微生物抗藥性進(jìn)化的分子生物學(xué)證據(jù)及進(jìn)化樹構(gòu)建方法

馬亢，劉海濱

（商丘師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，河南商丘476000）

微生物抗藥性進(jìn)化的分子生物學(xué)證據(jù)及進(jìn)化樹構(gòu)建方法

馬亢，劉海濱

（商丘師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，河南商丘476000）

摘要：微生物的抗藥性一直是困擾人類的重大問題，尤其是最近超級細(xì)菌的出現(xiàn)更是為人類敲響了警鐘——對微生物的抗藥性研究已經(jīng)刻不容緩。本論述梳理了近年來微生物進(jìn)化方面的分子生物學(xué)證據(jù)，并介紹了兩種最常用建立進(jìn)化樹的生物信息學(xué)方法，從而更加直觀地找出他們的進(jìn)化關(guān)系。

關(guān)鍵詞：微生物；抗藥性；進(jìn)化；進(jìn)化樹

DOI10.3969/j.issn.1672-6375.2016.03.024

我們通過對微生物抗藥性進(jìn)化的研究來減緩其進(jìn)化速度和找到其進(jìn)化的規(guī)律性，以便更好地篩選相關(guān)藥物，為人們的生活和生產(chǎn)活動服務(wù)。近年來，分子生物學(xué)迅速發(fā)展，使我們在分子水平能夠找到微生物進(jìn)化的過程以及他們之間的進(jìn)化關(guān)系，借助一些生物學(xué)專業(yè)軟件我們可以繪制出進(jìn)化樹，從而更加直觀的找出他們的進(jìn)化關(guān)系。找出微生物抗藥性的進(jìn)化規(guī)律是防止微生物進(jìn)一步在抗藥性上進(jìn)化的有利武器。

1　微生物抗藥性進(jìn)化的分子生物學(xué)證據(jù)

1.116S rRNA構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹

16S rRNA是原核核糖體30S小亞基的組成部分，存在于所有細(xì)菌的基因組中［1］。其可以作為測量各類生物進(jìn)化的工具的原因有以下幾點(diǎn)：（1）rRNA是生物存活不可缺少的，普遍存在于真核和原核生物中，在生物進(jìn)化歷程中其穩(wěn)定性比較高；（2）在16S rRNA分子中，有穩(wěn)定度不同的序列區(qū)域，適用于測量進(jìn)化距離不同的各類生物親緣關(guān)系；（3）相對分子質(zhì)量適宜序列分析。

1.2微生物抗藥性的分子機(jī)制

1.2.1鈣調(diào)磷酸酶機(jī)制

鈣調(diào)磷酸酶是真核細(xì)胞信號傳導(dǎo)途徑中的關(guān)鍵調(diào)控因子，對于菌株應(yīng)對環(huán)境壓力（抗生素作用）是必不可少的。細(xì)胞內(nèi)有一種幫助其他蛋白質(zhì)折疊并運(yùn)送它們到達(dá)細(xì)胞內(nèi)適當(dāng)?shù)奈恢玫姆肿印肿影閭H熱激蛋白90（heat shock protein 90，HSP90）。鈣調(diào)磷酸酶發(fā)揮正常功能必須借助HSP90對其亞基進(jìn)行正確折疊。HSP90的轉(zhuǎn)錄出現(xiàn)變異將導(dǎo)致細(xì)菌出現(xiàn)抗藥性［2］。PKA可以將轉(zhuǎn)錄因子CRZ1磷酸化，使其無法進(jìn)入細(xì)胞核，造成轉(zhuǎn)錄異常。同時PKA出現(xiàn)異常，使相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄受阻形成抗藥性［3］。

1.2.2轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白機(jī)制

一些抗生素進(jìn)入細(xì)菌體內(nèi)必須借助轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的運(yùn)輸，才能發(fā)揮殺菌作用。一些運(yùn)輸?shù)鞍祝ㄈ鏏BC運(yùn)輸?shù)鞍祝┛梢詫⑺巹哪?nèi)層轉(zhuǎn)移至外層而排出細(xì)胞體外；另外一些運(yùn)輸?shù)鞍祝ㄈ鏑YP51蛋白）基因與藥物作用時易發(fā)生點(diǎn)突變，造成編碼蛋白與藥物親和力下降，使抗生素作用效果大大降低，導(dǎo)致抗藥性。

1.2.3rpsL基因機(jī)制

鏈霉素作用于核糖體30S小亞基，直接抑制蛋白質(zhì)的合成。其直接的位點(diǎn)為核糖體上的S12和16S RNA結(jié)構(gòu)域，染色體上編碼核糖體蛋白S12的高度保守的rpsL基因的單堿基突變，干擾了蛋白的生物合成，從而使病原細(xì)菌具有高水平抗性且能穩(wěn)定遺傳。一些研究對rpsL和16S rRNA基因序列進(jìn)行分析和正反互補(bǔ)驗(yàn)證檢測，證明了rpsL基因的第43位堿基突變造成抗藥性突變［4］。

