睪丸精子冷凍復(fù)蘇對ICSI助孕結(jié)局的影響

史海躍，陳慧，王華，江偉杰，胡巨偉

(寧波市婦女兒童醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，寧波　315012)

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·臨床實踐·

睪丸精子冷凍復(fù)蘇對ICSI助孕結(jié)局的影響

史海躍*，陳慧，王華，江偉杰，胡巨偉

(寧波市婦女兒童醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，寧波315012)

目的探討睪丸精子冷凍復(fù)蘇對ICSI助孕結(jié)局的影響。方法回顧性分析2010年1月至2014年9月因梗阻性無精子癥在本院采用睪丸精子行ICSI助孕的214個周期的臨床資料，其中107個周期采用冷凍復(fù)蘇的睪丸精子(凍精復(fù)蘇組)，另外107個周期采用新鮮睪丸精子(新鮮精子組)。比較兩組中女方的一般資料、受精率、卵裂率、可利用胚胎數(shù)、優(yōu)質(zhì)胚胎率，以及臨床妊娠率。結(jié)果本研究中，107個周期凍存睪丸精子復(fù)蘇均獲成功；凍精復(fù)蘇組與新鮮精子組行ICSI助孕后的受精率[(76.91±18.24)% vs. (75.35±20.62)%]、卵裂率[(94.69±5.29)% vs. (95.37±4.48)%]、可利用胚胎數(shù)[(4.67±2.52) vs. (4.20±2.75)個]、優(yōu)質(zhì)胚胎率[(64.47±26.08)% vs. (60.34±27.39)%]及臨床妊娠率(52.24% vs. 50.63%)比較均無顯著性差異(P>0.05)。結(jié)論睪丸精子冷凍復(fù)蘇對ICSI助孕結(jié)局并無顯著影響。

睪丸精子；冷凍復(fù)蘇；卵胞漿內(nèi)單精子注射；妊娠結(jié)局

梗阻性無精子癥是由于輸精管道的梗阻使精子的運輸發(fā)生障礙而產(chǎn)生的無精子癥，在男性不育中的發(fā)生率約為1%。既往，這部分男性的生育需求基本不可能實現(xiàn)。直到1993年，Craft 等[1]帶來了福音，首次利用睪丸精子行卵胞漿內(nèi)單精子注射(ICSI)助孕獲得了成功。3年后Hovatta等[2]和Gil-Salom[3]等更是將無精子癥的助孕治療向前推動了一大步，分別報道了用凍融睪丸精子行ICSI助孕獲得成功妊娠。但是，睪丸精子經(jīng)冷凍復(fù)蘇處理后是否會影響ICSI的助孕結(jié)局尚存在爭議。現(xiàn)將本中心近幾年睪丸精子冷凍復(fù)蘇后行ICSI的助孕結(jié)局總結(jié)分析如下。

一、資料與方法

1. 研究對象及分組：選取2010年1月至2014年9月在我院生殖中心因男方梗阻性無精子癥行ICSI助孕者，共214個周期，其中采用冷凍復(fù)蘇睪丸精子行ICSI助孕107個周期(凍精復(fù)蘇組)，采用新鮮睪丸精子行ICSI助孕107個周期(新鮮精子組)。

納入標(biāo)準(zhǔn)：第1周期行ICSI治療、長方案超排卵、夫婦雙方染色體核型分析均正常者。排除標(biāo)準(zhǔn)：女方子宮內(nèi)膜異位癥、子宮肌瘤、子宮畸形、卵巢功能衰竭等。

梗阻性無精子癥確診依據(jù)：至少3次射出精液離心沉淀后未見精子，診斷性睪丸活檢可見成熟精子。

2. 睪丸穿刺取精：常規(guī)消毒鋪巾，利多卡因局部麻醉，用帶側(cè)孔的睪丸穿刺針經(jīng)皮睪丸穿刺，稍拔出針芯，擠壓睪丸，再插入針芯，然后連穿刺針一起拔出，從穿刺針側(cè)孔挑出睪丸組織，置于含10%人血清白蛋白(SSS，Irvine，美國)的人輸卵管培養(yǎng)液(HTF，Irvine，美國)中，用2只1 ml注射器針頭劃破曲細(xì)精管，倒置顯微鏡下觀察，吹打混勻后直接離心處理。

3. 精子冷凍：精子冷凍保護(hù)劑(Quinn’s，美國)置室溫平衡30 min；將經(jīng)處理后含有精子的懸液與精子冷凍保護(hù)劑以1∶1比例混勻，移入精子保存管進(jìn)行分裝，室溫平衡10 min；懸吊于液氮罐內(nèi)距液氮面5 cm，10 min后將精子保存管放入液氮長期保存。

4. 精子復(fù)蘇：從液氮中取出保存精液的冷凍管，在室溫中放置30 min；加入等量含10% SSS的HTF培養(yǎng)液，混勻后進(jìn)行洗滌離心；最后在沉淀物中加入含10% SSS的HTF培養(yǎng)液混勻待用。

5. 卵母細(xì)胞獲取、ICSI及胚胎移植：超促排卵均采用黃體中期啟動的長方案，當(dāng)直徑≥20 mm的卵泡≥2個時，注射HCG 10 000 U，36 h后行陰道B超引導(dǎo)下穿刺取卵術(shù)。取卵后4～6 h 選取成熟卵母細(xì)胞(MII期)行ICSI操作。取卵后第3天選擇最優(yōu)的1～3枚胚胎移植。

