動(dòng)物肝纖維化模型建立研究進(jìn)展*

艾丁丁，羅偉生 ,蔣云霞

廣西中醫(yī)藥大學(xué)( 南寧530000)

慢性肝病是指發(fā)生在肝臟的病變過程，主要是指肝細(xì)胞的損傷和修復(fù)的循環(huán)過程，一般是指從肝炎到肝癌的過程，其中間環(huán)節(jié)為肝纖維化，而肝纖維化的核心機(jī)制在于肝星狀細(xì)胞(Hepatic stellate cell,HSC)的活化和凋亡[1],HSC的過量活化使得輔助生成膠原細(xì)胞和基底外細(xì)胞的物質(zhì)大量形成,從而加速了肝纖維化的進(jìn)程，使得肝纖維化向著肝硬化等不可逆的方向發(fā)展。而非酒精性肝病(Nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)是慢性肝病發(fā)病的重要影響因素[2]，其中發(fā)生炎癥性病變的脂肪組織稱為“毒脂”對(duì)發(fā)展至肝炎之后肝纖維化病理過程中肝細(xì)胞的損傷和修復(fù)大有影響。目前，制作肝纖維化模型可效仿肝硬化模型的分類方法，但需針對(duì)目前肝纖維化病變以非酒精性原因增多為主進(jìn)行針對(duì)性造模。近年來，許多學(xué)者主力制作標(biāo)準(zhǔn)的肝纖維化模型，多使用大鼠、小鼠或家兔，但本著動(dòng)物造模應(yīng)與人類的病變基本相似、肝纖維化分期過程明顯、造模的可重復(fù)性和簡便性等特點(diǎn)，故多使用大鼠進(jìn)行肝纖維化造模[3]。

1 化學(xué)性損傷肝纖維化模型

化學(xué)性肝纖維化是由能造成肝毒性的化學(xué)物質(zhì)所引起的肝細(xì)胞損傷和修復(fù)交替出現(xiàn)導(dǎo)致肝內(nèi)結(jié)締組織異常增生的直接結(jié)果。造模所使用的常用藥物試劑為四氯化碳(Carbon tetrachloride,CCl4)、二甲基亞硝胺(Dimethylnitrosamine,DMN)等物質(zhì)，這類物質(zhì)具有強(qiáng)烈的肝損害性，能夠在不同程度破壞肝臟細(xì)胞導(dǎo)致肝內(nèi)結(jié)締組織異常增生。

1.1 四氯化碳誘導(dǎo)肝纖維化動(dòng)物模型 四氯化碳(CCl4)是一種無色有機(jī)溶劑，對(duì)任何油脂具有極強(qiáng)的溶解性，尤其是動(dòng)物油脂，因此，在人體表現(xiàn)為強(qiáng)肝毒性。CCl4通過和3,5-二乙氧基羰基-1,4-二氫可誘導(dǎo)肝細(xì)胞中的micro RNA基因，可導(dǎo)致肝細(xì)胞的損傷和再修復(fù)，出現(xiàn)肝纖維化[4]。CCl4作用于肝星狀細(xì)胞(HSC)是肝纖維化發(fā)展的基礎(chǔ)，HSC激活和轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，肌成纖維細(xì)胞迅速增殖發(fā)展為肝纖維化[5]，而肌成纖維細(xì)胞短時(shí)間內(nèi)成倍堆積嚴(yán)重可致肝硬化甚至肝癌。此種病變的發(fā)展過程與人類慢性藥物性肝病的發(fā)展過程類似，因此，CCl4可用于探索藥物性肝纖維化的發(fā)病機(jī)理和評(píng)價(jià)抗肝纖維化藥物的臨床療效等實(shí)驗(yàn)研究。CCl4誘導(dǎo)肝纖維化主要是影響體內(nèi)的酶學(xué)變化和炎癥因子,從而改變了肝細(xì)胞損傷及再修復(fù)的過程[6]，且具有經(jīng)濟(jì)實(shí)惠、可靠性和可重復(fù)性較高等優(yōu)勢(shì)，成為了目前廣泛應(yīng)用的肝纖維化動(dòng)物造模方法的最佳體外試劑。但由于此單一造模方法成模率低，死亡率高[7]，所以現(xiàn)今多采用復(fù)合試劑或聯(lián)合方式造模。