抗性基因常與質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子關(guān)聯(lián)，鏈霉素的大量使用在一定程度上加劇了選擇的進(jìn)程，且自然界中本身存在的鏈霉素抗性基因庫，二者的共同作用造成了抗性基因的大量傳播。

基因重組是人類進(jìn)化的一種可能的方式，微生物能大量進(jìn)行基因重組，原核生物和真核生物中普遍存在的轉(zhuǎn)座作用是微生物發(fā)生抗藥性進(jìn)化的一種重要機(jī)制［5］。

2　微生物進(jìn)化樹的構(gòu)建

分析一個完整的進(jìn)化樹需要以下幾個步驟：（1）對目的多序列目標(biāo)進(jìn)行排列；（2）構(gòu)建一個進(jìn)化樹；（3）對進(jìn)化樹可信度進(jìn)行評估。

在系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建中應(yīng)用最為廣泛的是PHYLIP和MEGA兩款生物軟件，通過這兩種軟件的使用，我們可以得到較為清楚的生物進(jìn)化關(guān)系。

2.1利用PHYLIP3.65軟件構(gòu)建菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹［6］

具體過程見圖1所示：

圖1　PHYLIP3.65軟件構(gòu)建菌株系統(tǒng)發(fā)育樹過程圖

2.2利用MEGA3.1軟件構(gòu)建菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹［7］

具體過程見圖2所示：

圖2　MEGA3.1軟件構(gòu)建菌株系統(tǒng)發(fā)育樹過程圖

構(gòu)建樹的過程所耗時間和序列的數(shù)量和長短成正比。樹枝上的數(shù)字表示bootstrap驗(yàn)證中該樹枝可信度的百分比。

3　結(jié)束語

伴隨著抗生素的大規(guī)模不當(dāng)使用，微生物的抗藥性逐年增加，這給人們的健康成本帶來了極大的挑戰(zhàn)。人們不斷地篩選新的抗菌藥物，但要從根本上解決抗藥性的問題，我們必須了解微生物在抗藥性方面的進(jìn)化規(guī)律。微生物的抗藥性和人類的抗生素篩選行為，可以看成是微生物為了適應(yīng)人類制造的逆境（抗生素）而通過進(jìn)化、突變等多種方式適應(yīng)生存的結(jié)果，因此理順微生物的進(jìn)化模式，能夠幫助我們找到更好的抗生素篩選策略，并能夠從根本上研究解決微生物進(jìn)化過快的問題。我們可以用分子生物學(xué)、基因組學(xué)、生物信息學(xué)的方法來研究其進(jìn)化過程，找出規(guī)律，從而為進(jìn)一步篩選藥物以及合理使用藥物提供科學(xué)依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

［1］劉琳，劉洋，劉紅娟.基于16S rDNA的系統(tǒng)發(fā)育分析在微生物進(jìn)化關(guān)系中的應(yīng)用［J］.生物學(xué)通報，2008，43（11）.

［2］Seung Oe Lim，Sung Gyoo Park.Expression of heat shock proteins（HSP27，HSP60，HSP70，HSP90，GRP78，GRP94）in hepatitis B virus-related hepatocellular carcinomas and dysplastic nodules［J］.World Journal of Castroenerol 2002；11 （14）：2072-2079.

［3］馬寧，崔志峰.致病真菌抗藥性機(jī)制的研究進(jìn)展［J］.中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志，2010，24（5）.

［4］葉滔，馬志強(qiáng).植物病原真菌對甾醇生物合成抑制劑類（SBIs）殺菌劑的抗藥性研究進(jìn)展［J］.農(nóng)藥學(xué)學(xué)報，2012，14 （1）：1－16.

［5］Chiou CS，Jones AL.Molecular analysis of high-level streptomycin resistance in Erwinia amylovora［J］.Phytopathology，1995，85：324-328.

［6］張光明，吳廷瑞.微生物與人類進(jìn)化［J］.醫(yī)學(xué)與哲學(xué)，1999，20（7）：20-22.

［7］陶士珩.生物信息學(xué)（普通高等教育十一五規(guī)劃教材）［M］.北京：科學(xué)出版社，2007.

中圖分類號：Q939

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

收稿日期：2015-11-18

作者簡介：馬亢（1983-），男，回族，實(shí)驗(yàn)師，碩士，主要研究方向：生物化學(xué)與分子生物學(xué)。