，急性肺損傷的治療中仍無有效的臨床藥物，高發(fā)病率以及高死亡率一直是臨床研究的難點。

白花前胡是傘形科植物中藥前胡的一種，在臨床主要用于止咳平喘、緩解肺動脈高壓等[3]。白花前胡甲素(dl-praeruptorin,Pd-Ia)是白花前胡根中提取出來的吡喃香豆素成分，我們課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，Pd-Ia在內(nèi)皮細(xì)胞中能夠有效抑制脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)[4]。本研究采用LPS誘導(dǎo)建立小鼠急性肺損傷模型，探討Pd-Ia對小鼠急性肺損傷的作用[5-10]，為急性肺損傷的臨床研究與治療提供新的思路與途徑。

1　材料

1.1動物健康的SPF級♂ 129品系小鼠30只，6～8周齡，體質(zhì)量18～20 g, 購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，實驗動物許可證號為SCXK(京)2002-003，飼養(yǎng)于廈門大學(xué)實驗動物中心，符合倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.2藥品與試劑LPS 0111:B4(美國Sigma)，白花前胡甲素Pd-Ia(日本明治大學(xué)奧山轍教授惠贈)，TRIzol(美國 Invitrogen 公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(德國Fermentas公司)，SYBR Green PCR混液(日本TaKaRa公司),ELISA試劑盒(中國欣博盛生物科技有限公司)，PCR引物(大連寶生物工程公司合成)。

2　方法

2.1急性肺損傷模型制作經(jīng)過參考多種急性肺損傷模型制作方法[11-14]，以及結(jié)合本課題實際情況，模型具體制作方法如下：實驗動物隨機分為3組，每組10只，分別為：對照組、LPS組、LPS+Pd-Ia組，異氟烷麻醉小鼠后鼻腔滴注LPS(1 g·L-1)誘導(dǎo)急性肺損傷，40 μg·g-1，每只50 μL，體積用生理鹽水補足，對照組滴注50 μL生理鹽水。1 h后根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果，選取最佳劑量給予Pd-Ia 10 μg·g-1腹腔注射, 對照組注射同等體積生理鹽水，24 h后處死小鼠，采集標(biāo)本進行相關(guān)指標(biāo)檢測。

2.2小鼠血液采集滅菌彎鑷摘取小鼠眼球后靠近EP管，待血液緩慢滴下500 μL，室溫靜置30 min后，常溫3 000 r·min-1離心20 min, 收集血清用于ELISA檢測。

2.3肺泡灌洗液小鼠處死后，仰臥于操作臺上，暴露氣管，酒精棉球消毒，灌洗分為單側(cè)和雙側(cè)，若為單側(cè)灌洗則還需要解剖胸部，結(jié)扎一側(cè)氣管。滯留針緩慢插入頸部氣管1/3處，預(yù)冷生理鹽水灌洗每次0.5 mL，灌洗2次。生理鹽水注入后可停留1 min,之后緩慢回吸2～3次，使灌洗更為充分，回收率>90%。灌洗液轉(zhuǎn)入EP管后立即置于冰上，BALF 1 000 r·min-1、4℃離心10 min，將所得上清12 000 r·min-1再次離心30 min，收集上清-80℃保存用于ELISA檢測。第1次離心所得細(xì)胞沉淀重懸后制作細(xì)胞涂片，吉姆薩染色后顯微鏡下觀察，對BALF中細(xì)胞進行分類計數(shù)。

2.4病理形態(tài)學(xué)采集采集小鼠雙側(cè)肺葉后，取右肺中葉，放入40 g·L-1多聚甲醛磷酸鹽緩沖液中，固定48 h，組織脫水，石蠟包埋后切片，通過HE染色觀察肺組織病理學(xué)改變。

Tab 1　Primer sequence for Real time PCR

Fig 1　Effects of Pd-Ia on histopathological of lung tissue in different groups

A:Control;B:LPS;C:LPS+Pd-Ia

2.5肺組織中炎性因子檢測取左肺葉用DEPC水處理的剪刀剪碎后，取適量組織TRIzol法提取總RNA，取2 μg加1 μL primer-oligo(dT)，DEPC水補足12 μL, 65 ℃ 5 min預(yù)變性，結(jié)束后立即取出促冷，之后依次加入5×Reaction buffer 4 μL; RiboLock RNase Inhibitor 1 μL; 10 mmol·L-1dNTP Mix 2 μL; Revert Aid Reverse Transcriptase 1 μL,進行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA, 反應(yīng)條件為： 42 ℃ 60 min;70℃ 5 min;95 ℃ 5 min;4 ℃保存。