6. 判斷指標(biāo)：正常受精：ICSI后16～17 h觀察受精情況，以雙原核為正常受精；卵裂率：ICSI后40～41 h觀察卵裂情況，并計算卵裂球比例；優(yōu)質(zhì)胚胎：以卵裂球大小均勻，細(xì)胞飽滿，碎片<5%的I級胚胎和碎片≤20%的Ⅱ級胚胎為優(yōu)質(zhì)胚胎；可利用胚胎：所有移植及冷凍的胚胎；臨床妊娠：移植后14 d查血β-HCG，確定是否生化妊娠，若為陽性，2周后B超檢查提示宮腔內(nèi)或?qū)m外見孕囊及胎心搏動者為臨床妊娠。

二、結(jié)果

1. 凍存睪丸精子的復(fù)蘇結(jié)果：107個周期凍存睪丸精子復(fù)蘇均獲成功，所有周期均找到了足夠數(shù)量的活動精子完成ICSI。其中96個周期在行ICSI過程中較為容易地找到了足夠數(shù)量的活動精子，找精時間為1～3 min/條；另11個周期因活動精子形態(tài)差或精子活力差(尾巴偶爾微微擺動)或活動精子數(shù)量少(顯微鏡下多個高倍視野見1～2條尾巴活動精子)而導(dǎo)致在行ICSI過程中找精困難，找精時間>3 min/條。

2. 兩組女方一般情況比較：凍精復(fù)蘇組與新鮮精子組比較，兩組女方年齡、不育年限、促排卵天數(shù)(Gn天數(shù))、促排卵藥物劑量(Gn總量)均無顯著性差異(P>0.05)(表1)。

3. 兩組胚胎發(fā)育情況及妊娠結(jié)局比較：凍精復(fù)蘇組107個周期，其中取卵周期行胚胎移植67個周期，其余40個周期行全胚冷凍；新鮮精子組107個周期，取卵周期行胚胎移植79個周期，其余28個周期行全胚冷凍。兩組的受精率、卵裂率、可利用胚胎數(shù)、優(yōu)質(zhì)胚胎率、臨床妊娠率均無顯著性差異(P>0.05)(表2)。

表1　兩組女方一般情況比較 (x-±s)

表2　兩組的胚胎發(fā)育情況及妊娠結(jié)局比較 [(x-±s)，%]

三、討論

梗阻性無精子癥給男性患者的身心均帶來了極大的痛苦。近年來，這類患者能夠通過睪丸或附睪穿刺抽吸術(shù)獲得極少量睪丸或附睪精子，然后通過ICSI方式進(jìn)行助孕。但是這些精子數(shù)量有限且來之不易，前一次手術(shù)取精成功，下一次手術(shù)取精也存在失敗的風(fēng)險[4]。如果將這些患者試驗性睪丸穿刺或受精當(dāng)天剩余精子冷凍保存，可以有效避免下個周期因為精子缺乏無法進(jìn)行人工授精造成的卵母細(xì)胞浪費，為取卵當(dāng)日成功受精提供了一定的保障，同時還能減少反復(fù)穿刺取精給患者帶來的身體及精神上的壓力和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。

精子凍存的歷史最早可追溯至1776年，當(dāng)時就曾有專家嘗試將精子冷藏于雪中[5]。由于高流動性的細(xì)胞膜以及低含水量(大約50%)等自身特點，精子似乎對發(fā)生冷凍損傷不敏感。但是，由于凍存期間的冷休克、滲透壓改變、細(xì)胞內(nèi)冰晶形成及氧化應(yīng)激等原因[6-11]，冷凍保存會對精子的質(zhì)膜、頂體、DNA完整性及其動力、活力等產(chǎn)生影響[12-18]，這可能導(dǎo)致其冷凍復(fù)蘇后喪失了自身部分功能甚至是受孕能力。因此，有學(xué)者對使用凍存精子行ICSI助孕存在兩點疑慮：一是精子冷凍復(fù)蘇后活動率及存活率如何？二是復(fù)蘇精子行ICSI助孕后結(jié)局如何？本中心對試驗性睪丸穿刺后發(fā)現(xiàn)活動精子的患者行常規(guī)睪丸精子冷凍。經(jīng)驗顯示只要冷凍方案及技術(shù)成熟可靠，復(fù)蘇后基本能獲得足夠量的可利用精子。本研究復(fù)蘇凍存的睪丸精子107個周期均獲成功，所有周期均找到了足夠數(shù)量的活動精子完成ICSI操作。Levron等[19]也認(rèn)為只要取出的睪丸組織中精子數(shù)量足夠，精子冷凍就可行。

同時，本研究中凍精復(fù)蘇組與新鮮精子組的女方年齡、不育年限、促排卵天數(shù)(Gn天數(shù))、促排卵藥物劑量(Gn總量)比較均無顯著性差異，行ICSI助孕后受精率、卵裂率、可利用胚胎數(shù)、優(yōu)質(zhì)胚胎率，以及臨床妊娠率比較亦無顯著性差異(P均>0.05)。提示睪丸精子冷凍對ICSI助孕結(jié)局并無顯著影響，與之前的文獻(xiàn)[19-22]觀點一致。

綜上所述，本研究結(jié)果提示睪丸精子冷凍復(fù)蘇對ICSI助孕結(jié)局并無顯著影響，睪丸精子冷凍保存對于梗阻性無精子癥男性生育能力的保存具有積極意義。

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[編輯：郭永]

2015-12-26；

2016-03-01

史海躍，男，浙江寧海人，碩士，主治醫(yī)師，泌尿外科及男科專業(yè).(*

)

DOI：10.3969/j.issn.1004-3845.2016.08.012