1.2 二甲基亞硝胺誘導(dǎo)肝纖維化動(dòng)物模型 DMN是一種世界公認(rèn)的致癌有機(jī)化合物中間體成分，具有肝毒性、腎毒性和基因毒性等，其代謝后產(chǎn)物對(duì)肝臟細(xì)胞損傷較大，且易加速其纖維化速度，若不及時(shí)中止肝纖維化的過程，最終則形成肝細(xì)胞壞死致肝硬化。有Cheng等[8]研究人員用80%DMN(以生理鹽水稀釋)和SPF級(jí)大鼠，以0.5 ml/kg和2 ml/kg分為兩組模型組和一組空白對(duì)照組，每周進(jìn)行兩次腹腔注射造模，在適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后開始造模，注射至第四周模型初步形成，到實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)模型組總共存活27只，且無論高劑量組還是低劑量組肝臟重量均有增加。用上述方法制造的肝纖維化模型，肝組織主要出現(xiàn)肝門脈竇性狹窄、肝門周圍血管擴(kuò)張、肝假小葉形成和肝細(xì)胞炎癥癥狀等，還有部分可見明顯的膠原纖維增生，最終形成肝纖維化，甚至嚴(yán)重者可出現(xiàn)肝硬化。DMN誘導(dǎo)的肝纖維化動(dòng)物模型，其致肝纖維化的機(jī)制一般為炎癥反應(yīng)和膠原蛋白的增生和沉積，近年還發(fā)現(xiàn)與脂肪代謝的異常相關(guān)[9]，而脂肪代謝異常還是非酒精性脂肪性肝病和非酒精性脂肪性肝炎的重要發(fā)生機(jī)制，故DMN也常用于肝炎和肝硬化的動(dòng)物造模。但是DMN具有較強(qiáng)的肝毒性，且為日常重要的致癌物質(zhì)之一，因此近年被國家明令列為管制藥物，即便是用于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物造模也需獲得批準(zhǔn)才能申購，因此，DMN近年來由于管制限制和毒性難以把握，才逐漸退出了一線肝病造模用藥行列。

2 酒精性肝纖維化動(dòng)物模型

酒精性肝病(ALD)是指主要是受酒精損害較大使肝臟細(xì)胞出現(xiàn)脂肪的堆積、纖維化形成并逐步向肝硬化發(fā)展，如若在肝硬化之前不及時(shí)逆轉(zhuǎn)，則最終導(dǎo)致肝細(xì)胞不可逆死亡，還可發(fā)展為肝癌。因此，利用已知的肝病臨床癥狀，在與人體有相似機(jī)制的動(dòng)物身上建模，研究其發(fā)病機(jī)制和病因，對(duì)現(xiàn)代肝病的分型和治療具有極大的意義?，F(xiàn)代實(shí)驗(yàn)研究，以急性酒精性肝纖維化動(dòng)物造模和慢性酒精性肝纖維化動(dòng)物造模，均多以小鼠造模為主，并且以急性酒精灌胃法造模較優(yōu)[10]，此種造模方法能在短時(shí)間內(nèi)使肝內(nèi)細(xì)胞出現(xiàn)炎癥反應(yīng)，引起肝血清酶ALT和AST的輕度升高，從而出現(xiàn)肝纖維化的病變，從而，也能有效的把動(dòng)物模型控制在肝病可逆性強(qiáng)的肝纖維化的階段。而慢性酒精性肝纖維化小鼠造模因違反了動(dòng)物天生厭惡酒精的天性，所以成模率低。也有研究表明，ALD動(dòng)物模型主要只涉及輕度肝損傷(即脂肪變性和輕中度炎癥)而人類嚴(yán)重的酒精性肝炎往往發(fā)生在肝硬化環(huán)境中，甚至更嚴(yán)重者可發(fā)展至肝衰竭而導(dǎo)致死亡[11],因此，在現(xiàn)實(shí)中的酒精性肝纖維化動(dòng)物造模，往往需要運(yùn)用大鼠在慢性酒精性肝纖維化的基礎(chǔ)上，造成急性酒精性肝損傷，從而模擬現(xiàn)實(shí)人類復(fù)雜的肝病發(fā)生環(huán)境進(jìn)行同等條件下模擬造模，但由于其操作程序的復(fù)雜性，造模成功率也較低，此方法也難于在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境下應(yīng)用。

3 非酒精性肝病(NAFLD)