取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA，進行Real time PCR，20 μL反應(yīng)體系:cDNA 1 μL; SYBR Taq酶混合物10 μL; ROX 0.4 μL; Primer F 0.5 μL; Primer R 0.5 μL，滅菌水補足20 μL。反應(yīng)條件為95 ℃ 1 min預(yù)變性;95 ℃ 15 s變性; 60 ℃ 31 s退火，共40個循環(huán), 收集結(jié)果后，以GAPDH作為內(nèi)參，采用相對定量ΔΔCt法分析結(jié)果，檢測肺組織中炎性因子IL-6、TNF-α、IL-1β及趨化因子MIP-1α、MIP-2表達變化。引物由大連寶生物工程公司合成，具體序列見Tab 1。2.6血清及BALF中細(xì)胞因子檢測ELSIA試劑盒檢測血清及BALF中IL-6、TNF-α含量，按照ELISA說明書操作，測定OD值，計算各細(xì)胞因子含量變化。

3　結(jié)果

3.1肺組織病理學(xué)HE染色對照組肺泡結(jié)構(gòu)清晰，肺泡內(nèi)未見滲出物，無出血、炎性細(xì)胞浸潤及水腫，肺泡間隔未出現(xiàn)增厚現(xiàn)象； LPS誘導(dǎo)組可見肺泡結(jié)構(gòu)被嚴(yán)重破壞，出現(xiàn)大面積肺泡融合，并且可見大量的炎性細(xì)胞浸潤，肺泡間隔明顯增寬；與LPS誘導(dǎo)組相比，Pd-Ia組肺泡結(jié)構(gòu)恢復(fù)完整，炎性細(xì)胞浸潤明顯減少，肺泡壁未見明顯增厚(Fig 1)。

3.2BALF中細(xì)胞數(shù)目的變化LPS誘導(dǎo)肺部炎癥爆發(fā)后，肺泡中的細(xì)胞種類以及數(shù)量出現(xiàn)明顯改變，可見對照組的細(xì)胞數(shù)量較少，大部分為巨噬細(xì)胞，LPS組炎性細(xì)胞數(shù)量明顯增加，且大多為中性粒細(xì)胞，Pd-Ia治療后炎性細(xì)胞總數(shù)明顯減少，中性粒細(xì)胞及巨噬細(xì)胞數(shù)量也明顯減少(Fig 2)。

3.3肺組織中炎性因子的基因表達變化Real time PCR的結(jié)果顯示，LPS誘導(dǎo)后，肺組織中細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α以及趨化因子MIP-1α、MIP-2的表達明顯增高；而Pd-Ia治療組明顯降低了這些細(xì)胞因子的表達，提示Pd-Ia對小鼠肺部炎癥損傷有保護作用(Fig 3)。

3.4血漿及BALF中細(xì)胞因子的蛋白表達變化ELISA的結(jié)果顯示，LPS組誘導(dǎo)了血漿以及 BALF 中炎性因子IL-6、TNF-α的表達；Pd-Ia治療組降低了IL-6與TNF-α的表達，顯示了Pd-Ia可以有效抑制LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)(Fig 4)。

4　討論

ARDS在臨床中是急性呼吸衰竭的主要因素，它的主要特點是爆發(fā)性的肺部炎癥，ALI屬于ARDS的早期階段[1-2]。LPS是革蘭陰性菌細(xì)胞壁中的一種成分，是造成急性肺損傷的重要因素之一。LPS進入肺組織后可以誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，引起大量的免疫細(xì)胞聚集，分泌多種細(xì)胞因子，引起肺組織的損傷[15-16]。目前，急性肺損傷尚無有效的藥物治療方案，大多數(shù)研究都停留在體外以及動物實驗階段，因此尋找新的藥物治療肺損傷是當(dāng)前急需解決的問題之一[17-18]。

Fig 2　Effects of Pd-Ia on inflammatory cell changes in BALF

A:Effects of Pd-Ia on total cells in BALF; B: Effects of Pd-Ia on neutrophils cells in BALF; C: Effects of Pd-Ia on macrophages cells in BALF.**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsLPS

Fig 3Effects of Pd-Ia on mRNA expression of inflammatory cytokines in lung tissue

A:Effect of Pd-Ia on IL-6 mRNA expression;B: Effect of Pd-Ia on IL-1β mRNA expression;C:Effect of Pd-Ia on TNF-α mRNA expression; D:Effect of Pd-Ia on MIP-2 mRNA expression;E:Effect of Pd-Ia on MIP-1α mRNA expression.**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsLPS.

Fig 4　Effect of Pd-Ia on inflammatory cytokine changes in BALF and serum

A: Effect of Pd-Ia on IL-6 expression in BALF; B: Effect of Pd-Ia on TNF-α expression in BALF; C: Effect of Pd-Ia on IL-6 expression in serum; D: Effect of Pd-Ia on TNF-α expression in serum.*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05vsLPS

白花前胡是傘形科植物，可用于清肺止咳、散風(fēng)清熱、緩解肺動脈高壓等，在肺損傷的中醫(yī)藥治療中具有重要作用[19]。研究發(fā)現(xiàn)，在缺血/再灌注心肌損傷以及內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)中均發(fā)揮較好的抗炎作用[4,20]。目前，Pd-Ia在急性肺損傷中的相關(guān)研究較少，作用尚不清楚。本研究通過LPS誘導(dǎo)小鼠急性肺損傷模型，探討Pd-Ia對急性肺損傷的作用及其機制。

急性肺損傷的發(fā)病機制涉及到多種炎性細(xì)胞以及炎性反應(yīng)介質(zhì)的釋放與調(diào)節(jié)[15-16]。肺部或者外周血中以及其他組織中的中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的活化是炎癥反應(yīng)的起始[21-23]，活化后引起TNF-α以及IL-1β的釋放，從而啟動炎癥的級聯(lián)反應(yīng)。這兩種細(xì)胞因子具有多種功能，活化后不僅可以刺激中性粒細(xì)胞及單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生多種趨化因子以及其他的炎性介質(zhì)，如IL-6、MIP-1α、MIP-2等，炎癥損傷部位血管內(nèi)皮細(xì)胞中黏附分子表達上調(diào)，可以使更多的中性粒細(xì)胞黏附聚集在損傷部位，從而加重?fù)p傷。因此在本研究中，我們檢測了在急性肺損傷模型中Pd-Ia對相關(guān)炎性因子表達的影響，結(jié)果顯示，Pd-Ia能夠明顯降低IL-6、MIP-2等炎性因子的表達，從而發(fā)揮對肺損傷的改善作用。

綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)Pd-Ia對于LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷具有一定的治療作用，其機制可能與抑制相關(guān)炎性因子的表達及分泌有關(guān)。本文對Pd-Ia在急性肺損傷中的作用只做了初步探討，進一步探究Pd-Ia對急性肺損傷的作用機制，對于急性肺損傷的臨床治療將具有深遠(yuǎn)意義。

(致謝:本研究在廈門大學(xué)醫(yī)學(xué)院成智樓102實驗室完成，感謝鄒軍副教授指導(dǎo)。)

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Protective effect of Pd-Ia on LPS-induced mouse acute lung injury and its mechanism

ZHOU Xiao-xia, ZHANG Jian-qing,LIU Chun-xiao, CHANG He,ZOU Jun,XUE Mao-qiang

(DeptofBasicMedicalCollege,XiamenUniversity,XiamenFujian361102,China)

AimTo explore the protective effects of dl-praeruptorin(Pd-Ia) against acute lung injury induced by lipopolysaccharide(LPS).MethodsAcute lung injury model was induced by intranasal instillation LPS, and Pd-Ia was administered by intraperitoneal injection after 1 h of LPS exposure. Lung tissue samples were collected after 24 h of LPS administration to investigate the role of Pd-Ia in acute lung injury.ResultsPathomorpholoy showed a marked improvement of inflammatory cell infiltration in Pd-Ia treated group, cellular staining also indicated a marked decrease of inflammatory cells in BALF, and quantitative PCR and ELISA revealed a significant inhibition of cytokine IL-6,TNF-α,IL-1β, and chemokine MIP-1α,MIP-2 expression. Pd-Ia attenuated LPS-induced histological severities and TNF-α, IL-6, IL-1β,MIP-1α and MIP-2 production. ConclusionPd-Ia can alleviate the lung injury by ameliorating inflammation in lung.

ARDS; ALI; LPS; Pd-Ia; inflammation; cytokines

2016-03-01，

2016-04-07

國家自然科學(xué)基金資助項目(No 81270294);福建省高校省級自然科學(xué)基金項目(No 2013J01357)

周曉霞(1990-)，女，碩士，研究方向：藥理學(xué)，E-mail:zxx9012@sina.cn;

鄒軍(1971-)，男，博士，副教授，研究方向：藥理學(xué)，通訊作者，E-mail:zoujun@xmu.edu.cn；

A

1001-1978(2016)08-1165-06

R-332；R284.1；R322.35；R392.12；R563.022；R563.053.1

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2016-7-19 10:43網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160719.1043.052.html

薛茂強(1964-)，男，博士，教授，研究方向：藥理學(xué)，通訊作者，E-mail:xmq8887@xmu.edu.cn