是指排除酒精和另外確切的肝臟損害病因所形成的肝臟細(xì)胞的損傷，其病理特點(diǎn)為肝內(nèi)脂肪的大量堆積，從而導(dǎo)致肌纖維的過度增殖加劇肝纖維化的形成。近年來，學(xué)界認(rèn)為NAFLD出現(xiàn)的肝細(xì)胞內(nèi)脂肪過度沉積的現(xiàn)象還與胰島素抵抗相關(guān)[12]；也有研究表明，我國成人患NAFLD的患病率在某些地區(qū)有逐年增加的趨勢(shì)[13]，并且極易遷延他病。其主要的致病因素有胰島素抵抗、“二次打擊”學(xué)說[14]、免疫功能紊亂、慢性發(fā)展的炎癥性損傷、肝臟Kupffer細(xì)胞介導(dǎo)的促炎癥及加速脂質(zhì)沉積作用等。因此，有必要建造真實(shí)、可靠的非酒精性脂肪性肝纖維化動(dòng)物模型，對(duì)此疾病的機(jī)制和病理過程進(jìn)行研究。

3.1 血吸蟲肝纖維化動(dòng)物模型 血吸蟲病是一種危害人體健康并且能引起肝細(xì)胞的損傷的人獸共患疾病[15]，血吸蟲卵在體內(nèi)能不斷的刺激機(jī)體的免疫細(xì)胞并促使大量肝星狀細(xì)胞(HSC)聚積，形成以蟲卵為中心的炎性肉芽腫，其肉芽腫外周包裹著由肌成纖維細(xì)胞和膠原纖維異常增生的纖維，最終形成肝纖維化。但是，血吸蟲卵內(nèi)分泌物刺激HSC具有兩面性，能同時(shí)激活HSC啟動(dòng)肝纖維化程序，也能誘導(dǎo)HSC凋亡從而抑制肝纖維化[16]。因此，研究制作血吸蟲肝纖維化動(dòng)物模型其重點(diǎn)在于認(rèn)清血吸蟲卵內(nèi)如何啟動(dòng)和抑制HSC細(xì)胞的機(jī)制?？讘c明等[17]運(yùn)用小鼠經(jīng)腹部剃毛貼片感染血吸蟲尾蚴建立肝纖維化動(dòng)物模型，16周后應(yīng)用HE染色和馬森染色評(píng)估肝臟纖維化程度證明造模成功，肝臟中蟲卵附著的肉芽腫較大。也有實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，通過對(duì)脾臟質(zhì)量指數(shù)的評(píng)估比肝臟質(zhì)量指數(shù)更能反應(yīng)肝纖維化的程度。但是此方法造模周期長，且血吸蟲為人獸共患感染物，對(duì)實(shí)驗(yàn)人員及實(shí)驗(yàn)室操作要求較高。目前，對(duì)血吸蟲性肝纖維化的造模最佳動(dòng)物為小鼠，但如果采用年齡較小的小鼠容易造成在造模前期就出現(xiàn)批量死亡，從而影響實(shí)驗(yàn)成模率，因此，此造模方式僅用于實(shí)驗(yàn)室研究抗血吸蟲藥物的開發(fā)和血吸蟲影響肝纖維化機(jī)制的小范圍實(shí)驗(yàn)。

3.2 高脂類肝纖維化動(dòng)物模型 高脂類肝纖維化是指主要由于營養(yǎng)失調(diào)性引起的非酒精性脂肪性肝病，患者由于飲食習(xí)慣和生活方式的改變而長期攝入過量的含脂肪類物質(zhì)，從而導(dǎo)致肝臟脂肪過度沉積改變肝臟內(nèi)肝細(xì)胞的構(gòu)造形成肝纖維化。由于現(xiàn)代人物質(zhì)生活越來越好，攝入過多的脂肪、糖類等物質(zhì)的機(jī)率逐漸增加，所以，建立高脂類肝纖維化動(dòng)物模型用于研究人類脂肪性肝病有著極為相通的病變基礎(chǔ)。高脂類肝纖維化動(dòng)物模型的建造一般采用雄性SPF級(jí)小鼠，體重在20 g左右為宜[18]，也可采用家兔造模。一為配方合成高脂飼料造模：配方常以飼料為基本營養(yǎng)來源所占比例約為80%，再加入10%～15%油類物質(zhì)如調(diào)和油、1.5%膽固醇和0.5%膽鹽及微量元素等，造模6周后取小鼠血清，檢驗(yàn)肝功能、甘油三酯和總膽固醇等指標(biāo)驗(yàn)證造模結(jié)果，若出現(xiàn)肝組織內(nèi)彌漫性分變脂肪滴分布全肝，可視為造模成功。二為配方元素缺乏高脂飼料造模：一般采用60%～80%的高脂膽堿缺乏飼料，先適應(yīng)性喂養(yǎng)，隨后分別在第4周、8周、16周隨機(jī)處死5只小鼠驗(yàn)證造模結(jié)果，一般于第6周開始出現(xiàn)肝纖維化[19]。此種造模方式簡單易行，可重復(fù)性強(qiáng)，其動(dòng)物模型與人體內(nèi)肝臟的內(nèi)環(huán)境病變及其相似，可有效的進(jìn)行高脂類肝纖維化肝病的病理機(jī)制和用藥研究。

4 復(fù)合型損傷肝纖維化模型

隨著社會(huì)生活水平的發(fā)展，現(xiàn)代人的生活具有一定的復(fù)雜性，從而導(dǎo)致肝病的因素復(fù)雜多變，甚至是多種復(fù)合性因素共同影響肝病的形成和發(fā)展，尤其是肝纖維化是肝病的轉(zhuǎn)歸發(fā)展的中心環(huán)節(jié)。因此，建立復(fù)合型損傷的肝纖維化動(dòng)物模型極具臨床必要性和符合肝病流行病學(xué)發(fā)展的需求。建立復(fù)合型肝纖維化模型采用乙醇灌胃、高脂飼料喂養(yǎng)、高糖飲水等復(fù)合因素，并結(jié)合腹腔注射CCl4的改良版聯(lián)合方法造模。采用標(biāo)準(zhǔn)SD級(jí)大鼠，體重在200 g左右，在適應(yīng)性喂養(yǎng)1周之后用此方法分組造模8周，在第4周和第8周分組隨機(jī)抓取5只大鼠取標(biāo)本進(jìn)行病理學(xué)、肝功能指標(biāo)檢測(cè)，第8周后模型組、對(duì)照組大鼠均形成肝纖維化。此種造模方法的優(yōu)點(diǎn)是可以在短時(shí)間內(nèi)建立可重復(fù)性高、穩(wěn)定性強(qiáng)的肝纖維化模型。同時(shí)，在一定程度上解決了單一因素的動(dòng)物模型與現(xiàn)代臨床患者病情有差距的問題，復(fù)合型肝纖維化動(dòng)物模型的成模率高，動(dòng)物在造模期間的病死率較低。

5 小結(jié)與展望

簡單來說，建立動(dòng)物模型的對(duì)研究人類疾病有著很好的幫助，能使我更好的研究肝纖維化的機(jī)制和進(jìn)行新藥抗纖維化的開發(fā)研究。但是，由于動(dòng)物本身和人體系統(tǒng)還是具有一定的生物學(xué)，導(dǎo)致動(dòng)物模型也不能完全代替人體用來進(jìn)行更精確的病程研究。近來，有數(shù)據(jù)表明，人體機(jī)體的老化也會(huì)影響慢性肝病，特別是對(duì)慢性肝病晚期的血液循環(huán)和肝纖維化產(chǎn)生影響[20]。然而，我們目前較為成熟和廣泛應(yīng)用的肝纖維化動(dòng)物模型絕大部分是使用成年的或幼年的小鼠、大鼠或家兔進(jìn)行基礎(chǔ)建模，此種方法下建立的肝纖維化模型是否能有效研究老年化肝纖維化病變的發(fā)展仍未可知。

綜上所述，目前仍然沒有一種肝纖維化模型能夠完整體現(xiàn)人類肝纖維化的病程發(fā)展特點(diǎn)。然而，動(dòng)物模型能夠幫助我們研究疾病的病因和病理特性，提出新的病因假說和治療方法。隨著現(xiàn)代對(duì)建模方式的不斷改良，有望建立客觀、可控性強(qiáng)和可重復(fù)性高的肝纖維化動(dòng)物模型，能更好的研究肝纖維化的發(fā)病機(jī)制，尋求更好的逆轉(zhuǎn)纖維化進(jìn)程的藥物，從而及時(shí)截?cái)喔卫w維化向肝硬化甚至慢性肝病的終末病程發(fā)展的大趨勢(shì)。